CN110872596B

CN110872596B - 木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌的构建方法

Info

Publication number: CN110872596B
Application number: CN201811024423.1A
Authority: CN
Inventors: 杨晟; 王心; 杨俊杰; 蒋宇
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2038-09-04
Also published as: CN110872596A

Abstract

本发明公开了一种木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌株及其构建方法，该菌株的基因组上整合了多拷贝的阿拉伯糖代谢基因表达盒，所述基因表达盒包含基因araA、araB、araD、GAL2和STP2。本发明的的酿酒酵母菌能够用于代谢木质纤维素原料中的木糖和阿拉伯糖而生成乙醇。

Description

木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术

生物乙醇作为一种重要的商业化绿色可再生运输燃料，在美国、巴西以及国内等地已开始部分替代汽油使用。一代燃料乙醇是以淀粉基(如玉米、木薯)或糖基(如甘蔗、甜菜)为原料制得，虽然是目前燃料乙醇的主要获得方式，但是存在“与人争粮、与粮争地、与畜争料、与农争利”的问题，同时在降低温室气体排放方面优势不大。二代燃料乙醇以玉米秸秆、小麦秸秆、稻草等非粮作物为原料，不存在“与人争粮、与粮争地”等问题，温室气体排放也较一代玉米原料乙醇下降67％，因上述优点，成为目前燃料乙醇的发展方向。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可在厌氧条件下快速代谢葡萄糖高得率生产乙醇，同时可耐受低pH环境，适应高密度发酵，对预处理环节产生的各种抑制物成分也有不错的基础耐受能力。此外遗传背景清晰，各种分子工具齐全，便于进行遗传改造，是燃料乙醇生产的优良宿主。虽然酿酒酵母能够利用葡萄糖，但天然无法代谢存在于木质纤维素原料中的木糖和阿拉伯糖这样的戊糖成分。所以开发戊糖酵母便成为提高二代燃料乙醇生产经济性的关键。

阿拉伯糖是木质纤维素水解液中含量仅次于木糖的戊糖成分，自然界中存在两种典型的阿拉伯糖代谢途径，即细菌中的异构化途径和真菌中的氧化还原途径。异构化途径相比于氧化还原途径，所需步骤少，反应相对简单。阿拉伯糖经转运蛋白转运进入细胞内后，在阿拉伯糖异构酶(araA基因编码)作用下转变为L-核酮糖，L-核酮糖经L-核酮糖激酶(araB基因编码)磷酸化后生成5-磷酸-L-核酮糖，进而在araD基因编码的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶作用下生成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖途径最终转变为乙醇。2001年Nancy W.Y.Ho实验室(Sedlak,M.and N.W.Ho.Enzyme Microb Technol,2001.28(1):p.16-24.)首次在酿酒酵母中引入大肠杆菌(Escherichia coli)来源的阿拉伯糖异构化途径基因araA、araB和araD，但是未能将阿拉伯糖转化为乙醇。基于同样的异构化路线，随后Eckhard Boles实验室(Becker,J.and E.Boles.Appl Environ Microbiol,2003.69(7):p.4144-4150.)使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的araA替换大肠杆菌来源，同时过表达酵母内源的糖转运蛋白基因GAL2，可是重组菌株依然无法利用阿拉伯糖生长。该实验室随后在此基础上又尝试了不同细菌来源的araA基因，发现地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)来源的效果较好，同时对其和大肠杆菌来源的araB、araD基因进行密码子优化，获得的菌株150h消耗30g/l阿拉伯糖(Wiedemann,B.and E.Boles.Appl EnvironMicrobiol,2008.74(7):p.2043-50.)，暗示途径基因的有效表达可能是瓶颈。最近研究人员基于植物乳杆菌来源的araABD基因序列在数据库搜索同源序列以寻找新的基因来源，发现戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)来源的araABD与之有较高相似度，将之导入酿酒酵母后依然无法利用阿拉伯糖(Caballero,A.and J.L.Ramos.Microbiology,2017.163(4):p.442.)。显然直接在酿酒酵母导入异构化途径无法实现菌株高效代谢阿拉伯糖。

Jack T.Pronk将基因工程改造后的IMS0001菌株在阿拉伯糖为唯一碳源恒化器中培养，最后得到60h可完全消耗20g/l阿拉伯糖的菌株IMS0002(Wisselink,H.W.,et al.,Appl Environ Microbiol,2007.73(15):p.4881-91.)，但是该菌株丧失了原有的木糖代谢能力，在木糖培养基长期培养后得到能够在木糖平板长出的菌株，为进一步提升该菌混糖代谢能力，研究人员开发了在阿拉伯糖，木糖加阿拉伯糖，葡萄糖加木糖加阿拉伯糖3种培养基交替驯化的新型策略，最后得到目前报道的混糖利用表型最好的菌株IMS0010，该菌能够在30h内消耗30g/l葡萄糖，15g/l木糖和15g/l阿拉伯糖，产醇25.8g/l，糖醇转化率高达0.43g g^-1(Wisselink,H.W.,et al.,Appl Environ Microbiol,2009.75(4):p.907-14.)。将戊糖片球菌来源的araABD基因整合到酿酒酵母同时经过约1600h驯化同样使得菌株阿拉伯糖代谢能力大幅提升(Caballero,A.and J.L.Ramos.Microbiology,2017.163(4):p.442.)。鲍晓明实验室(Wang,C.,et al.,Biomed Res Int,2017.2017:p.5318232.)将植物乳杆菌来源的araABD进行密码子优化在酿酒酵母表达，同时过表达磷酸戊糖途径基因，结合驯化手段得到快速代谢阿拉伯糖菌株BSW3AP，该菌最大阿拉伯糖消耗速率为0.49g g^- ¹h^-1，乙醇转化率为0.42g g^-1。在BSW3AP基础上过表达阿拉伯糖转运蛋白Gal2p，最大阿拉伯糖消耗速率进一步提升到0.61g g^-1h^-1。

研究表明，阿拉伯糖异构化途径基因的高表达、磷酸戊糖途径相关基因的高表达以及阿拉伯糖转运蛋白的高表达对于酿酒酵母快速代谢阿拉伯糖有着重要作用。虽然已有一些解析驯化后菌株阿拉伯糖表型利用提升的机制报道，但是尚未有直接在驯化前菌株进行基因操作实现不依赖驯化理性重构阿拉伯糖酵母菌株的报道。

对于许多利用木糖和/或阿拉伯糖等戊糖成分进行乙醇生产的酿酒酵母工程菌而言，驯化是必经的处理筛选过程。基因工程改造后的菌株的驯化往往涉及到遗传性状和基因组的改变，因此是一个反复筛选和变异的过程，周期较长。因此如何克服酿酒酵母工程菌须经长期驯化才能同时高效转化木糖和阿拉伯糖的限制瓶颈已成为一个急需解决的问题。

发明内容

基于现有技术获得的木糖和阿拉伯糖基因工程菌必须依赖耗时费力的驯化手段，同时菌株对于木质纤维素原料中的木糖和阿拉伯糖代谢能力不够强、乙醇生产能力低、因而难以实现工业化应用，本发明利用基因工程技术来改造可利用木糖产生乙醇的酿酒酵母菌(本文中简称为木糖酵母)，通过增强或改变与木糖和阿拉伯糖转化相关的代谢途径，构建得到一种木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌株。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种阿拉伯糖代谢基因表达盒(L-Arabinose Utilization Cassette，AUC)，其包含下述5个基因：地衣芽孢杆菌来源的阿拉伯糖异构酶表达基因araA(优选经密码子优化的araA)，大肠杆菌来源的L-核酮糖激酶表达基因araB，大肠杆菌来源的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶表达基因araD(优选经密码子优化的araD)，酿酒酵母来源的阿拉伯糖转运体基因GAL2和拟南芥来源的阿拉伯糖转运体基因STP2。

