CN109097361B - 启动子、其载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了启动子、其载体及其应用，其包括，启动子核心区序列，所述启动子核心区序列至少包含谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG的上游91bp～180bp区间序列。将本发明启动子与基因片段进行构建组成表达框，能够在原核生物中大量表达蛋白，特别是被诱导剂诱导后，蛋白表达活性显著高于传统Ptac的诱导表达活性，是一种超高效启动子。本发明启动子能够用于原核生物内源或外源蛋白的高效表达。

Description

启动子、其载体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及启动子、其载体及其应用。

背景技术

启动子是一段控制着基因转录起始的关键DNA序列，对基因的表达具有重要的调控作用。启动子主要控制基因的转录水平，有研究通过大量的分析证明在控制基因表达的各种序列区域中，启动子区域的影响力超过45％，因此，筛选高活性的启动子对基因表达的研究具有重要意义。

目前现有技术存在蛋白表达效率低，可用遗传工具少等问题，而开发可用于外源蛋白表达的高效启动子是解决这些问题的重要途径。近年来常用的诱导型启动子有tac启动子(Ptac)、阿拉伯糖启动子、麦芽糖诱导启动子、丙酸诱导启动子、温度敏感启动子等，但是这些启动子的表达活力很有限，且可选择的种类少。鉴于诱导型启动子在蛋白表达和代谢工程研究中的重要意义，非常有必要开发一种谷氨酸棒杆菌的高活力的诱导型启动子。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供启动子。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：启动子，其中：包括，启动子核心区序列，所述启动子核心区序列至少包含谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG的上游91bp～180bp区间序列。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述启动子至少包括启动子核心区序列，所述启动子核心区序列的3’端位于谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG的上游第91bp，5’端位于谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG的上游181bp～200bp中任一碱基。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述启动子的序列区间至少包括，3’端位于谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG的上游第91bp，5’端位于谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG的上游201bp～257bp中任一碱基。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述启动子的序列区间至少包括，3’端位于谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG的上游第91bp，5’端位于谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG的上游201bp～345bp中任一碱基。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：还包括5’UTR序列。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述5’UTR序列的长度为90bp。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述5’UTR序列为谷氨酸棒杆菌SEQID NO：6基因编码序列ATG上游1bp～90bp区间序列。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：还包括，源基因序列，所述源基因序列包括SEQ ID NO：6基因编码序列ATG以及ATG下游的碱基。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述源基因序列包括谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG以及ATG下游的59bp碱基。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：包括所述启动子序列的互补序列。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：包括源基因序列，所述源基因序列如SEQ ID NO：2所示。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述启动子能够被包括苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸、儿茶酚的任一种或几种诱导。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述苯甲醇的诱导浓度范围为1mM～50mM。

作为本发明所述的启动子的一种优选方案：所述苯甲醇的诱导浓度为10mM。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供载体。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：载体，其中：所述载体装载权利要求1～15任一所述的启动子。

作为本发明所述的载体的一种优选方案：所述载体包括蛋白表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供所述的启动子在蛋白表达中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述的启动子在蛋白表达中的应用。

作为本发明所述的启动子在蛋白表达中的应用的一种优选方案：所述启动子用于谷氨酸棒杆菌内源或外源蛋白的表达。

本发明的有益效果：将本发明启动子与基因片段进行构建组成表达框，能够在原核生物中大量表达蛋白，特别是被诱导剂诱导后，蛋白表达活性显著高于传统Ptac的诱导表达活性，是一种超高效启动子。本发明启动子能够用于原核生物内源或外源蛋白的高效表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为表达载体p19-0-ZDA的序列图谱。

图2为P_ZDA不同长度诱导活性对比；

1：空质粒对照；2：P_ZDA-98bp不加苯甲醇；3：P_ZDA-98bp加苯甲醇(终浓度10mM)；4：P_ZDA-180bp不加苯甲醇；5：P_ZDA-180bp加苯甲醇(终浓度10mM)；6：P_ZDA-200bp不加苯甲醇；7：P_ZDA-200bp加苯甲醇(终浓度10mM)；8：P_ZDA-257bp不加苯甲醇；9：P_ZDA-257bp加苯甲醇(终浓度10mM)；10：P_ZDA-308bp不加苯甲醇；11：P_ZDA-308bp加苯甲醇(终浓度10mM)；12：P_ZDA-345bp不加苯甲醇；13：P_ZDA-345bp加苯甲醇(终浓度10mM)；14：P_ZDA-355bp不加苯甲醇；15：P_ZDA-355bp加苯甲醇(终浓度10mM)；其中，P_ZDA后的长度(98bp、180bp、200bp、257bp、308bp、345bp、355bp)代表P_ZDA位于SEQ ID NO：6ATG上游序列的长度。

