CN108676809A - 一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法 - Google Patents

一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法 Download PDF

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plasmid
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徐庆阳
张成林
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张德志
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谢希贤
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Abstract

本发明提供了一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，包括基因敲除和多拷贝整合两方面：1.在敲除一些影响生长的基因时，首先利用pk18mobsacB质粒进行第一轮同源重组，然后利用CRISPR/Cpf1对基因组的双链切割作为筛选压力，选择正确发生第二次同源重组的菌株，保证了获得正确敲除菌株的效率；2.在进行基因多拷贝整合时，通过特殊同源序列设计原理，使得第一轮同源重组时pk18mobsacB插入到基因组上Cpf1作用位点，破坏PAM结构而导致CRISPR/Cpf1不对基因组发生切割作用，保证目标基因的特异性整合，如果整合到已有拷贝的序列或其他位点时，crRNA能够识别设计的切割序列从而引导Cpf1进行双链切断，导致菌株无法存活。

Description

一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法。
背景技术
在微生物工业化生产中，希望得到尽可能高产量的产品。一种提高产量的方法是提高编码目的蛋白的基因的拷贝数量。这可以由将基因放于高拷贝数量质粒达到，但是如果在宿主细胞培养过程中没有选择性压力质粒是不稳定的且经常从宿主细胞中丢失。另一种提高目的基因拷贝数量的方法是将其以多拷贝整合入宿主基因组。同时，利用代谢工程构建生产菌株时，往往需要将一些副产物合成途径的基因敲除掉以加强目标产品合成的代谢流。总之，在基因组水平进行基因敲除和多拷贝关键基因的整合已经成为微生物分子育种的常规手段。
谷氨酸棒杆菌为为GRAS生物安全菌，在氨基酸发酵领域有着举足轻重的地位，至今已经被安全应用了近60年。目前，包括谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等大多数氨基酸都是利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产。近年来，随着基因工程手段引入谷氨酸棒杆菌菌种选育，构建出许多工程化谷氨酸棒杆菌菌株，其可利用的底物谱已得到极大的扩展，同时也可以生产出有机酸、醇类、二胺、萜类等化合物。目前，利用系统代谢工程构建谷氨酸棒杆菌高产菌株为工业微生物技术的核心领域之一。
然而，与大肠杆菌等模式菌种相比，谷氨酸棒杆菌为革兰氏阳性菌，基因编辑效率相对较低。现阶段常用的方法为非复制性质粒(如pk18mobsacB)介导的两次同源重组方法。最近，科学家们陆续报道了利用CRI SPR技术进行谷氨酸棒杆菌基因组编辑，然而，由于Cas9蛋白毒害性、谷氨酸棒杆菌同源重组效率低等问题，这些新技术直接用于基因组编辑还存在编辑效率低、重复性差等问题。但是，其双链切割对细胞致死效应是非常严谨的。另一方面，非复制性质粒介导的方法通过两次单独的同源重组，目标基因整合到基因组的几率大大提高，但是在多年应用过程中也发现一些问题，主要包括对一些影响生长的基因敲除效率极低(由于第二轮同源重组更倾向于回复打到出发状态)，和进行多拷贝整合时，会更加容易整合到已有基因的位点而导致难以获得特异性位点整合第一轮同源重组菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032敲除aroE进行构建，具体步骤如下：
(1)敲除质粒构建：
以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，△aroE-1，△aroE-2为引物，通过PCR反应扩增427bp的敲除aroE的上游同源臂；以△aroE-3，△aroE-4为引物，通过PCR反应扩增559bp的下游同源臂；以△aroE-1，△aroE-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成1545bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化后与重叠片段同源重组，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△aroE；
(2)切割质粒构建：
通过CHOPCHOP设计aroE切割序列，从而设计切割所需crRNA序列：首先将质粒pXMJ19中的氯霉素抗性基因换成奇霉素抗性基因；然后用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19，纯化后与cpf1同源重组；提取质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI酶切，纯化后与crRNA同源重组，最终得到aroE切割质粒pXMJ19Cmr∷sper-cpf1-crRNA-△aroE；