上述阿拉伯糖代谢基因表达盒可以从上游至下游依次包括基因araB表达元件、基因araA表达元件、基因araD表达元件、基因GAL2表达元件和基因STP2表达元件。

在一种实施方式中，上述基因araB表达元件包括PGI1启动子(本文中简称P1)、基因araB、FBA1终止子(本文中简称T1)；上述基因araA表达元件包括GAP启动子(本文中简称P2)、基因araA、ADH1终止子(本文中简称T2)；上述基因araD表达元件包括HXT7启动子(本文中简称P3)、基因araD、PGI1终止子(本文中简称T3)；上述基因GAL2表达元件包括FBA1启动子(本文中简称P4)、基因GAL2、GAL2终止子(本文中简称T4)；上述基因STP2表达元件包括TPI1启动子(本文中简称P5)、基因STP2和PFK1终止子(本文中简称T5)。

在一种优选的实施方式中，上述基因araA表达元件的碱基序列为SEQ ID NO:1，基因araB表达元件的碱基序列为SEQ ID NO:2，基因araD表达元件的碱基序列为SEQ ID NO:3，基因GAL2表达元件的碱基序列为SEQ ID NO:4，基因STP2表达元件的碱基序列为SEQ IDNO:5。

在另一种实施方式中，上述阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC中可以不包含基因STP2表达元件。即，上述阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC中可以从上游至下游依次包括基因araB表达元件比如SEQ ID NO:2、基因araA表达元件比如SEQ ID NO:1、基因araD表达元件比如SEQID NO:3和基因GAL2表达元件比如SEQ ID NO:4，但省去了基因STP2表达元件比如SEQ IDNO:5。

根据本发明的第二个方面，提供了一种质粒，其包含上述的阿拉伯糖代谢基因表达盒。

优选地，上述质粒的质粒骨架为SEQ ID NO:6。

优选上述质粒为pAM-BEEGS-Nours。该质粒pAM-BEEGS-Nours可通过下述方法构建：将质粒骨架SEQ ID NO:6和araA表达元件、araB表达元件、araD表达元件、GAL2表达元件和STP2表达元件一起使用Gibson方法组装而得。

根据本发明的第三个方面，提供了一种酿酒酵母菌株，其基因组上整合了1个以上拷贝、优选多拷贝、优选12个以上拷贝的上述阿拉伯糖代谢基因表达盒。

优选AUC被整合到酿酒酵母菌第15号染色体的G418位点。

在一种实施方式中，作为上述酿酒酵母菌株构建基础的宿主是能够利用木糖转化为乙醇的酿酒酵母菌(本文中简称为木糖酵母)，优选工业二倍体酿酒酵母。比如为文献(Liuyang Diao,YingmiaoLiu,Fenghui Qian,Junjie Yang,Yu Jiang,ShengYang.Construction of fast xylose-fermenting yeast based on industrialethanol-producing diploid Saccharomyces cerevisiae by rational design andadaptive evolution.BMC Biotechnology.2013,13:110.)报道的菌株CIBTS0735(母菌为CCTCC M94055)。

在一种实施方式中，上述酿酒酵母菌株通过包括如下步骤的方法构建：通过将含有上述AUC的质粒比如pAM-BEEGS-Nours导入酿酒酵母而将上述AUC整合到酿酒酵母染色体上；当染色体上整合了1个拷贝AUC、菌株基本上无利用阿拉伯糖能力时，对菌株进行驯化处理，直至得到能够高速共利用木糖和阿拉伯糖的酿酒酵母菌；当基因组上整合了12个以上、比如12-14个拷贝的AUC时，不需要进行驯化处理，即可得到能够高速共利用木糖和阿拉伯糖的酿酒酵母菌。上述质粒导入方法即转化方法比如是醋酸锂化学转化法或者电转化法。

在一种优选的实施方式中，将上述含有上述AUC的质粒比如pAM-BEEGS-Nours使用NotI限制性内切酶切割使其线性化，电泳凝胶回收后通过化学转化法整合到菌株CIBTS0735染色体，涂布诺尔丝菌素抗性的YPD平板，对转化子进行PCR鉴定，保证AUC整合到染色体上。

根据本发明的第四个方面，提供了上述酿酒酵母菌株在发酵法生产乙醇中的用途。

实验表明，本发明通过在木糖酵母基因组上整合高拷贝的阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC，所构建的酿酒酵母菌株可快速代谢阿拉伯糖，同时其木糖代谢能力得以保留，可以不依赖驯化就直接利用木糖和阿拉伯糖生产乙醇，而其对于阿拉伯糖的利用能力优于经驯化的木糖阿拉伯糖共利用酿酒酵母菌株，具有工业化应用前景。

附图说明

图1是本发明构建的质粒pAM-BEEGS-Nours的图谱结构示意图。

图2是本发明构建的阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC的结构示意图。

图3是本发明设计的酿酒酵母工程菌的阿拉伯糖代谢途径示意图。

图4是显示驯化前菌株CIBTS1972代谢阿拉伯糖生产乙醇的厌氧发酵曲线图。

图5是显示驯化后菌株CIBTS1974代谢阿拉伯糖生产乙醇的厌氧发酵曲线图。

图6是菌株CIBTS1974与CIBTS1972的基因组中AUC基因拷贝数变化的对比图。

图7是菌株CIBTS1974与CIBTS1972的基因组中AUC基因拷贝数(上)和转录水平(下)的比较图。

图8是显示驯化前菌株CIBTS1972、驯化后菌株CIBTS1974、重构菌株CIBTS1975-XX、和重构菌株CIBTS0735-XX的阿拉伯糖消耗的比较图。

图9是显示驯化后菌株CIBTS1974、重构菌株CIBTS1975-12、重构菌株CIBTS0735-14代谢阿拉伯糖生产乙醇的发酵曲线图。

图10是显示驯化后菌株CIBTS1974、重构高拷贝AUC菌株CIBTS0735-14的代谢混糖(木糖加阿拉伯糖加葡萄糖)生产乙醇的发酵曲线图。符号：阿拉伯糖(正三角)，葡萄糖(圆形)，木糖(正方形)，乙醇(倒三角)，细胞干重(菱形)。

图11是显示CIBTS0735和CIBTS1975中整合12个拷贝的AUC变体的重构菌株、驯化后菌株CIBTS1974代谢高浓度(20g/l)阿拉伯糖的发酵柱形图。

图12是显示CIBTS0735和CIBTS1975中整合12个拷贝的AUC变体的重构菌株、驯化后菌株CIBTS1974代谢低浓度(5g/l)阿拉伯糖的发酵柱形图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

在本文中，术语“阿拉伯糖代谢基因表达盒”、“基因表达盒”、“表达盒”和“AUC”表示相同的意义，可以互换使用，都是指本发明构建的阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC。

类似地，术语“基因X表达元件”、“X基因表达元件”和“表达元件”表示相同的意义，可以互换使用，都是指包含X基因、相应启动子和相应终止子的一端DNA序列。其中X是指araA、araB、araD、GAL2和STP2。上述“表达元件”也可以称为“表达单元”或者“表达盒”，这是本领域技术人员所熟知的。

作为本发明的酿酒酵母工程菌构建基础的宿主是能够利用木糖转化为乙醇的酿酒酵母菌CIBTS0735，是一种可快速代谢木糖的二倍体酿酒酵母，简称为木糖酵母，其在文献(Liuyang Diao,YingmiaoLiu,Fenghui Qian,Junjie Yang,Yu Jiang,ShengYang.Construction of fast xylose-fermenting yeast based on industrialethanol-producing diploid Saccharomyces cerevisiae by rational design andadaptive evolution.BMC Biotechnology.2013,13:110.)已做详细报道，是一种在CCTCCM94055基础上构建的基因工程菌。通过在CCTCC M94055在染色体上不同位置整合两个拷贝的XI基因，在染色体δ位点位置整合PPP(磷酸戊糖途径)相关基因，在GRE3基因位点整合一个转运体表达基因GXF1，用木糖培养基驯化后，分离单菌得到CIBTS0735。