图3为P_ZDA在不同诱导剂下的表达活性对比；

1：P_ZDA不加诱导剂；2：P_ZDA加苯甲醇(终浓度10mM)；3：P_ZDA加苯甲醛(终浓度10mM)；4：P_ZDA加苯甲酸(终浓度10mM)；5：P_ZDA加儿茶酚(终浓度10mM)。

图4为P_ZDA在不同浓度苯甲醇诱导下表达活性对比及其活性与Ptac活性对比；

1：Ptac不加IPTG；2：Ptac加IPTG(终浓度100μM)；3：P_ZDA不加苯甲醇；4、5、6、7、8和9：P_ZDA加不同量的苯甲醇(终浓度依次为1mM、10mM、15mM、20mM、25mM和50mM)。

图5为重组谷氨酸棒杆菌表达绿色荧光蛋白的SDS-PAGE实验分析图；

泳道M：蛋白Marker26610；1：空白对照；2：Ptac不加IPTG；3：Ptac加IPTG(终浓度100μM)；4：P_ZDA不加苯甲醇；5、6、7、8、9和10：分别表示P_ZDA加不同量的苯甲醇(终浓度依次为1mM、10mM、15mM、20mM、25mM和50mM)。

图6为重组谷氨酸棒杆菌应用P_ZDA表达人胃内因素蛋白应用实例；

泳道M：蛋白Marker26610；1：空白对照；2：苯甲醇(终浓度10mM)诱导表达人胃内因子。

图7重组谷氨酸棒杆菌表达BNP的SDS-PAGE实验分析图；

M：蛋白Marker26610；1：Ptac不加IPTG 2：Ptac加IPTG(终浓度100μM)表达BNP；3：P_ZDA不诱导表达BNP；4：P_ZDA加苯甲醇(终浓度10mM)诱导表达BNP。

图8重组谷氨酸棒杆菌表达BNP的ELASA定量分析图；

1：Ptac不加IPTG；2：Ptac加IPTG(100μM)表达BNP；3：P_ZDA不诱导表达BNP；4：P_ZDA加苯甲醇(终浓度10mM)诱导表达BNP。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

载体p19-0的构建：

本发明采用的质粒骨架包括探测载体p19-0，该载体具有大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭能力，能够在两种菌中稳定存在；该探测载体多克隆位点两侧分别有两个终止子，一个T7终止子和一个rrnB终止子，可以避免载体自带启动子对该表达框的影响。

探测载体p19-0的构建方法如下：

将pXMJ19质粒上的干扰性Bsa I酶切位点GGTCTC突变为GGTCAC；

以pXMJ19为模版，p19-MUT-F、p19-MUT-R为引物扩增突变后的线性质粒，产物用Dpn I 37℃处理2h后直接转化到大肠杆菌DH5α，得到正确突变的质粒命名为p19-mut；

p19-MUT-F GATGGTAGTGTGGGGTCACCCCATGCGAGAGTAG

p19-MUT-R CTACTCTCGCATGGGGTGACCCCACACTACCATC

反应体系为10×Q5Buffer 5μL、dNTPs(2.5mmol/L)4μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、Q5DNA聚合酶(2U/μL)0.5μL、模板1μL，加水至50μL；

PCR扩增条件为：98℃3min；98℃15s；72℃3.25min，30个循环；72℃2min；

使用EcoRV和Hind III对质粒p19-mut进行双酶切，去掉质粒中的lac I和tac启动子片段；使用引物p19-0-F、p19-0-R将两片段中间的骨架部分用PCR克隆出来，并在下游引物中加入T7终止子，得到的质粒为p19-0；

p19-0-F ATCCTATCATGCCATACCGCG

p19-0-R

CCCAAGCTTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTA(下划线为酶切位点HindIII)。

本发明质粒骨架载体可以替换为其他现有技术载体。

启动子的克隆(本发明的启动子命名为P_ZDA)：

使用天根生化科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒，提取谷氨酸棒杆菌(以谷氨酸棒杆菌CGMCC1.15647为例)的基因组，用于启动子克隆模板；本发明使用的谷氨酸棒杆菌CGMCC1.15647，其拉丁文命名为C.glutamicumBZH001，于2013年受赠于张家港市华昌药业有限公司。