(3)敲除aroE目的菌株的获得：
将Corynebacterium glutamicum ATCC13032制成感受态细胞，将非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△aroE电转化到13032感受态细胞中，通过一次同源重组(即非复制型质粒上的△aroE上下游同源臂与基因组上相同序列进行同源重组)使非复制型质粒结合到谷氨酸棒杆菌基因组中，挑在卡那霉素抗性平板能正常生长的单菌落，以特异性鉴定引物△aroE-5，△aroE-6，△aroE-7，△aroE-8进行菌落PCR，条带大小正确的菌，接种于带有卡那霉素抗性的摇管里培养，得到13032△aroE单交换菌，将这个菌也制作成感受态，然后将切割质粒pXMJ19Cmr∷spercpf1crRNA-△aroE电转化到感受态细胞中，涂布于奇霉素抗性和链霉素抗性的平板，长出单菌落后以△aroE-1，△aroE-4为引物进行菌落PCR验证，条带正确的菌接摇管；经测序所得敲除菌株13032△aroE序列为序列表中序列23所示序列。
一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除upp保护单交换不被切割的菌株，具体步骤如下：
(1)敲除质粒构建：
以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，△upp-1，△upp-2为引物，通过PCR反应扩增429bp的敲除upp的上游同源臂；以△upp-3，△upp-4为引物，通过PCR反应扩增458bp的下游同源臂；设计△upp-3时，在引物序列上加了一个碱基构建成NcoI酶切位点；同时△upp-3引物必须从PAM结构TTTN的后两个TN开始设计，保证前两个TT在敲除部分；然后以△upp-1，△upp-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成887bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化后与重叠片段同源重组，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△upp；
(2)切割质粒构建：
通过CHOPCHOP设计upp切割序列，从而设计切割所需crRNA序列；用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19，纯化后与cpf1同源重组；提取质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI酶切，纯化后与crRNA同源重组，最终得到upp切割质粒pXMJ19-cpf1crRNA-△upp；
(3)敲除upp单交换目的菌株的获得：
将Corynebacterium glutamicum ATCC13032制成感受态细胞，将非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△upp和切割质粒pXMJ19-cpf1-crRNA-△upp电转化到13032感受态细胞中，涂布到氯霉素和卡那霉素平板上；通过一次同源重组(即非复制型质粒上的△upp上下游同源臂与基因组上相同序列进行同源重组)使非复制型质粒定向结合到谷氨酸棒杆菌基因组中；挑取单菌以uppjd-3，uppjd-4为引物进行菌落PCR验证。然后对正确条带的菌进行NcoI酶切验证；有NcoI酶切位点的菌即为目的菌株，该敲除upp单交换目的菌株具有序列表中序列24所示序列。
本发明结构有如下有益效果：
上述谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，包括基因敲除和多拷贝整合两方面：1.在敲除一些影响生长的基因时，首先利用pk18mobsacB质粒进行第一轮同源重组，然后利用CRISPR/Cpf1对基因组的双链切割作为筛选压力，选择正确发生第二次同源重组的菌株。由于回复到出发菌株和第一轮交换菌株均具有Cpf1作用的核苷酸序列，只有在第二轮重组时缺失敲除片段时，才避免Cpf1的切割致死作用，这样保证了获得正确敲除菌株的效率。2.在进行基因多拷贝整合时，通过特殊同源序列设计原理，使得第一轮同源重组时pk18mobsacB插入到基因组上Cpf1作用位点，破坏PAM结构而导致CRI SPR/Cpf1不对基因组发生切割作用。这样就保证了目标基因的特异性整合，如果整合到已有拷贝的序列或其他位点时，crRNA能够识别设计的切割序列从而引导Cpf1进行双链切断，导致菌株无法存活。
附图说明
图1 aroE敲除质粒构建验证图
其中，M：Marker，1-4：敲除质粒验证(1700bp)
图2 aroE切割质粒构建验证图
其中，M：Marker，1-5：切割质粒验证(750bp)
图3敲除aroE单交换鉴定验证图
其中，M：Marker，图3-1是上游鉴定引物鉴定图，图3-2是下游鉴定引物鉴定图。通过3-1,3-2的比较看出1是敲除aroE单交换。
图4 aroE基因的敲除及验证
其中，M：Marker，1：13032原菌基因组PCR片段，2：13032△aroE目的片段，3:13032△aroE目的片段
图5 upp保护单交换原理示意图
图6 upp敲除质粒构建验证图
图7 upp切割质粒构建验证图
图8 upp基因的单交换验证
其中，M：Marker，1,3,5：敲除upp基因单交换验证条带(1000bp)2,4：NcoI酶切后条带，其中一条685bp，另外两条303bp，311bp重合。
图9敲除upp电转化现象图
其中，13032△upp(不加碱基)在切割体系存在的条件下切割严谨，基本没有菌生长。13032△upp(加碱基)有菌生长，证明单交换得到保护不被切割.