基于酿酒酵母菌株CIBTS0735，通过整合阿拉伯糖代谢相关基因表达盒AUC，叠加驯化操作，最终获得可快速代谢阿拉伯糖的酿酒酵母菌株，同时其木糖代谢能力得以保留。通过对驯化前后菌株基因组进行测序比较分析发现，AUC拷贝数由1增长到12。据此直接在驯化前菌株中迭代整合多拷贝AUC比如12-14个拷贝的AUC，可不经驯化直接获得快速发酵阿拉伯糖的酿酒酵母菌株CIBTS1974。该研究结果显示高拷贝AUC是本发明的酿酒酵母菌株获得阿拉伯糖代谢能力的充要条件，可以为相关研究工作提供借鉴。

实施例中，CIBTS1972是驯化前菌株，CIBTS1974是对CIBTS1972进行驯化后的菌株，CIBTS1975是将CIBTS1974染色体即基因组中AUC完全敲除的菌株，CIBTS1975-XX是在CIBTS1975染色体中整合上XX个AUC的重构菌株，CIBTS0735-XX是在CIBTS0735染色体中整合上XX个AUC的重构菌株。

敲除AUC导致AUC完全缺失的突变体菌株CIBTS1975失去了阿拉伯糖代谢能力。回补或者整合入AUC可使菌株逐渐恢复或者赋予阿拉伯糖代谢能力，达到菌株实现阿拉伯糖利用的目的。

研究表明，含有同样拷贝数的驯化前和驯化后菌株(比如重构菌株CIBTS0735-XXvs CIBTS1975-XX)表型一致，且12个拷贝的AUC足以支撑菌株不依赖驯化，就能够高效代谢阿拉伯糖。即高拷贝AUC是菌株获得阿拉伯糖利用表型的充分条件。若进一步增加2个拷贝到14个之后，即重构菌株CIBTS0735-14代谢阿拉伯糖的能力进一步提升，优于驯化得到的菌株CIBTS1974。这些实验结果验证了表达盒AUC的阿拉伯糖代谢功能。

在本发明的一个具体实施方式中，上述阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC中可以不包含基因STP2表达元件作为转运体。即，AUC表达盒中只要含有araA、araB、araD和GAL2这四个基因表达元件即可实现表达盒AUC的阿拉伯糖代谢功能，GAL2在表达盒AUC中的功能和效果与GAL2+STP2的功能和效果相当或者接近，也就是说GAL2在表达盒AUC中基本能够代替GAL2+STP2。显然，当不包含STP2表达元件时，AUC表达盒的构建因为省去了STP2表达元件构建步骤而可以更加方便。另一方面，STP2表达元件的添加也并不会损害表达盒的阿拉伯糖代谢功能；而且，当在仅含有araA、araB和araD三个基因表达元件的表达盒中增加STP2表达元件时所形成的表达盒AUC-G的的阿拉伯糖代谢功能要好于araABD三基因表达盒AUC-G-S。

在本文中，为了区别基因表达元件组成不同的表达盒，以减号“-”形式对AUC表达盒中GAL2或者STP2表达元件的减少情况进行表示。即，把包含araA、araB、araD、GAL2和STP2五个基因表达元件的表达盒简写为AUC；将包含araA、araB、araD和GAL2四个基因表达元件的表达盒简写为AUC-S；将包含araA、araB、araD和STP2四个基因表达元件的表达盒简写为AUC-G；将包含araA、araB和araD三个基因表达元件的表达盒简写为AUC-G-S。这些减少基因表达元件的表达盒AUC-G、AUC-S和AUC-G-S可视为AUC变体。

实施例

材料和方法

本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

主要培养基及缓冲液：

LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)。

YPA20培养基：酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，阿拉伯糖20g/l。

YPA5培养基：酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，阿拉伯糖5g/l。

YPD20培养基：酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l。

YPD20X10A10培养基：酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，木糖10g/l，阿拉伯糖10g/l。

YPD80X40A20培养基：酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，葡萄糖80g/l，木糖40g/l，阿拉伯糖20g/l。

YPD-Nours固体培养基：酵母提取物10g/l，胰蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，诺尔丝菌素200μg/ml，琼脂2％。

实施例1：基因表达元件构建

1.1araA表达元件构建：经密码子优化的地衣芽孢杆菌来源的araA基因由南京金斯瑞公司合成，以该公司提供含有该基因的质粒为模板，引物对BliAraA-F/BliAraA-R扩增araA基因；以CCTCC M94055菌株基因组为模板，使用引物Pthd3-A-F/Pthd3-BliA-R扩增启动子GAP；以CCTCC M94055菌株基因组为模板，使用引物Tadh1-BliA-F/Tadh1-A-R扩增终止子ADH1。以上3个片段使用重叠延伸PCR(OE-PCR)技术融合(Shevchuk,N.A.,et al.,Nucleic Acids Res,2004.32(2):p19.)，引物为Pthd3-A-F/Tadh1-A-R。araA表达元件的碱基序列为SEQ ID NO:1。

1.2araB表达元件构建：以大肠杆菌MG1655菌株基因组为模板，引物对EcoAraB-F/EcoAraB-R扩增araB基因；以CCTCC M94055菌株基因组为模板，使用引物Ppgi-B-F/Ppgi-EcoB-R扩增启动子PGI1；以CCTCC M94055菌株基因组为模板，使用引物Tfba1-EcoB-F/Tfba1-B-R扩增终止子FBA1。以上3个片段使用重叠延伸PCR(OE-PCR)技术融合，引物为Ppgi-B-F/Tfba1-B-R。araB表达元件的碱基序列为SEQ ID NO:2。

1.3araD表达元件构建：经密码子优化的大肠杆菌来源的araD基因由南京金斯瑞公司合成，以该公司提供含有该基因的质粒为模板，引物对BliAraD-F/BliAraD-R扩增araD基因；以CCTCC M94055菌株基因组为模板，使用引物对Phxt7-D-F/Phxt7-BliD-R扩增启动子HXT7；以CCTCC M94055菌株基因组为模板，使用引物对Tpgi-BliD-F/Tpgi-D-R扩增终止子PGI1。以上3个片段使用重叠延伸PCR(OE-PCR)技术融合，引物为Phxt7-D-F/Tpgi-D-R。araD表达元件的碱基序列为SEQ ID NO:3。

1.4GAL2表达元件构建：以CCTCC M94055菌株基因组为模板，引物对Gal2-F/Gal2-R扩增GAL2基因和GAL2终止子；以CCTCC M94055菌株基因组为模板，使用引物对Pfba1-G-F/Pfba1-G-R扩增启动子FBA1。以上2个片段使用重叠延伸PCR(OE-PCR)技术融合，引物为Pfba1-G-F/Gal2-R。GAL2表达元件的碱基序列为SEQ ID NO:4。

1.5STP2表达元件构建：以拟南芥cDNA为模板，引物对AtStp2-F/AtStp2-R扩增STP2基因；以CCTCC M94055菌株基因组为模板，使用引物对Ptpi1-S-F/Ptpi1-S-R扩增启动子TPI1；以CCTCC M94055菌株基因组为模板，使用引物对Tpfk1-S-F/Tpfk1-S-R扩增终止子PFK1。以上3个片段使用重叠延伸PCR(OE-PCR)技术融合，引物为Ptpi1-S-F/Tpfk1-S-R。STP2表达元件的碱基序列为SEQ ID NO:5。