作为本发明其中一种实施方式：选取C.glutamicumBZH 001的基因SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游355bp至下游62bp序列区域设计启动子克隆引物355ZDA-F和ZDA-R(SEQID NO：6基因编码序列ATG起始于SEQ ID NO：6序列的第501bp碱基，SEQ ID NO：6基因编码序列为序列表SEQ ID NO：6的第501bp～第1355bp)，克隆启动子序列及其下游基因ATG后62bp序列(包含ATG)，并在下游引物ZDA-R的5’端依次引入15bp的RBS序列(AAAGGAGGACAACTA)和两个反向的Bsa I酶切位点以及一个BamHI酶切位点，且BamHI酶切位点与第二个BsaI酶切位点切口重合；

ZDA-F TTCGAAGCTTCTTTGAAGCGGTGTGTGAC(下划线为酶切位点HindIII)

ZDA-R

CCGGGGATCCGAGACCAAAAAATTTTTTGGTCTCACATTAGTTGTCCTCCTTTTCAGTTGCCTTGTTGCC(下划线酶切位点依次为BamHI、BsaI和BsaI)。

反应体系为10×Q5Buffer 5μL、dNTPs(2.5mmol/L)4μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、Q5DNA聚合酶(2U/μL)0.5μL、模板1μL，加水至50μL。

PCR扩增条件为：98℃3min；98℃15s；60℃15s；72℃15s，30个循环；72℃45s。

表达载体p19-0-ZDA的构建：

将前述通过PCR克隆的P_ZDA启动子片段和p19-0探测载体使用TAKALA公司的限制性核酸内切酶BamH I和Hind III分别双酶切，酶切后两片段使用TAKALA公司的T4DNA连接酶进行连接，得到表达载体p19-0-ZDA。该表达质粒含有启动子P_ZDA，并在紧接启动子下游插入两个反向的BsaI酶切位点，方便基因的无痕插入。表达载体p19-0-ZDA的序列如SEQ ID NO：4。

EGFP表达载体p19-0-ZDA-egfp的构建：

以EGFP为例，将EGFP作为报告基因用来测试本发明启动子的活性。

采用引物egfp-F和egfp-R对荧光蛋白EGFP的基因egfp进行克隆，并通过BsaI酶切位点克隆到表达载体p19-0-ZDA的启动子P_ZDA的下游得到EGFP表达载体p19-0-ZDA-egfp，进行荧光蛋白EGFP的表达。egfp的基因序列如SEQ ID NO：5所示。

egfp-F AAGGTCTCAAATGGTGAGCAAGGGCGA(下划线酶切位点为BsaI)

egfp-R AAGGTCTCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG(酶切位点BsaI)

反应体系为10×Q5Buffer 5μL、dNTPs(2.5mmol/L)4μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、Q5DNA聚合酶(2U/μL)0.5μL、模板1μL，加水至50μL。

PCR扩增条件为：98℃3min；98℃15s；60℃15s；72℃30s，30个循环；72℃1min15s。

本发明以EGFP作为其中一种“报告基因”用来测试本发明启动子的活性，EGFP也可以替换为其他内源基因、外源基因等目的基因。

启动子鉴定：

首先对本发明启动子P_ZDA进行5’race实验，确定该启动子的转录起始位点在SEQID NO：6基因ATG上游91bp处。方法为使用5’race试剂盒

RACE 5’/3’Kit(TaKaRa，中国)，严格按照说明书操作，确定该启动子的转录起始位点为SEQ ID NO：6ATG上游91bp处。初步判定启动子核心区在ATG上游91bp之前，5’UTR为ATG上游1-90bp。

然后，分别设计上游引物98ZDA-F(指启动子的5’端位于SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游98bp)、180ZDA-F(指启动子的5’端位于SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游180bp)、200ZDA-F(指启动子的5’端位于SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游200bp)、257ZDA-F(指启动子的5’端位于SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游257bp)、308ZDA-F(指启动子的5’端位于SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游308bp)和345ZDA-F(指启动子的5’端位于SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游345bp)对P_ZDA的5’端进行截短。

作为本发明其中一种实施方式，选取SEQ ID NO：6基因编码序列ATG下游62bp序列区域作为源基因，即本发明启动子3’端位于SEQ ID NO：6基因编码序列ATG及ATG下游59bp，源基因序列如SEQ ID NO：2所示。作为源基因，SEQ ID NO：6基因编码序列ATG及ATG下游59bp仅为本发明其中一种实施方法，本发明研究发现，源基因的片段程度可以进行调整，而仍然使本发明启动子具备诱导表达活性。