具体实施方式
为进一步说明本发明，现配合附图进行详细阐述：
利用该组合技术，本发明进行了两个实施例展示，一是成功进行了编码莽草酸脱氢酶的基因aroE的敲除，二是在CRI SPR/Cpf1切割体系存在的基础上，在编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因upp位点成功进行了第一轮同源重组，实现了基因的特异性整合。
实施例1
谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除aroE构建
(1)敲除质粒构建：
①以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，根据aroE基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(△aroE-1，△aroE-2)和下游同源臂引物(△aroE-3，△aroE-4)，通过PCR反应扩增427bp的上游同源臂和559bp的下游同源臂；
②以步骤①中得到的上下游同源臂为模板，以△aroE-1，△aroE-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成1545bp的重叠片段。
③用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化回收得到线性化的载体pk18mobsacB∷rpsl。
④将步骤③所得的线性化载体与步骤②所得到的重叠片段进行同源重组，化学转化到DH5α感受态中。
⑤挑取单菌落以pK18mobsacB鉴定引物(M13-47,RV-M)进行菌落PCR验证(验证结果见图1，所得条带大小约1700bp)，挑取阳性转化子，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△aroE。
(2)切割质粒构建：
①通过CHOPCHOP设计aroE切割序列
(TTTGAGGCCTTTGGCTCGTGTGACTTCT)，从而设计切割所需crRNA序列
②在质粒pXMJ19中的氯霉素抗性基因两侧设计反向PCR引物(反向PCR-1，反向PCR-2)，同时根据奇霉素抗性基因序列设计奇霉素抗性基因引物(sper-1，sper-2)。通过PCR技术扩增两片段，回收纯化后将两片段同源重组，化学转化到DH5α感受态中，菌落PCR验证挑取阳性转化子，得到质粒pXMJ19Cmr∷sper。
③用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19Cmr∷sper，纯化后与cpf1片段同源重组，化学转化到DH5α感受态中，菌落PCR验证挑取阳性转化子，得到质粒pXMJ19Cmr∷sper-cpf1。
④提取步骤③所得质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI双酶切，纯化后与步骤①所得crRNA同源重组，化学转化到DH5α感受态中，以crRNAjd-1，crRNAjd-2为引物进行菌落PCR验证挑取阳性转化子(验证结果见图2，所得条带大小约750bp)，最终得到aroE切割质粒pXMJ19Cmr∷sper-cpf1-crRNA-△aroE。
(3)敲除aroE目的菌株的获得：
①将Corynebacterium glutamicum ATCC13032制成电转化感受态细胞，将非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△aroE电转化到13032感受态细胞中，通过一次同源重组(即非复制型质粒上的△aroE上下游同源臂与基因组上相同序列进行同源重组)使非复制型质粒结合到谷氨酸棒杆菌基因组中。
②挑在卡那霉素抗性平板能正常生长的单菌落，以特异性鉴定引物△aroE-5，△aroE-6，△aroE-7，△aroE-8进行菌落PCR，用鉴定引物鉴定上游鉴定有条带，下游鉴定没有条带才是单交换菌(鉴定结果见图3)，接种于带有卡那霉素抗性的摇管里培养。得到13032△aroE单交换菌。
③将13032△aroE单交换菌也制作成电转化感受态，然后将切割质粒pXMJ19Cmr∷spercpf1crRNA-△aroE电转化到感受态细胞中，涂布于奇霉素抗性和链霉素抗性的平板，长出单菌落后以△aroE-1，△aroE-4为引物进行菌落PCR验证，条带正确的菌接摇管(鉴定结果见图4)。
实施例2
谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除upp保护单交换不被切割的菌株构建
(1)敲除质粒构建：
①以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，根据upp基因序列，在基因两端设计上游同源臂引物(△upp-1，△upp-2)和下游同源臂引物(△upp-3，△upp-4)，通过PCR反应扩增429bp的上游同源臂和458bp的下游同源臂；
②设计下游同源臂上游引物△upp-3时，需要在引物序列上加了一个碱基构建成NcoI酶切位点。同时△upp-3引物必须从PAM结构TTTN的后两个TN开始设计，保证前两个TT在敲除部分(原理图如图5所示)。
③以步骤①中得到的上下游同源臂为模板，以△upp-1，△upp-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成887bp的重叠片段。
④用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化回收得到线性化的载体pk18mobsacB∷rpsl。
⑤将步骤④所得的线性化载体与步骤③所得到的重叠片段进行同源重组，化学转化到DH5α感受态中。
⑥挑取单菌落以pK18mobsacB鉴定引物(M13-47,RV-M)进行菌落PCR验证(验证结果见图6，所得条带大小约1000bp)，挑取阳性转化子，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△upp。
(2)切割质粒构建：
①通过CHOPCHOP设计upp切割序列
(TTTCTGCGCAGCCAGGTGTGGACGCATT)，从而设计切割所需crRNA序列
②用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19，纯化后与cpf片段同源重组，化学转化到DH5α感受态中，菌落PCR验证挑取阳性转化子，得到质粒pXMJ19-cpf1。
③提取步骤②所得质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI双酶切，纯化后与步骤①所得crRNA同源重组，化学转化到DH5α感受态中，以crRNAjd-1，crRNAjd-2为引物进行菌落PCR验证挑取阳性转化子(验证结果见图7，所得条带大小约750bp)，最终得到aroE切割质粒pXMJ19-cpf1-crRNA-△upp。
(3)敲除upp单交换目的菌株的获得：