实施例2：包含AUC的质粒pAM-BEEGS-Nours及AUC变体构建

2.1以pAG36(Addgene编号No.Plasmid#35126)质粒为模板，引物对CEN/ARS-F/CEN/ARS-R扩增酿酒酵母质粒复制元CEN/ARS，引物对pUCori-F/pUCori-R扩增大肠杆菌质粒复制元ori，将两个复制元片段通过重叠延伸PCR(OE-PCR)技术融合，所用引物对为pUCori-F/CEN/ARS-R。同时在复制元片段5’端和3’端通过引物各引入一个Not1酶切位点备用。

以酿酒酵母CIBTS0735基因组为模板，引物对G418-up-F/G418-up-R扩增G418位点上游同源臂，引物对G418-down-F/G418-down-R扩增G418下游同源臂。上游同源臂和两个复制元片段和下游同源臂一起通过OE-PCR技术组装，所用引物对为G418-up-F/G418-down-R，得到片段命名为片段1。

以pAG36(Addgene编号No.Plasmid#35126)质粒为模板，引物对Nours-F/Nours-R扩增诺尔丝菌素抗性基因natMX6表达框。片段1和诺尔丝菌素抗性基因natMX6表达框一起使用OE-PCR技术组装，所用引物对为G418-up-F/Nours-R，得到片段命名为质粒骨架，碱基序列为SEQ ID NO:6。

2.2将质粒骨架与实施例1中构建的araA表达元件、araB表达元件、araD表达元件、GAL2表达元件和STP2表达元件一起使用Gibson方法组装。取8μl反应液化学转化入DH5α感受态菌株，涂布氨苄(终浓度为100μg/ml)抗性固体LB平板，挑取转化子抽提质粒(AxyPrep质粒小量制备试剂盒，AP-MN-P-250)、酶切、测序验证。正确质粒为pAM-BEEGS-Nours，其结构如图1所示。

该质粒为pAM-BEEGS-Nours上已经整合了阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC，AUC的结构如图2所示。

2.3构建3个AUC变体：按照与步骤2.2相同的AUC表达盒构建方式，分别构建3个AUC变体即AUC-G、AUC-S和AUC-G-S，所不同的是进行Gibson组装时使用的表达元件种类和数量不同。具体而言，表达盒AUC-G-S仅使用araA表达元件、araB表达元件和araD表达元件进行Gibson组装；表达盒AUC-G使用araA表达元件、araB表达元件、araD表达元件和STP2表达元件进行Gibson组装；表达盒AUC-S仅使用araA表达元件、araB表达元件、araD表达元件和GAL2表达元件进行Gibson组装。

以上实施例中使用的引物序列信息如表1所示。

表1、引物序列

表1中，名称中的“-F”代表正向；“-R”代表反向。

表2、PCR反应体系：

PCR反应所用酶购自东洋纺公司：KOD–Plus-Neo(Code:KOD-401)。

PCR反应条件为：

预变性：94℃，2min，

变性：98℃，10sec，35个循环，

退火：60℃，30sec，35个循环，

延伸：68℃，30sec/kb，35个循环，

延伸：68℃，10min。

Gibson反应体系：

参与组装的DNA片段：5μl。

Gibson组装反应液：15μl。

50℃反应1小时。

5X等温反应缓冲液配制：

5X等温反应缓冲液(以600μL为例)

1M Tris-HCl pH7.5：300μL，

2M MgCl₂：15μL，

100mM dNTP：24μL，

1M二硫苏糖醇(DTT)：30μL，

PEG-8000：0.15g，

100mM NAD：30μL，

灭菌去离子水：201μL，

共计：600μL。

Gibson组装反应液配制(以600μL为例)：

5X等温反应缓冲液：160μL，

10U/μL T5核酸外切酶：0.32μL，

2U/μL Phusion DNA聚合酶：10μL，

40U/μL Taq DNA连接酶：80μL，

灭菌去离子水：349.68μL。

实施例3：将包含AUC的质粒整合到酿酒酵母染色体上

将构建的pAM-BEEGS-Nours质粒使用Not1酶(Fermentas公司货号：FD0593)切割使其线性化，电泳凝胶回收13808bp片段。取1μg通过化学转化法(醋酸锂化学转化法)转入酿酒酵母菌株CIBTS0735感受态细胞。具体感受态制备及转化方法参考文献(Gietz,R.D.andR.H.Schiestl.Nat Protoc,2007,2(1):p.31-4.)。转化后复苏液涂布诺尔丝菌素抗性的YPD-Nours平板。对转化子进行PCR鉴定，测序验证阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC已经整合到酿酒酵母CIBTS0735的染色体上，阳性转化子命名为CIBTS1972。

测序发现，阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC最初整合到宿主15号染色体上(chromosome XV)。本发明设计的基因工程菌株比如CIBTS1972的阿拉伯糖代谢途径参见图3。

阿拉伯糖(Arabinose)经GAL2或者STP2转运蛋白运进胞质后，经阿拉伯糖代谢途径基因araABD编码酶催化后转变为5-磷酸核酮糖(Ribulose-5-P)，再转变为5-磷酸木酮糖(D-Xylulose-5-P)，之后进入PPP途径(磷酸戊糖途径)最终转变为乙醇(Ethanol)。

实施例4：测试菌株CIBTS1972阿拉伯糖利用能力

实验方法：

将菌株CIBTS1972在以20g/l阿拉伯糖为唯一碳源的厌氧试管中发酵，特定时间点取样测定残留阿拉伯糖含量、乙醇浓度及菌株生长OD值。具体操作是：

实验步骤：

(1)将平板上菌落或者-80℃甘油管冻存的菌株接种到3ml YPD20X10A10培养基活化培养，30℃，240rpm。取200μl培养液转接到新的YPD20X10A10试管培养制备二级种子。12000rpm，离心3min收集细胞，用无菌水洗涤1次，按0.5g/l接种量接种到YPA20发酵培养基，30℃，240rpm发酵。其中菌株OD值和干重之间换算参考文献(Diao,L.,et al.,BMCBiotechnol,2013.13(1):p110.)，简言之1单位OD₆₀₀＝0.63g DCW/l(即细胞干重每升)。发酵期间，于特定时间点取样品分析。

(2)菌体细胞生长使用Beckman Coulter DU730分光光度计测定，波长600nm。阿拉伯糖、乙醇浓度使用安捷伦1200HPLC测定，具体条件是柱子Bio-Rad HPX-87H，示差检测器，柱温65℃，流动相为5mM稀硫酸，流速0.6ml/min。

实验结果：

发酵结果显示于图4和表3中，3次发酵实验取平均值。图4显示了菌株CIBTS1972代谢阿拉伯糖生产乙醇的表型。

实验结果表明：菌株CIBTS1972基本无法代谢阿拉伯糖。

实施例5：菌株CIBTS1972阿拉伯糖驯化

实验方法：

将菌株CIBTS1972在以20g/l阿拉伯糖为唯一碳源的培养基中连续传代，提高其阿拉伯糖代谢能力。

实验步骤：

(1)挑取若干成功整合AUC的转化子接种到YPA20液体培养基振荡培养，约一周后有试管菌液变浓，转接到新的YPA20培养基，保证初始浓度为OD₆₀₀＝0.5，之后每24h转接一次到OD值不再有明显增长为止。

(2)将最后一次转接培养液稀释涂布到YPA20固体平板，挑取单菌进行发酵表型测试。选择代谢阿拉伯糖能力最好的菌株，命名为CIBTS1974。

实验结果：

发酵结果显示于图5和表3中，3次发酵实验取平均值。图5显示了菌株CIBTS1974代谢阿拉伯糖生产乙醇的表型。

原来基本无法代谢阿拉伯糖的CIBTS1972菌株经过驯化后，代谢阿拉伯糖能力大幅提升。CIBTS1974菌株48h基本消耗完初始20g/l的阿拉伯糖，产醇7g/l以上，乙醇得率在0.4g/g。这一结果验证了阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC的功能和本发明的设计方案正确性。