作为本发明其中一种实施方式，操作方法为分别用上述引物与引物egfp-R组合，以p19-0-ZDA-egfp质粒为模板进行PCR扩增(PCR体系和扩增程序同上)，将扩增得到的片段分别用HindIII和BamHI双酶切后连入探测载体p19-0构建相应的EGFP表达载体，将构建好的载体通过大肠杆菌DH5α克隆后分别电击转化谷氨酸棒杆菌，氯霉素抗性平板进行筛选，并通过菌落PCR验证，即可得到含有表达载体并能够表达荧光蛋白的重组谷氨酸棒杆菌；通过测量单位菌体OD₆₀₀的荧光强度可以反应荧光蛋白EGFP的表达量，间接测定启动子的强度。

98ZDA-F TTCGAAGCTTTGTTGTTATCGAGTTCAAC(下划线为酶切位点HindIII)

180ZDA-F TTCGAAGCTTAGAAATATTTATGCTTCTAAAG(下划线为酶切位点HindIII)

200ZDA-F TTCGAAGCTTTGCTTGAAGTGGGGTTA(下划线为酶切位点HindIII)

257ZDA-F TTCGAAGCTTCCTAGGGTTTGCTCG(下划线为酶切位点HindIII)

308ZDA-F TTCGAAGCTTGCGTATGACCAACAGTG(下划线为酶切位点HindIII)

345ZDA-F TTCGAAGCTTGTGTGTGACATTTGCGAG(下划线为酶切位点HindIII)

将含表达载体的重组谷氨酸棒杆菌接种到5mL含氯霉素浓度为10μg/L的LBB液体培养基，于30℃230rpm过夜培养制备种子液，分别测定各种子液的OD₆₀₀；将各种子液分别转接于新鲜的20mL/100mL(100mL三角瓶装有20mL的培养基)LB培养基，使初始OD₆₀₀均为0.2，30℃230rpm进行摇瓶培养，其中各个重组菌于培养2h后加入诱导剂；并于培养20h后，分别用紫外分光光度计和荧光分光光度计测菌体OD₆₀₀和菌体荧光强度，并计算得出各菌株的单位OD₆₀₀的荧光强度用于表达活性的比较。

不同长度的P_ZDA在苯甲醇(终浓度10mM)诱导下的表达活性，结果如图2；当启动子位于SEQ ID NO：6基因ATG上游序列的长度截短为345bp时启动子诱导表达活性与355bp长度对应的启动子诱导表达活性相当，因此说明本发明启动子可以包括所述SEQ ID NO：6基因ATG上游345bp的5’端更长的序列，也可以不包括。

本发明继续选择不同长度片段的启动子用以研究启动子的活性，继续截短启动子位于SEQ ID NO：6ATG上游序列的长度为308bp，启动子诱导表达活性虽然相较于345bp有所下降，但其启动子表达活性仍然明显高于现有技术的Ptac启动子(结合本发明图2、图5、图8可以看出，本发明257P_ZDA启动子在不经过诱导剂诱导表达的条件下，其启动子表达活性已经相当于甚至高于现有技术Ptac在诱导剂诱导表达状态下的表达活性)，当截短到200bp时，该启动子虽然不具有诱导表达活性，但仍具有良好的表达活性，当截短到180bp时，该启动子虽然不具有诱导表达活性，但仍具有良好的表达活性，以上实验表明P_ZDA的操纵子序列位于SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游201bp～345bp之间，核心区序列位于ATG上游200bp之后；当启动子位于SEQ ID NO：6ATG上游序列的长度截短到98bp时，该启动子诱导表达活性完全丧失，与空质粒对照单位OD600荧光强度相当。本发明P_ZDA启动子长度为SEQ ID NO：6ATG上游345bp时诱导表达活性最好，单位OD₆₀₀的荧光强度达到16272，选取该结构进行后续实验。

因此，作为本发明启动子的其中一种优选方案：

本发明启动子中，操纵子区序列为谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游201bp～345bp序列，其中，谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游345bp长度序列如SEQ ID NO：1所示；启动子核心区序列为谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游91bp～200bp序列；

5’UTR序列为谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG上游1bp～90bp序列；部分源基因序列包括SEQ ID NO：6基因编码序列ATG和ATG下游的59bp序列，如SEQ ID NO：2所示。优选地，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