①将Corynebacterium glutamicum ATCC13032制成电转化感受态细胞，将人为添加碱基保护单交换的非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△upp和不人为添加碱基的非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△upp分别同切割质粒pXMJ19-cpf1-crRNA-△upp电转化到13032感受态细胞中，通过一次同源重组(即非复制型质粒上的△upp上下游同源臂与基因组上相同序列进行同源重组)使非复制型质粒定向结合到谷氨酸棒杆菌基因组中。涂布到氯霉素抗性和卡那霉素抗性平板上。现象如图9所示。
②挑取13032△upp(加碱基)生长的单菌以uppjd-3，uppjd-4为引物进行菌落PCR验证，然后在验证体系中加NcoI酶，进行单酶切验证。由于鉴定片段内部也有一个NcoI的酶切位点，所以经单酶切后出现303bp，311bp，685bp三条带。(验证结果见图8)。
根据上面的实验结果，证明了CRI SPR/Cpf1技术能与传统基因整合技术相结合进行基因的敲除和整合，同时证明了在多拷贝整合中，不会因为多拷贝的同一性导致多拷贝整合难以筛选目的菌。通过实验二可以很好的解决多拷贝同一性问题，使多拷贝基因整合到正确的位置，获得目的菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> △aroE-1(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<400> 1
tgcctgcagg tcgtagaact cataaagccc tcggactgga cc 42
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> △aroE-2(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 2
tcttccaaag cctcacgcat gtttcgtcga aaagcgtttg cagtt 45
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> △aroE-3(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 3
aactgcaaac gcttttcgac gaaacatgcg tgaggctttg gaaga 45
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> △aroE-4(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(44)
<400> 4
tacgaattcg agctcggtac ccgtcgctga cctggtctta ctag 44
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向PCR-1(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 5
gaccgtatcc aaagcatccg 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 反向PCR-2(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(24)
<400> 6
tttttttaag gcagttattg gtgc 24
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> sper-1(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(40)
<400> 7
caataactgc cttaaaaaaa atgaaggcac gaacccagtg 40
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> sper-2(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(43)
<400> 8
cggatgcttt ggatacggtc ttatttgccg actaccttgg tga 43
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> crRNAjd-1(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<400> 9
ccattcgaga ccttcaagaa gat 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> crRNAjd-2(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<400> 10
tacctaggac tgagctagct gtcaa 25
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> △aroE-5(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<400> 11
caaccgataa ggatcagcga ata 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> △aroE-6(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<400> 12
ctgcggaggg cactgtagag actac 25
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> △aroE-7(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 13
atctacgacc cctggccaa 19
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> △aroE-8(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 14
ggccgtagtc atccaagaac at 22
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> △upp-1(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(39)
<400> 15
tgcctgcagg tcgactctag attcttctgg gcggcaatg 39
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> △upp-2(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(40)
<400> 16
cacaccatgg ctgcgcagag catgggatcg acaaggaata 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> △upp-3(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(40)
<400> 17