表3、菌株CIBTS1972和CIBTS1974菌株代谢阿拉伯糖的发酵表型

实施例6：菌株CIBTS1972和CIBTS1974比较基因组学分析

实验方法：

对菌株CIBTS1972和CIBTS1974进行基因组测序比对分析，找到菌株驯化后相比于驯化前发生的SNP(单核苷酸变异)、InDel(小片段序列的插入或者删除)以及拷贝数的变化。

实验步骤：

将菌株CIBTS1972和CIBTS1974在YPD20液体培养基培养到对数生长期，收集细胞，提取基因组委托派森诺公司进行基因组测序。简要来说，构建菌株CCTCC M94055，CIBTS1972和CIBTS1974 400bp paired-end基因组文库，使用Illumina Hiseq2500机器测序。所得高质量测序数据使用bwa 0.7.12命令(Li,H.,Aligning sequence reads,clonesequences and assembly contigs with BWA-MEM.2013.1303.)贴回到参考基因组。根据比对结果，使用VarScan 2.4.0命令(Koboldt,D.C.,et al.,Genome Res.2012.22(3):p.568-76.)鉴定SNPs和InDels。为测定拷贝数，每个碱基测序深度使用samtools depth命令(Li,H.and R.Durbin,Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform.2009:Oxford University Press.)获得，同时将整个基因组分隔成100bp区间，计算每个区间的测序深度并归一化到所有测序深度的平均值。

实验结果：

驯化后菌株CIBTS1974相比驯化前菌株CIBTS1972，共有16个基因发生了SNPs或者InDels的变化，详见表4。检测整合AUC基因拷贝数变化，发现AUC是整合到15号染色体的G418位点，同时整合序列测序深度要远高于该染色体上其它区域，暗示整合AUC拷贝数明显上升，详见图6。

图6显示了CIBTS1974菌株基因组15号染色体，经Not1酶切线性化的pAM-BEEGS-Nours质粒序列测序深度和其它区域的比较。每1个圆点代表基因组上100bp区间序列，pAM-BEEGS-Nours质粒序列用红色标示。局部放大图里面的灰色柱分别代表基因araB(B)、araA(A)、araD(D)、GAL2(G)和STP2(S)。

实验数据：

表4驯化后菌株CIBTS1974相比驯化前菌株CIBTS1972基因组SNPs和InDels变化

实施例7：比较菌株CIBTS1972和CIBTS1974中AUC基因拷贝数及转录水平实验方法：

使用荧光定量PCR(real time PCR)技术测定比较AUC基因在CIBTS1972和CIBTS1974菌株转录水平和拷贝数变化。

实验步骤：

(1)测定转录水平时，将菌株在YPD20培养基培养，到对数生长期收集菌体，使用TRIzol试剂按提供步骤提取总RNA，使用反转录试剂盒(Invitrogen公司)和特定引物(Takara公司)将RNA反转录成cDNA。以ACT1基因作为内参，基因相对表达量使用2^-ΔΔCt方法测定(Livak and Schmittgen 2001)。

(2)为分析基因拷贝数，首先使用天根酵母基因组提取试剂盒提取酵母DNA，使用NanoDrop ND-1000(Thermo Fisher Scientific)测定提取DNA浓度。基因拷贝数使用以下公式计算：N _Target/N _Reference＝(2^{CT(Reference)}/2^CT(Target))×2。ACT1作为内参基因，由于宿主为二倍体，所以拷贝数计算时需要乘以2。

实验结果：

使用Real-time PCR精确测定拷贝数发现在驯化后菌株CIBTS1974中，AUC基因araABD和STP2拷贝数达到了12，而GAL2达到14因为基因组自身已经有2个拷贝。而在出发菌株CIBTS1972中，初始整合的拷贝数都是1个。我们还测定了AUC基因的转录水平，与拷贝数提升相一致，araABD、GAL2、STP2基因在驯化后菌株水平提升了12、10、16、11和12倍。

实验数据：

两个菌株的AUC基因拷贝数及转录水平比较结果详见表4和图7。该数据是3次重复实验得到。图7给出了菌株CIBTS1972和CIBTS1974中基因araABD、GAL2和STP2基因拷贝数(上)、转录水平(下)。结果表明驯化后菌株CIBTS1974中的AUC基因拷贝数及转录水平明显提高了。

表5菌株CIBTS1972和CIBTS1974中AUC基因拷贝数及转录水平比较

实施例8：在CIBTS1974菌株敲除及回补高拷贝AUC

实验方法：

根据AUC扩增机制，基于Cre-loxP技术一次性敲除CIBTS1974菌株12个拷贝的AUC，测定所得菌株阿拉伯糖利用能力。在此基础上逐步回补AUC拷贝数到12，测定菌株阿拉伯糖利用能力。

实验步骤：

(1)在CIBTS1974菌株导入Cre重组酶表达质粒，将转化子在半乳糖培养基培养诱导诱导loxP位点之间的AUC环出，最后得到AUC完全缺失突变体CIBTS1975。

(2)测试菌株CIBTS1975在YPA20培养基代谢阿拉伯糖能力。

(3)在CIBTS1975染色体XII-1、XI-3、XII-5、X-2、X-3、XI-2位点定点整合2、6、10、12个拷贝AUC并测试菌株在YPA20培养基代谢阿拉伯糖能力。

实验结果：

(1)菌株CIBTS1975阿拉伯糖代谢能力完全丧失，参见图8和表6。

(2)在CIBTS1975逐步回补AUC拷贝数到12个，随着AUC拷贝数提高，菌株消耗阿拉伯糖增加，特别对于整合12个拷贝AUC的菌株CIBTS1975-12，完全回补了CIBTS1974表型，证明了高拷贝AUC对于驯化后菌株代谢阿拉伯糖是必要的，参见图8和图9。

图8还给出了原始菌株CIBTS0735整合入不同拷贝AUC后消耗阿拉伯糖的表型；图9还给出了原始菌株CIBTS0735整合入14拷贝AUC后的代谢阿拉伯糖生产乙醇的发酵表型。进一步验证了AUC功能和AUC拷贝数对于阿拉伯糖代谢的影响。图8和图9中菌株CIBTS1975和CIBTS0735名称后的“-XX”比如12或14代表回补或整合的AUC拷贝数。

实验数据：

表6多拷贝AUC功能验证及阿拉伯糖驯化菌株和重构菌株的发酵测试

表中“-XX”代表回补或整合的AUC拷贝数。

实施例9：在原始菌株CIBTS0735中迭代整合高拷贝AUC

实验方法：

在菌株CIBTS0735染色体特定位点迭代整合多拷贝AUC，测定菌株阿拉伯糖利用能力。

实验步骤：

在CIBTS0735染色体XII-1、XI-3、XII-5、X-2、X-3、XI-2、XII-3、X-4位点定点整合2、6、10、12、14个拷贝的AUC并测试菌株在YPA20培养基代谢阿拉伯糖能力。

实验结果：

随着AUC拷贝数提升，菌株代谢阿拉伯糖能力逐渐增强。值得一提的是，含有同样拷贝数的驯化前和驯化后菌株(CIBTS0735-XX vs CIBTS1975-XX)表型一致。以上结果清楚表明，12个拷贝的AUC足以支撑菌株不依赖驯化，就能够高效代谢阿拉伯糖。即高拷贝AUC是菌株获得阿拉伯糖利用表型的充分条件。此外进一步增加2个拷贝到14个之后，即重构菌株CIBTS0735-14代谢阿拉伯糖的能力进一步提升，优于驯化得到的菌株CIBTS1974。详见图9和表7。