启动子诱导活性鉴定：

分别使用苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸和儿茶酚作为诱导剂进行了P_ZDA诱导活性实验，实验结果如图3所示，可见苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸和儿茶酚对P_ZDA均有明显诱导活性，但相同浓度下(10mM)，苯甲醇的诱导效果最好，单位OD600的荧光强度达到16601。

以苯甲醇作为诱导剂，设置不同的浓度梯度比较P_ZDA活性的变化，对比结果如图4所示，345P_ZDA启动子在一个很宽的苯甲醇浓度范围(1mM～50mM)都有诱导活性，但在终浓度为10mM的LB培养基中表达活性最高，且远高于对照Ptac的表达活性，单位OD600的荧光强度达到16740。

同时对各菌株表达外源蛋白情况进行SDS-PAGE分析：取PBS洗三次的等量菌体，分别用等量的PBS重悬菌体，并加入等量的细玻璃珠，用高通量匀质器破菌提蛋白；将匀质液离心，取溶有蛋白的上清跑蛋白胶，蛋白胶上层为4％的浓缩胶，下层为12％的分离胶；结果如图5所示，可见各菌株表达EGFP(表观分子量约30kDa)的结果与单位OD600菌体荧光强度结果相一致。

Ptac是以上述RBS序列(AAAGGAGGACAACTA)、外源基因片段与质粒pXMJ19共同构建的阳性对照质粒，应用质粒pXMJ19自身Ptac启动子，这一经典的阳性对照代表了的谷氨酸棒杆菌高效表达重组蛋白的水平，其构建包括以下步骤：

克隆由RBS序列与egfp基因构成基因片段，egfp基因如SEQ ID NO：5所示，所需的引物为：SD-EGFP-F和SD-EGFP-R。所用的PCR反应体系和程序同上；

SD-EGFP-F CCCAAGCTTAAAGGAGGACAACTAATGGTGAGCAAGGGCG(酶切位点HindIII)

SD-EGFP-R CCCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG(酶切位点BamHI)

Hind III和BamHI双酶切；

T4DNA连接酶连接。

启动子强弱鉴定：

采用如上所说实验方案，使用引物GIF-F和GIF-R将人胃内因子蛋白(GIF，表观分子量约45kDa，GeneID：2694)作为表达基因进行表达，成功在菌体超声破碎沉淀中检测到大量蛋白表达，结果如图6所示。

GIF-F：AAGGTCTCAAATGGCCTGGTTTGCCCTG(下划线为酶切位点为BsaI)

GIF-R：AAGGTCTCGGATCCTTAATACTGGGTGAAATTGGCG(酶切位点为BsaI)；

采用如上所说实验方案，使用引物：NT-ProBNP-F和NT-ProBNP-R将表达基因替换为HIS-SUMO-N端脑钠肽前体(NT-proBNP，表观分子量约25kDa,GeneID：4879)进行表达，并将含有Ptac，受IPTG诱导表达外源基因的Ptac载体做对照，结果如图7、图8所示，SDS-PAGE分析结果与ELASA定量分析结果一致，成功在菌体超声破碎的上清中检测到大量蛋白表达，并且本申请启动子345P_ZDA在苯甲醇诱导下比IPTG诱导的Ptac表达活性更高，HIS-SUMO-N端脑钠肽前体的表达量达到440.43mg/L。

NT-ProBNP-F：AAGGTCTCAAATGGGTCATCATCACCACCACCAC(酶切位点为BsaI)

NT-ProBNP-R：AAGGTCTCGGATCCTTAGCGCGGGGCACGCAG(酶切位点为BsaI)；

结果证明，本发明的来源于谷氨酸棒杆菌的诱导型启动子345P_ZDA在苯甲醇诱导下比IPTG诱导的Ptac表达EGFP、HIS-SUMO-N端脑钠肽前体活性明显更高，结合本发明图2、图5、图8可以看出，本发明257P_ZDA启动子在不经过诱导剂诱导表达的条件下，其启动子表达活性已经相当于甚至高于现有技术Ptac在诱导剂诱导表达状态下的表达活性，本发明启动子在谷氨酸棒杆菌表达外源蛋白以及代谢工程改造中具有重要意义。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 启动子、其载体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 1