tattccttgt cgatcccatg ctctgcgcag ccatggtgtg 40
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> △upp-4(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<400> 18
tacgaattcg agctcggtac cgcttgggcc aacctgtaga tg 42
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> uppjd-3(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 19
ggcgtggggc aaattaatc 19
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> uppjd-4(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<400> 20
gcgcccaata cgcaaacc 18
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> M13-47(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(24)
<400> 21
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> RV-M(引物)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(24)
<400> 22
agcggataac aatttcacac agga 24
<210> 23
<211> 894
<212> DNA
<213> 敲除菌株13032△aroE(Corynebacterium glutamicum)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(894)
<400> 23
ccggcaactc tcaagctgat cagttactcg ttaaggaagc actcacccga gtcggcgcca 60
ttcacctggc cgaccgacaa ttcggcgcac tttcaggcgg tgaacgccaa cgcgtcctca 120
tcgcacgagc actcgtacaa aacgccacac acatcctgct cgacgaaccc accaaccacc 180
tcgacatccg ctaccagcac gaagtcctcc acctcgtccg cgaactcagc tcaagttcca 240
tcatcgtcct ccacgacctc aacctcgcag ctgcctacag cgaccacatc atcctccttg 300
accaaggacg tgtggttact caaggaacgc cctcagaggt attgacccca gagcatttgg 360
aacctgtgta tggcgttcgt gttgagcgct ttgacctagg cgatgaagtc caccttcggt 420
tcaagcgtca ctaggagttt tgttgaggag gtggcgggga cttagtgttc ttctgagatg 480
cctaaagact cttccaaagc ctcacgcatg tttcgtcgaa aagcgtttgc agttcggcgg 540
tgcgatcgga gcggttgagc accgtgatcc gggcgacccc ggcttcgatg agtgcccaga 600
tggcggggcg tgcggtgccg ccggagccga tgacgatggc gtgtttgccg gccagtgatg 660
cgccgccgag gagttcaccg agagctcccc tgatgccgtc gacgtcggtg ttgtcggcgc 720
gccatccggt ggccgtgcgc agcaaggtgt ttgcggagcc gatggcgcag gcgcgttcgg 780
ttacttcgtc ggcgaattca agagctgcga atttagacgg catggtgacg gagaatccgc 840
agtaggtttc atcagcgccg gagacgatgc cggggagcat gtcgccggtg cact 894
<210> 24
<211> 7247
<212> DNA
<213> 敲除upp单交换目的菌株(Corynebacterium glutamicum)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(7247)
<400> 24
tagccgtgaa aagccatccc gatgttggag gttcggatgg gattgagctg cacggggtcg 60
ccggcttcga tgatttgccc accgccggcg tacatggcta cgtggccgtc ccaaatcagt 120
agatcgcctt cttgaagttc gtcgtaggtg acttgccggc cgactgcttg ctggtccgcg 180
atgcgcggaa tttccacccc ggcgcgacgc caagcccact gtgttaaacc gctgcagtcg 240
aagccggaag tgctggtccc gccccataaa tagggtgtgc cgagggcttc tttcgccgcg 300
gctactgctt gtttgcccac ctcgttgtca ttgcttggcg cctgcgccgc catatagacc 360
ggcgcagttt ccgcgacggg ttcggcggtg ggctcaggtg tgaggtcctg aatctgcact 420
agcttttcga cgattggttg cacctgtcgg gacatctctt ctagccgttg actggcttcg 480
gcaatcatca gtccaggaag tgaaattaat tcggtgcgcg ctgcgaaaga ttccgccgga 540
ttcatggaga aactgcgcat gactaatccc gctgcctggt tgaggtagtg ctgcgcggtg 600
gtggcgatgt cgtggcgggc tgcgtcaatg aggggagcgg cctggatgag ggaggtgaca 660
aggaggtggt gttgttgtga cgtggcgtcg aaaagcgata aaagggtggt ggggttggcg 720
ctgagctcgc gcccgagcgc gatggcggct gaaatgtcag gcgcctgcgg gatggccagt 780
tgcggaagtt gtgctggttc gtgtgtggct aggcggctaa gggcgctgat cagaccgatc 840
atgtcaggcg ctccaatgcg tgtgcgagtt ggtcgtcggt gtcttcgatt tcagcgaggc 900