实施例10：菌株CIBTS1974和CIBTS0735-14代谢混糖能力测试

实验方法：

测试菌株CIBTS1974和CIBTS0735-14在混糖培养基YPD80X40A20中利用糖(葡萄糖+木糖+阿拉伯糖)及产乙醇能力。

实验步骤：

菌株CIBTS1974和CIBTS0735-14在YPD80X40A20培养基发酵，隔一段时间取样测定残糖及乙醇浓度。

实验结果：

葡萄糖消耗最快，18h内全部用完。之后木糖和阿拉伯糖同步利用，在58h内所有糖基本消耗完全，产醇57g/l，产醇速率0.14g g^-1h^-1，转化率为0.42g g^-1。在戊糖代谢期，菌株CIBTS1974木糖消耗速率和阿拉伯糖消耗速率分别为0.17g g^-1h^-1和0.07g g^-1h^-1，菌株CIBTS0735-14为0.16g g^-1h^-1和0.06g g^-1h^-1。详见图10和表7。菌株具备的混糖发酵能力暗示它们在纤维素乙醇工业方面具有应用潜力。

实验数据：

表7阿拉伯糖驯化菌株和重构多拷贝AUC菌株混糖发酵参数

以上数据是3次独立重复实验平均值。“—”代表未检测。

对于YPA20培养基发酵，q_阿拉伯糖和q_乙醇测定时间是整个发酵历程；对于YPD80X40A20培养基，q_阿拉伯糖和q_木糖测定时间是戊糖发酵时期，q_乙醇测定时间是整个发酵历程。

¹L-阿拉伯糖消耗速率：g g(干重)^-1h^-1。.

²D-木糖消耗速率：g g(干重)^-1h^-1。

³乙醇产生速率：g(干重)^-1h^-1。

⁴糖醇转化率：g(生成乙醇)·g(消耗糖)^-1。

实施例11：GAL2和STP2对于菌株代谢高浓度阿拉伯糖(20g/l)贡献测试

实验方法：

在CIBTS0735和CIBTS1975菌株整合12个拷贝的AUC变体，该AUC变体只含有GAL2和STP2两者之一、或者不含GAL2和STP2表达元件，测试菌株代谢20g/l阿拉伯糖能力。

实验步骤：

(1)在CIBTS1975染色体XII-1、XI-3、XII-5、X-2、X-3、XI-2位点定点整合12个拷贝AUC变体并测试菌株在YPA20培养基代谢阿拉伯糖能力。

(2)在CIBTS0735染色体XII-1、XI-3、XII-5、X-2、X-3、XI-2位点定点整合12个拷贝AUC变体并测试菌株在YPA20培养基代谢阿拉伯糖能力。

实验结果：

图11和表8所示，在36h内，整合了12个拷贝的AUC-G-S菌株(CIBTS0735-AUC-G-S和CIBTS1975-AUC-G-S)只消耗20％的阿拉伯糖，增加12个拷贝的STP2之后，消耗阿拉伯糖量增加10％。特别的，AUC表达盒中只含有GAL2表达元件的菌株(CIBTS0735-AUC-S和CIBTS1975-AUC-S)代谢阿拉伯糖能力同驯化后菌株及整合了12个拷贝AUC的菌株持平，表明GAL2表达元件作为转运体可实现菌株高速利用阿拉伯糖。似乎表明AUC表达盒中只要含有araA、araB、araD和GAL2这四个基因表达元件即可实现表达盒AUC的阿拉伯糖代谢功能。

实验数据：

表8整合12拷贝AUC变体菌株高浓度阿拉伯糖培养基耗糖能力测试

菌株	36h阿拉伯糖消耗量百分比
		CIBTS0735-AUC-G-S	23.71，22.37，23.13，20.62，21.19
CIBTS0735-AUC-G	28.45，32.30，31.22，34.97，33.21
		CIBTS0735-AUC-S	56.72，59.02，62.21，53.16，59.29
CIBTS0735-12	59.66，57.66，63.93，61.57，62.36
		CIBTS1974	61.04，63.17，70.55
CIBTS1975-AUC-G-S	22.90，17.97，19.81，25.77，21.10
		CIBTS1975-AUC-G	31.94，31.42，33.07，33.52，33.51
CIBTS1975-AUC-S	59.52，65.10，60.37，61.62，68.01
		CIBTS1975-12	60.78，62.92，59.86，60.02，65.04

实施例12：GAL2和STP2对于菌株代谢低浓度阿拉伯糖(5g/l)贡献测试

实验方法：

在CIBTS0735和CIBTS1975菌株整合12个拷贝的只带有GAL2表达元件的AUC变体AUC-S，测试菌株代谢5g/l阿拉伯糖能力。

实验步骤：

测试含有12个拷贝的AUC-S菌株在低浓度阿拉伯糖(5g/l)条件相比于驯化菌株CIBTS1974和含有12拷贝AUC的菌株阿拉伯糖利用能力。

实验结果：

图12所示，在36h内，整合了12个拷贝的AUC-S菌株(CIBTS0735-AUC-S和CIBTS1975-AUC-S)相比于菌株CIBTS1974和CIBTS0735-12、CIBTS1975-12，代谢阿拉伯糖能力无显著差异，进一步表明无论是在高浓度还是低浓度阿拉伯糖条件下，GAL2一个表达元件作为转运体完全能够替代GAL2+STP2两个表达元件作为转运体的功能，即多拷贝整合araABD加GAL2这4个基因表达盒，即可实现阿拉伯糖的高速利用。

以上实施例表明，本发明构建的阿拉伯糖代谢基因表达盒AUC可赋予菌株阿拉伯糖代谢能力，在木糖酵母中整合高拷贝AUC，无需驯化就可以使菌株同步利用木糖和阿拉伯糖，具有工业化应用前景。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌的构建方法

<130> SHPI1811133

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2582

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gaataaaaaa cacgcttttt cagttcgagt ttatcattat caatactgcc atttcaaaga 60

atacgtaaat aattaatagt agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa aattagcctt 120

ttaattctgc tgtaacccgt acatgcccaa aatagggggc gggttacaca gaatatataa 180

catcgtaggt gtctgggtga acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg 240

ctttttaagc tggcatccag aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca 300

ccaaccatca gttcataggt ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac 360

aggcaaaaaa cgggcacaac ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac 420

acaaggcaat tgacccacgc atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct 480

gctctctctg atttggaaaa agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt 540

cccctacttg actaataagt atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct 600

atttcttaaa cttcttaaat tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac 660

caagaactta gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa atgatccaag ccaagacaca 720