gtgtgtgaca tttgcgagca attccgcagt gtcggtggcg tatgaccaac agtgcccgaa 60

caatgaagtg aagcacatta ggggaattcc tagggtttgc tcgggggtag gtgttcgcat 120

gatgtaaatt gacaggctgt ttatgtgctt gaagtggggt tatggagaaa tatttatgct 180

tctaaaggtc cctttattgt ttttaaggtt tttgggatgt tgacggattc gatgattcgg 240

gccacagtgt tgttatcgag ttcaaccgat cacaaagatt ttttcgctag gcagtgatcc 300

gactcgcacc ccctacttca cccccaaagt ctctaggagt atgac 345

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 2

atgacttcag ctgaacagat cgttgatcca acagcccacg attcgggcaa caaggcaact 60

ga 62

<210> 3

<211> 407

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 3

gtgtgtgaca tttgcgagca attccgcagt gtcggtggcg tatgaccaac agtgcccgaa 60

caatgaagtg aagcacatta ggggaattcc tagggtttgc tcgggggtag gtgttcgcat 120

gatgtaaatt gacaggctgt ttatgtgctt gaagtggggt tatggagaaa tatttatgct 180

tctaaaggtc cctttattgt ttttaaggtt tttgggatgt tgacggattc gatgattcgg 240

gccacagtgt tgttatcgag ttcaaccgat cacaaagatt ttttcgctag gcagtgatcc 300

gactcgcacc ccctacttca cccccaaagt ctctaggagt atgacatgac ttcagctgaa 360

cagatcgttg atccaacagc ccacgattcg ggcaacaagg caactga 407

<210> 4

<211> 6158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgaag cttgtgtgtg 60

acatttgcga gcaattccgc agtgtcggtg gcgtatgacc aacagtgccc gaacaatgaa 120

gtgaagcaca ttaggggaat tcctagggtt tgctcggggg taggtgttcg catgatgtaa 180

attgacaggc tgtttatgtg cttgaagtgg ggttatggag aaatatttat gcttctaaag 240

gtccctttat tgtttttaag gtttttggga tgttgacgga ttcgatgatt cgggccacag 300

tgttgttatc gagttcaacc gatcacaaag attttttcgc taggcagtga tccgactcgc 360

accccctact tcacccccaa agtctctagg agtatgacat gacttcagct gaacagatcg 420

ttgatccaac agcccacgat tcgggcaaca aggcaactga aaaggaggac aactaatgtg 480

agaccaaaaa attttttggt ctcggatccc cgggtaccga gctcgaattc agcttggctg 540

ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg 600

tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc 660

gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtcacccc atgcgagagt 720

agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt 780

ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt 840

tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca 900

ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc 960

ttttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 1020

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 1080

cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 1140

aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 1200

aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 1260

tttgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 1320

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 1380

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 1440

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 1500

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 1560

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 1620

gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 1680

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 1740

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 1800

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 1860

aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 1920

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 1980

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 2040

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 2100

atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttgg ggtgggcgaa gaactccagc 2160