ccgtcagcgc gcggtttcct aaattctcgg cggtgtggga cagcaaggtg aggttgcggg 960
cataggtggc aagggaggcg gatagtgcct ggtggatatc aaactgcgcg ccagaatcag 1020
tgggaagcgc gggcacagca ggggtgggca acaaacacag ctcgtgggcg agctctttgg 1080
cgtggggcaa attaatcctc atactttgtt ggactggaaa agtggccgtt tggttccctc 1140
caagcccaaa ttcgcccgcg cggtcttctt ctgggcggca atgatttaac atgtgaagct 1200
atggacatca ccatcgtcaa ccacccactc gttgctagcc gcctaaccct gttgcgcgac 1260
gagcgcagcg acaacgcagc tttccgtgca gcagccaacg acctcggcgc catgctgatc 1320
tacgaagcat cccgagatct ggaagtcgaa cacttcgaca ccaaaacccc cgttgccatg 1380
gctgaaggta ctcgcctgaa gcagccaccc atcatcgttc ccatcatccg tgcaggtctc 1440
ggcatgatcg acccagcgct gtcgatgatt ccggatgcac aggtcggctt cattggcctt 1500
gcccgcgatg aggaaaccca tgagccagtc ccataccttg aggcgctgcc acaggatcta 1560
agcaaccagc ctgtattcct tgtcgatccc atgctggcca ccggcggttc cctcctgcac 1620
gcgatccgcc ttcttgctga tcgtggcgcc accgacatca ccgccatctg catggtttct 1680
gcgcagccat ggtgtggacg cattggcgga atctggtctt ccagttcgtt tggttaccgc 1740
caccatcgac ccaggtctag acgaaaacgc ctacatcgtg cctggtcttg gagatgccgg 1800
tgatcgtctc tacggtccgc gaaacatcga cctttaaaag tttctaaggg cattacggaa 1860
aattcttgcc cactgtagtg ggcggtgagt attcttatgc atcggcaatg ttgtctatgt 1920
gtcgaaggaa atgtcggaaa agcggtggtc aagctatggc cacgctttcg cgagccgact 1980
gaaaaaactt cgaaccctcc gtggcttcag ccaagaagag ctcgcagatc tctccggagt 2040
gtcccgaaac accatttcta attacgagcg caacgaaaac aacaagggca acgccgtcga 2100
tccgcagctg tccaacatct acaggttggc ccaagcgagc tcgaattcgt aatcatggtc 2160
atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 2220
aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 2280
gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 2340
ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 2400
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 2460
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 2520
aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 2580
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 2640
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 2700
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc 2760
acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 2820
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 2880
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 2940
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 3000
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 3060
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 3120
gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 3180
cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 3240
cttcacctag atccttttgg ggtgggcgaa gaactccagc atgagatccc cgcgctggag 3300
gatcatccag ccctgataga aacagaagcc actggagcac ctcaaaaaca ccatcataca 3360
ctaaatcagt aagttggcag catcacccga cgcactttgc gccgaataaa tacctgtgac 3420
ggaagatcac ttcgcagaat aaataaatcc tggtgtccct gttgataccg ggaagccctg 3480
ggccaacttt tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta agaggttcca actttcacca 3540
taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctga 3600
tagaaacaga agccactgga gcacctcaaa aacaccatca tacactaaat cagtaagttg 3660
gcagcatcac ccgacgcact ttgcgccgaa taaatacctg tgacggaaga tcacttcgca 3720
gaataaataa atcctggtgt ccctgttgat accgggaagc cctgggccaa cttttggcga 3780