cgtattctgg tttgtaacag gttcccaaca tttgtatggt gaagaagccg tccaagaagt 780

cgaagaacat tccaaaatga tttgtaatgg tttgaacgat ggtgacttaa gattccaagt 840

cgaatacaag gctgtagcaa caagtttgga tggtgttaga aagttattcg aagaagctaa 900

tagagacgaa gaatgcgcag gtattataac ctggatgcat actttttctc cagcaaaaat 960

gtggattcct ggtttgtcag aattgaataa gccattgttg catttccaca ctcaattcaa 1020

cagagatata ccttgggaca agatcgatat ggacttcatg aacatcaacc aatctgctca 1080

cggtgacaga gaatatggtt tcatcggtgc aagattgggt attccaagaa aggtaatagc 1140

cggttactgg gaagatagag aagttaaaag atccattgac aagtggatga gtgctgcagt 1200

cgcttacatc gaatctagac atatcaaggt agcaagattc ggtgacaaca tgagaaacgt 1260

tgccgtcacc gaaggtgaca agatcgaagc tcaaattcaa ttgggttggt ctgttgatgg 1320

ttacggtatt ggtgacttag ttactgaaat taatgctgtc tccgaacaat ccttgagtga 1380

attgatcagt gaatacgaag aattgtacga atggccagaa ggtgaagccg ctagagaatc 1440

cgttaaagaa caagcaagaa tcgaattggg tttgaagaga tttttatctt caggtggtta 1500

tacagctttt actacaacct tcgaagattt gcacggtatg aaacaattgc ctggtttagc 1560

agttcaaaga ttaatggccg aaggttacgg tttcggtggt gaaggtgact ggaagaccgc 1620

agccttggtt agaatgatga aaatgatggc tggtggtaaa gaaacatctt ttatggaaga 1680

ttacacctac catttcgaac ctggtaatga aatgattttg ggttctcaca tgttagaagt 1740

ttgtccttca atcgctgaac ataaaccaag aattgaagtc caccctttgt ctatgggtgc 1800

caaggatgac ccagctagat tagtttttga tggtatagca ggtcctgccg taaacgtttc 1860

attgatcgac ttaggtggta gattcagatt ggttattaat aaggttgaag ccgtcaaggt 1920

accacatgat atgccaaact tgcctgttgc tagagtctta tggaaaccac aaccttcttt 1980

gagaacatca gccgaagctt ggattttagc tggtggtgca catcacactt gcttgtccta 2040

ccaattaaca gccgaacaaa tgttggattg ggctgaaatg agtggtatcg aagcagtttt 2100

aatcaataga gatactacaa ttttgaactt gagaaatgaa ttgaaatggt ccgaagcagc 2160

atacagattg agaaagtttt aaataagcga atttcttatg atttatgatt tttattatta 2220

aataagttat aaaaaaaata agtgtataca aattttaaag tgactcttag gttttaaaac 2280

gaaaattctt attcttgagt aactctttcc tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc 2340

atgaggtcgc tcttattgac cacacctcta ccggcatgcc gagcaaatgc ctgcaaatcg 2400

ctccccattt cacccaattg tagatatgct aactccagca atgagttgat gaatctcggt 2460

gtgtatttta tgtcctcaga ggacaacacc tgttgtaatc gttcttccac acggatccac 2520

agcctagcct tcagttgggc tctatcttca tcgtcattca ttgcatctac tagcccctta 2580

cc 2582

<210> 2

<211> 2551

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cgttctgtca ccgtcagaaa aatatgtcaa tgaggcaaga accgggatgg taacaaaaat 60

cacgatctgg gtgggtgtgg gtgtattgga ttataggaag ccacgcgctc aacctggaat 120

tacaggaagc tggtaatttt ttgggtttgc aatcatcacc atctgcacgt tgttataatg 180

tcccgtgtct atatatatcc attgacggta ttctattttt ttgctattga aatgagcgtt 240

ttttgttact acaattggtt ttacagacgg aattttccct atttgtttcg tcccattttt 300

ccttttctca ttgttctcat atcttaaaaa ggtcctttct tcataatcaa tgctttcttt 360

tacttaatat tttacttgca ttcagtgaat tttaatacat attcctctag tcttgcaaaa 420

tcgatttaga atcaagatac cagcctaaaa atggcgattg caattggcct cgattttggc 480

agtgattctg tgcgagcttt ggcggtggac tgcgctaccg gtgaagagat cgccaccagc 540

gtagagtggt atccccgttg gcagaaaggg caattttgtg atgccccgaa taaccagttc 600

cgtcatcatc cgcgtgacta cattgagtca atggaagcgg cactgaaaac cgtgcttgca 660

gagcttagcg tcgaacagcg cgcagctgtg gtcgggattg gcgttgacag taccggctcg 720

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aacccgaacg cgatgttcgt attgtggaaa gaccacactg cggttgaaga agcggaagag 840

attacccgtt tgtgccacgc gccgggcaac gttgactact cccgctacat tggtggtatt 900

tattccagcg aatggttctg ggcaaaaatc ctgcatgtga ctcgccagga cagcgccgtg 960

gcgcaatctg ccgcatcgtg gattgagctg tgcgactggg tgccagctct gctttccggt 1020

accacccgcc cgcaggatat tcgtcgcgga cgttgcagcg ccgggcataa atctctgtgg 1080

cacgaaagct ggggcggcct gccgccagcc agtttctttg atgagctgga cccgatcctc 1140

aatcgccatt tgccttcccc gctgttcact gacacttgga ctgccgatat tccggtgggc 1200

accttatgcc cggaatgggc gcagcgtctc ggcctgcctg aaagcgtggt gatttccggc 1260

ggcgcgtttg actgccatat gggcgcagtt ggcgcaggcg cacagcctaa cgcactggta 1320

aaagttatcg gtacttccac ctgcgacatt ctgattgccg acaaacagag cgttggcgag 1380

cgggcagtta aaggtatttg cggtcaggtt gatggcagcg tggtgcctgg atttatcggt 1440

ctggaagcag gccaatcggc gtttggtgat atctacgcct ggtttggtcg cgtactcggc 1500

tggccgctgg aacagcttgc cgcccagcat ccggaactga aaacgcaaat caacgccagc 1560

cagaaacaac tgcttccggc gctgaccgaa gcatgggcca aaaatccgtc tctggatcac 1620

ctgccggtgg tgctcgactg gtttaacggc cgccgcacac cgaacgctaa ccaacgcctg 1680

aaaggggtga ttaccgatct taacctcgct accgacgctc cgctgctgtt cggcggtttg 1740

attgctgcca ccgcctttgg cgcacgcgca atcatggagt gctttaccga tcaggggatc 1800

gccgttaata acgtgatggc actgggcggc atcgcgcgga aaaaccaggt cattatgcag 1860

gcctgctgcg acgtgctgaa tcgcccgctg caaattgttg cctctgacca gtgctgtgcg 1920

ctcggtgcgg cgatttttgc tgccgtcgcc gcgaaagtgc acgcagacat cccatcagct 1980

cagcaaaaaa tggccagtgc ggtagagaaa accctgcaac cgtgcagcga gcaggcacaa 2040

cgctttgaac agctttatcg ccgctatcag caatgggcga tgagcgccga acaacactat 2100

cttccaactt ccgccccggc acaggctgcc caggccgttg cgactctata agttaattca 2160

aattaattga tatagttttt taatgagtat tgaatctgtt tagaaataat ggaatattat 2220

ttttatttat ttatttatat tattggtcgg ctcttttctt ctgaaggtca atgacaaaat 2280

gatatgaagg aaataatgat ttctaaaatt ttacaacgta agatattttt acaaaagcct 2340

agctcatctt ttgtcatgca ctattttact cacgcttgaa attaacggcc agtccactgc 2400

ggagtcattt caaagtcatc ctaatcgatc tatcgttttt gatagctcat tttggagttc 2460

gcgattgtct tctgttattc acaactgttt taatttttat ttcattctgg aactcttcga 2520

gttctttgta aagtctttca tagtagctta c 2551

<210> 3

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tcgtaggaac aatttcgggc ccctgcgtgt tcttctgagg ttcatctttt acatttgctt 60