atgagatccc cgcgctggag gatcatccag ccattcgggg tcgttcactg gttccccttt 2220

ctgatttctg gcatagaaga acccccgtga actgtgtggt tccgggggtt gctgattttt 2280

gcgagacttc tcgcgcaatt ccctagctta ggtgaaaaca ccatgaaaca ctagggaaac 2340

acccatgaaa cacccattag ggcagtaggg cggcttcttc gtctagggct tgcatttggg 2400

cggtgatctg gtctttagcg tgtgaaagtg tgtcgtaggt ggcgtgctca atgcactcga 2460

acgtcacgtc atttaccggg tcacggtggg caaagagaac tagtgggtta gacattgttt 2520

tcctcgttgt cggtggtggt gagcttttct agccgctcgg taaacgcggc gatcatgaac 2580

tcttggaggt tttcaccgtt ctgcatgcct gcgcgcttca tgtcctcacg tagtgccaaa 2640

ggaacgcgtg cggtgaccac gacgggctta gcctttgcct gcgcttctag tgcttcgatg 2700

gtggcttgtg cctgcgcttg ctgcgcctgt agtgcctgtt gagcttcttg tagttgctgt 2760

tctagctgtg ccttggttgc catgctttaa gactctagta gctttcctgc gatatgtcat 2820

gcgcatgcgt agcaaacatt gtcctgcaac tcattcatta tgtgcagtgc tcctgttact 2880

agtcgtacat actcatattt acctagtctg catgcagtgc atgcacatgc agtcatgtcg 2940

tgctaatgtg taaaacatgt acatgcagat tgctgggggt gcagggggcg gagccaccct 3000

gtccatgcgg ggtgtggggc ttgccccgcc ggtacagaca gtgagcaccg gggcacctag 3060

tcgcggatac cccccctagg tatcggacac gtaaccctcc catgtcgatg caaatcttta 3120

acattgagta cgggtaagct ggcacgcata gccaagctag gcggccacca aacaccacta 3180

aaaattaata gtccctagac aagacaaacc cccgtgcgag ctaccaactc atatgcacgg 3240

gggccacata acccgaaggg gtttcaattg acaaccatag cactagctaa gacaacgggc 3300

acaacacccg cacaaactcg cactgcgcaa ccccgcacaa catcgggtct aggtaacact 3360

gagtaacact gaaatagaag tgaacacctc taaggaaccg caggtcaatg agggttctaa 3420

ggtcactcgc gctagggcgt ggcgtaggca aaacgtcatg tacaagatca ccaatagtaa 3480

ggctctggcg gggtgccata ggtggcgcag ggacgaagct gttgcggtgt cctggtcgtc 3540

taacggtgct tcgcagtttg agggtctgca aaactctcac tctcgctggg ggtcacctct 3600

ggctgaattg gaagtcatgg gcgaacgccg cattgagctg gctattgcta ctaagaatca 3660

cttggcggcg ggtggcgcgc tcatgatgtt tgtgggcact gttcgacaca accgctcaca 3720

gtcatttgcg caggttgaag cgggtattaa gactgcgtac tcttcgatgg tgaaaacatc 3780

tcagtggaag aaagaacgtg cacggtacgg ggtggagcac acctatagtg actatgaggt 3840

cacagactct tgggcgaacg gttggcactt gcaccgcaac atgctgttgt tcttggatcg 3900

tccactgtct gacgatgaac tcaaggcgtt tgaggattcc atgttttccc gctggtctgc 3960

tggtgtggtt aaggccggta tggacgcgcc actgcgtgag cacggggtca aacttgatca 4020

ggtgtctacc tggggtggag acgctgcgaa aatggcaacc tacctcgcta agggcatgtc 4080

tcaggaactg actggctccg ctactaaaac cgcgtctaag gggtcgtaca cgccgtttca 4140

gatgttggat atgttggccg atcaaagcga cgccggcgag gatatggacg ctgttttggt 4200

ggctcggtgg cgtgagtatg aggttggttc taaaaacctg cgttcgtcct ggtcacgtgg 4260

ggctaagcgt gctttgggca ttgattacat agacgctgat gtacgtcgtg aaatggaaga 4320

agaactgtac aagctcgccg gtctggaagc accggaacgg gtcgaatcaa cccgcgttgc 4380

tgttgctttg gtgaagcccg atgattggaa actgattcag tctgatttcg cggttaggca 4440

gtacgttctc gattgcgtgg ataaggctaa ggacgtggcc gctgcgcaac gtgtcgctaa 4500

tgaggtgctg gcaagtctgg gtgtggattc caccccgtgc atgatcgtta tggatgatgt 4560

ggacttggac gcggttctgc ctactcatgg ggacgctact aagcgtgatc tgaatgcggc 4620

ggtgttcgcg ggtaatgagc agactattct tcgcacccac taaaagcggc ataaaccccg 4680

ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 4740

tgttgttggc gtcccggaaa acgattccga agcccaacct ttcatagaag gcggcggtgg 4800

aatcgaaatc tcgtgatggc aggttgggcg tcgcttggtc ggtcatttcg aagggcacca 4860

ataactgcct taaaaaaatt acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc 4920

attaagcatt ctgccgacat ggaagccatc acagacggca tgatgaacct gaatcgccag 4980

cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa 5040

gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc 5100

tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta 5160

acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact 5220

ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact 5280

atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacgg aactccggat gagcattcat 5340

caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt 5400

ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga 5460

ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc 5520

agtgattttt ttctccattt tagcttcctt agctcctgaa aatctcgtcg aagctcggcg 5580

gatttgtcct actcaagctg atccgacaaa atccacacat tatcccaggt gtccggatcg 5640

gtcaaatacg ctgccagctc atagaccgta tccaaagcat ccggggctga tccccggcgc 5700

cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct tcaccgcctg 5760

gccctgagag agttgcagca agcggtccac gtggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt 5820

ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact 5880

accgagatat cctatcatgc cataccgcga aaggttttgc accattcgat ggtgtcaacg 5940

taaatgccgc ttcgccttcg cgcgcgaatt gcaagctgat ccgggcttat cgactgcacg 6000

gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc 6060

gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt 6120

gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaa 6158

<210> 5

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 6

<211> 1358

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 6

acgattccct catcagggcg gtcctcaagc gcatggtcca gagttttctg aacgctttcc 60

aaatttgaaa ctggtgtgga catgtgaacc tccaagagag tgaaaagaag ttggttttgc 120

caccgcgatg tcgttttcgt ttttgctttg aagcggtgtg tgacatttgc gagcaattcc 180

gcagtgtcgg tggcgtatga ccaacagtgc ccgaacaatg aagtgaagca cattagggga 240

attcctaggg tttgctcggg ggtaggtgtt cgcatgatgt aaattgacag gctgtttatg 300

tgcttgaagt ggggttatgg agaaatattt atgcttctaa aggtcccttt attgttttta 360

aggtttttgg gatgttgacg gattcgatga ttcgggccac agtgttgtta tcgagttcaa 420

ccgatcacaa agattttttc gctaggcagt gatccgactc gcacccccta cttcaccccc 480

aaagtctcta ggagtatgac atgacttcag ctgaacagat cgttgatcca acagcccacg 540

attcgggcaa caaggcaact gacaagttca aggcaaaccg cgttgcctcc gatacctcca 600

aggaacgcgc aaacgcgatc tacgtagatc tgctcgcggc gatcgcccag gttgctcaca 660

agcatgaagt cacctacgaa gagtacgcag tgctcaagca gtggatgatc gacgttggag 720

aatacggcga gtgggccact gtggttggac gtttcgttga gcacgagatc gaagagatca 780

actacaaccg ccacgactac accggaacca agggttccat cgaaggccct tattacgtag 840

agaactctcc taagcttcct tgggatgctg agatgccaat gcgtgacaag gatcgcgcat 900

gcacccctct gatcttcgaa ggtcaggtta ctgacctcga cggcaacggt cttgatggag 960

cagaagttga gctctggcac gcagatgagg acggattcta ctcccagttc gcacctggaa 1020

tcccagagtg gaacctgcgt ggcaccatcg ttaccgatga ggaaggccgc tacaagatca 1080

agaccctgca gcctgcgcct taccagatcc ctcatgatgg cccaaccggt tggttcattg 1140

agtcttacgg tgggcaccca tggcgcccag cccacctcca cttgcgcgtt tcccacccgg 1200

gctaccgcac catcaccacc cagctttact tcgagggtgg cgagtgggtc gaaaacgacg 1260

ttgcaaccgc tgtgaagcca gaactggtcc tgcgccctga gactggcgag gatggtaacc 1320

acgttcacta cccattcgtc ctggataagg aagactag 1358

Claims (15)

1.启动子，其特征在于：所述启动子的序列区间包括，3’端位于谷氨酸棒杆菌SEQ IDNO：6基因编码序列ATG的上游第91bp，5’端位于谷氨酸棒杆菌SEQ ID NO：6基因编码序列ATG的上游257bp～355bp中任一碱基；所述SEQ ID NO：6基因编码序列ATG起始于SEQ IDNO：6序列的第501bp碱基。

2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于：还包括5’UTR序列。

3.如权利要求2所述的启动子，其特征在于：所述5’UTR序列的长度为90bp。

4.如权利要求2所述的启动子，其特征在于：所述5’UTR序列为谷氨酸棒杆菌SEQ IDNO：6基因编码序列ATG上游1bp～90bp区间序列。

5.如权利要求1～4中任一项所述的启动子，其特征在于：还包括，源基因序列，所述源基因序列包括SEQ ID NO：6基因编码序列ATG以及ATG下游的碱基。

6.如权利要求5所述的启动子，其特征在于：所述源基因序列包括谷氨酸棒杆菌SEQ IDNO：6基因编码序列ATG以及ATG下游的59bp碱基。

7.如权利要求1～4、6中任一项所述的启动子，其特征在于：包括源基因序列，所述源基因序列如SEQ ID NO：2所示。

8.如权利要求1～4、6中任一项所述的启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

9.如权利要求1～4、6中任一项所述的启动子，其特征在于：所述启动子能够被包括苯甲醇、苯甲醛、苯甲酸、儿茶酚中的任一种或几种诱导。

10.如权利要求9所述的启动子，其特征在于：所述苯甲醇的诱导浓度范围为1mM～50mM。

11.根据权利要求10所述的启动子，其特征在于：所述苯甲醇的诱导浓度为10mM。

12.载体，其特征在于：所述载体装载权利要求1～11中任一项所述的启动子。

13.如权利要求12所述的载体，其特征在于：所述载体包括蛋白表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4。

14.权利要求1 ～ 11 中任一项所述的启动子在蛋白表达中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于：所述启动子用于谷氨酸棒杆菌内源或外源蛋白的表达。

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