aaatgagacg ttgatcggca cgtaagaggt tccaactttc accataatga aataagatca 3840
ctaccgggcg tattttttga gttatcgaga ttttcaggag ctctttggca tcgtctctcg 3900
cctgtcccct cagttcagta atttcctgca tttgcctgtt tccagtcggt agatattcca 3960
caaaacagca gggaagcagc gcttttccgc tgcataaccc tgcttcgggg tcattatagc 4020
gattttttcg gtatatccat cctttttcgc acgatataca ggattttgcc aaagggttcg 4080
tgtagacttt ccttggtgta tccaacggcg tcagcggggc aggataggtg aagtaggccc 4140
acccgcgagc gggtgttcct tcttcactgt cccttattcg cacctggcgg tgctcaacgg 4200
gaatcctgct ctgcgaggct ggccggctac cgccggcgta acagatgagg gcaagcggat 4260
ggctgatgaa accaagccaa ccaggctcga gccgcgcgtt ttagcgtgtc agtaggcgcg 4320
tagggtaagt ggggtagcgg cttgttagat atcttgaaat cggctttcaa cagcattgat 4380
ttcgatgtat ttagctggcc gttaccctgc gaatgtccac agggtagctg gtagtttgaa 4440
aatcaacgcc gttgccctta ggattcagta actggcacat tttgtaatgc gctagatctg 4500
tgtgctcagt cttccaggct gcttatcaca gtgaaagcaa aaccaattcg tggctgcgaa 4560
agtcgtagcc accacgaagt ccaggaggaa agcttatgcc aactattcag cagctggtcc 4620
gtaagggccg ccacgataag tccgccaagg tggctaccgc ggcactgaag ggttcccctc 4680
agcgtcgtgg cgtatgcacc cgtgtgtaca ccaccacccc taagaagcct aactctgctc 4740
ttcgtaaggt cgctcgtgtg cgccttacct ccggcatcga ggtttccgct tacatccctg 4800
gtgagggcca caacctgcag gagcactcca tggtgctcgt tcgcggtggt cgtgttaagg 4860
acctcccagg tgtccgttac aagatcgtcc gtggcgcact ggatacccag ggtgttaagg 4920
accgcaagca ggctcgttcc cgctacggcg cgaagagggg ataactcgag atgggttaaa 4980
aaggatcgat cctctagcga accccagagt cccgctcaga agaactcgtc aagaaggcga 5040
tagaaggcga tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca 5100
gcccattcgc cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag 5160
cggtccgcca cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc 5220
atgatattcg gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatc 5280
cgcgccttga gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga 5340
tcatcctgat cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc 5400
gcttggtggt cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg cattgcatca 5460
gccatgatgg atactttctc ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc ctgccccggc 5520
acttcgccca atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg 5580
caaggaacgc ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcttg gagttcattc 5640
agggcaccgg acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg 5700
aacacggcgg catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc 5760
tccacccaag cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcat gcgaaacgat 5820
cctcatcctg tctcttgatc agatcttgat cccctgcgcc atcagatcct tggcggcaag 5880
aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc cccagctggc 5940
aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gctatcgcca tgtaagccca 6000
ctgcaagcta cctgctttct ctttgcgctt gcgttttccc ttgtccagat agcccagtag 6060
ctgacattca tccggggtca gcaccgtttc tgcggactgg ctttctacgt gttccgcttc 6120
ctttagcagc ccttgcgccc tgagtgcttg cggcagcgtg aagctagctt atcgcgccat 6180
tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta 6240
cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 6300
tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac 6360
ttcttctggg cggcaatgat ttaacatgtg aagctatgga catcaccatc gtcaaccacc 6420
cactcgttgc tagccgccta accctgttgc gcgacgagcg cagcgacaac gcagctttcc 6480
gtgcagcagc caacgacctc ggcgccatgc tgatctacga agcatcccga gatctggaag 6540
tcgaacactt cgacaccaaa acccccgttg ccatggctga aggtactcgc ctgaagcagc 6600
cacccatcat cgttcccatc atccgtgcag gtctcggcat gatcgaccca gcgctgtcga 6660
tgattccgga tgcacaggtc ggcttcattg gccttgcccg cgatgaggaa acccatgagc 6720
cagtcccata ccttgaggcg ctgccacagg atctaagcaa ccagcctgta ttccttgtcg 6780
atcccatgct ctgcgcagcc aggtgtggac gcattggcgg aatctggtct tccagttcgt 6840
ttggttaccg ccaccatcga cccaggtcta gacgaaaacg cctacatcgt gcctggtctt 6900
ggagatgccg gtgatcgtct ctacggtccg cgaaacatcg acctttaaaa gtttctaagg 6960
gcattacgga aaattcttgc ccactgtagt gggcggtgag tattcttatg catcggcaat 7020
gttgtctatg tgtcgaagga aatgtcggaa aagcggtggt caagctatgg ccacgctttc 7080
gcgagccgac tgaaaaaact tcgaaccctc cgtggcttca gccaagaaga gctcgcagat 7140
ctctccggag tgtcccgaaa caccatttct aattacgagc gcaacgaaaa caacaagggc 7200
aacgccgtcg atccgcagct gtccaacatc tacaggttgg cccaagc 7247

Claims (2)

1.一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，其特征在于：谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除aroE进行构建，具体步骤如下：
(1)敲除质粒构建：
以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，△aroE-1，△aroE-2为引物，通过PCR反应扩增427bp的敲除aroE的上游同源臂；以△aroE-3，△aroE-4为引物，通过PCR反应扩增559bp的下游同源臂；以△aroE-1，△aroE-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成1545bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化后与重叠片段同源重组，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△aroE；
(2)切割质粒构建：
通过CHOPCHOP设计aroE切割序列，从而设计切割所需crRNA序列：首先将质粒pXMJ19中的氯霉素抗性基因换成奇霉素抗性基因；然后用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19，纯化后与cpf1同源重组；提取质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI酶切，纯化后与crRNA同源重组，最终得到aroE切割质粒pXMJ19Cmr∷sper-cpf1-crRNA-△aroE；
(3)敲除aroE目的菌株的获得：
将Corynebacterium glutamicum ATCC13032制成感受态细胞，将非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△aroE电转化到13032感受态细胞中，通过一次同源重组使非复制型质粒结合到谷氨酸棒杆菌基因组中，挑在卡那霉素抗性平板能正常生长的单菌落，以特异性鉴定引物△aroE-5，△aroE-6，△aroE-7，△aroE-8进行菌落PCR，条带大小正确的菌，接种于带有卡那霉素抗性的摇管里培养，得到13032△aroE单交换菌，将这个菌也制作成感受态，然后将切割质粒pXMJ19Cmr∷spercpf1crRNA-△aroE电转化到感受态细胞中，涂布于奇霉素抗性和链霉素抗性的平板，长出单菌落后以△aroE-1，△aroE-4为引物进行菌落PCR验证，条带正确的菌接摇管；经测序所得敲除菌株13032△aroE序列为序列表中序列23所示序列。
2.一种谷氨酸棒杆菌基因组编辑方法，其特征在于：谷氨酸棒杆菌ATCC13032敲除upp保护单交换不被切割的菌株，具体步骤如下：
(1)敲除质粒构建：
以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板，△upp-1，△upp-2为引物，通过PCR反应扩增429bp的敲除upp的上游同源臂；以△upp-3，△upp-4为引物，通过PCR反应扩增458bp的下游同源臂；设计△upp-3时，在引物序列上加了一个碱基构建成NcoI酶切位点；同时△upp-3引物必须从PAM结构TTTN的后两个TN开始设计，保证前两个TT在敲除部分；然后以△upp-1，△upp-4为引物，通过重叠PCR反应将上下游同源臂重叠成887bp的重叠片段；用限制性内切酶XbaI，KpnI酶切非复制型质粒pk18mobsacB∷rpsl，纯化后与重叠片段同源重组，由此得到另一非复制型质粒，命名为pk18mobsacB∷rpsl-△upp；
(2)切割质粒构建：
通过CHOPCHOP设计upp切割序列，从而设计切割所需crRNA序列；用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pXMJ19，纯化后与cpf1同源重组；提取质粒后再用限制性内切酶BamHI，XbaI酶切，纯化后与crRNA同源重组，最终得到upp切割质粒pXMJ19-cpf1crRNA-△upp；
(3)敲除upp单交换目的菌株的获得：
将Corynebacterium glutamicum ATCC13032制成感受态细胞，将非复制型质粒pK18mobsacB∷rpsl-△upp和切割质粒pXMJ19-cpf1-crRNA-△upp电转化到13032感受态细胞中，涂布到氯霉素和卡那霉素平板上；通过一次同源重组使非复制型质粒定向结合到谷氨酸棒杆菌基因组中；挑取单菌以uppjd-3，uppjd-4为引物进行菌落PCR验证。然后对正确条带的菌进行NcoI酶切验证；有NcoI酶切位点的菌即为目的菌株，该敲除upp单交换目的菌株具有序列表中序列24所示序列。
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