ctgctggata attttcagag gcaacaagga aaaattagat ggcaaaaagt cgtctttcaa 120

ggaaaaatcc ccaccatctt tcgagatccc ctgtaactta ttggcaactg aaagaatgaa 180

aaggaggaaa atacaaaata tactagaact gaaaaaaaaa aagtataaat agagacgata 240

tatgccaata cttcacaatg ttcgaatcta ttcttcattt gcagctattg taaaataata 300

aaacatcaag aacaaacaag ctcaacttgt cttttctaag aacaaagaat aaacacaaaa 360

acaaaaagtt tttttaattt taatcaaaaa atgttggaag acttgaaaag acaagtattg 420

gaagctaatt tggcattgcc taagcataac ttggtaacct tgacctgggg taacgtatcc 480

gctgttgata gagaaagagg tgtattcgtt ataaaaccat ccggtgtaga ctatagtgtt 540

atgacagcag atgacatggt tgtcgtaagt attgaaactg gtgaagttgt cgaaggtact 600

aagaaaccat cttcagatac ccctactcat agattgttat accaagcatt tccttctatt 660

ggtggtatag ttcatacaca ctcaagacat gccaccatct gggcccaagc tggtcaatct 720

attccagcta ctggtactac acacgcagat tatttctacg gtacaatccc ttgtaccaga 780

aagatgactg acgctgaaat taatggtgaa tatgaatggg aaaccggtaa cgtcatcgta 840

gaaactttcg aaaagcaagg tatcgatgct gcacaaatgc caggtgtttt ggtccattca 900

cacggtcctt tcgcctgggg taaaaatgca gaagacgccg ttcataacgc cattgtctta 960

gaagaagttg cttacatggg tatattctgc agacaattgg caccacaatt acctgatatg 1020

caacaaacct tattagacaa acactacttg agaaaacacg gtgccaaagc ctattacggt 1080

caataaacaa atcgctctta aatatatacc taaagaacat taaagctata ttataagcaa 1140

agatacgtaa attttgctta tattattata cacatatcat atttctatat ttttaagatt 1200

tggttatata atgtacgtaa tgcaaaggaa ataaatttta tacattattg aacagcgtcc 1260

aagtaactac attatgtgca ctaatagttt agcgtcgtga agactttatt gtgtcgcgaa 1320

aagtaaaaat tttaaaaatt agagcacctt gaacttgcga aaaaggttct catcaactgt 1380

ttaaaaggag gatatcaggt cctatttctg acaaacaata tacaaattta gtttcaaaga 1440

tgaatcagtg cgcgaaggac ataactcatg aagcctccag tatacccatc gatttgcaag 1500

aaagatactc gcactggaag a 1521

<210> 4

<211> 2890

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tccaactggc accgctggct tgaacaacaa taccagcctt ccaacttctg taaataacgg 60

cggtacgcca gtgccaccag taccgttacc tttcggtata cctcctttcc ccatgtttcc 120

aatgcccttc atgcctccaa cggctactat cacaaatcct catcaagctg acgcaagccc 180

taagaaatga ataacaatac tgacagtact aaataattgc ctacttggct tcacatacgt 240

tgcatacgtc gatatagata ataatgataa tgacagcagg attatcgtaa tacgtaatag 300

ttgaaaatct caaaaatgtg tgggtcatta cgtaaataat gataggaatg ggattcttct 360

atttttcctt tttccattct agcagccgtc gggaaaacgt ggcatcctct ctttcgggct 420

caattggagt cacgctgccg tgagcatcct ctctttccat atctaacaac tgagcacgta 480

accaatggaa aagcatgagc ttagcgttgc tccaaaaaag tattggatgg ttaataccat 540

ttgtctgttc tcttctgact ttgactcctc aaaaaaaaaa aatctacaat caacagatcg 600

cttcaattac gccctcacaa aaactttttt ccttcttctt cgcccacgtt aaattttatc 660

cctcatgttg tctaacggat ttctgcactt gatttattat aaaaagacaa agacataata 720

cttctctatc aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat tcttctgttc ttctttttct 780

tttgtcatat ataaccataa ccaagtaata catattcaaa atggcagttg aggagaacaa 840

tatgcctgtt gtttcacagc aaccccaagc tggtgaagac gtgatctctt cactcagtaa 900

agattcccat ttaagcgcac aatctcaaaa gtattctaat gatgaattga aagccggtga 960

gtcagggtct gaaggctccc aaagtgttcc tatagagata cccaagaagc ccatgtctga 1020

atatgttacc gtttccttgc tttgtttgtg tgttgccttc ggcggcttca tgtttggctg 1080

ggataccggt actatttctg ggtttgttgt ccaaacagac tttttgagaa ggtttggtat 1140

gaaacataag gatggtaccc actatttgtc aaacgtcaga acaggtttaa tcgtcgccat 1200

tttcaatatt ggctgtgcct ttggtggtat tatactttcc aaaggtggag atatgtatgg 1260

ccgtaaaaag ggtctttcga ttgtcgtctc ggtttatata gttggtatta tcattcaaat 1320

tgcctctatc aacaagtggt accaatattt cattggtaga atcatatctg gtttgggtgt 1380

cggcggcatc gccgtcttat gtcctatgtt gatctctgaa attgctccaa agcacttgag 1440

aggcacacta gtttcttgtt atcagctgat gattactgca ggtatctttt tgggctactg 1500

tactaattac ggtacaaaga gctattcgaa ctcagttcaa tggagagttc cattagggct 1560

atgtttcgct tggtcattat ttatgattgg cgctttgacg ttagttcctg aatccccacg 1620

ttatttatgt gaggtgaata aggtagaaga cgccaagcgt tccattgcta agtctaacaa 1680

ggtgtcacca gaggatcctg ccgtccaggc agagttagat ctgatcatgg ccggtataga 1740

agctgaaaaa ctggctggca atgcgtcctg gggggaatta ttttccacca agaccaaagt 1800

atttcaacgt ttgttgatgg gtgtgtttgt tcaaatgttc caacaattaa ccggtaacaa 1860

ttattttttc tactacggta ccgttatttt caagtcagtt ggcctggatg attcctttga 1920

aacatccatt gtcattggtg tagtcaactt tgcctccact ttctttagtt tgtggactgt 1980

cgaaaacttg ggacatcgta aatgtttact tttgggcgct gccactatga tggcttgtat 2040

ggtcatctac gcctctgttg gtgttactag attatatcct cacggtaaaa gccagccatc 2100

ttctaaaggt gccggtaact gtatgattgt ctttacctgt ttttatattt tctgttatgc 2160

cacaacctgg gcgccagttg cctgggtcat cacagcagaa tcattcccac tgagagtcaa 2220

gtcgaaatgt atggcgttgg cctctgcttc caattgggta tgggggttct tgattgcatt 2280

tttcacccca ttcatcacat ctgccattaa cttctactac ggttatgtct tcatgggctg 2340

tttggttgcc atgttttttt atgtcttttt ctttgttcca gaaactaaag gcctatcgtt 2400

agaagaaatt caagaattat gggaagaagg tgttttacct tggaaatctg aaggctggat 2460

tccttcatcc agaagaggta ataattacga tttagaggat ttacaacatg acgacaaacc 2520

gtggtacaag gccatgctag aataatgcgt ttgaagtgag acgctccatc atctctctta 2580

atttttcatg actgacgttt tttcttcatt ttaattatca tagtatttgt ttgaaaaaaa 2640

aaaaaaaaaa tttcccttat caatgatatc cttacgatta tataaattcc ttacctaaac 2700

ctattatttg tgtacatata tcagagtatt attacatata taaccttttt ctctaaaaca 2760

ggaaaaaaaa aagaaaacga taacatgctc tgccatcctt tgttcaccga gcaaaattaa 2820

aaacgcaaaa tgaattgtcc ctatgaaatt attaaaggac cacatcacca gacttatctc 2880

tggggggtcc 2890

<210> 5

<211> 2419

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tagtgtttaa agattacgga tatttaactt acttagaata atgccatttt tttgagttat 60

aataatccta cgttagtgtg agcgggattt aaactgtgag gaccttaata cattcagaca 120

cttctgcggt atcaccctac ttattccctt cgagattata tctaggaacc catcaggttg 180

gtggaagatt acccgttcta agacttttca gcttcctcta ttgatgttac acctggacac 240

cccttttctg gcatccagtt tttaatcttc agtggcatgt gagattctcc gaaattaatt 300

aaagcaatca cacaattctc tcggatacca cctcggttga aactgacagg tggtttgtta 360

cgcatgctaa tgcaaaggag cctatatacc tttggctcgg ctgctgtaac agggaatata 420

aagggcagca taatttagga gtttagtgaa cttgcaacat ttactatttt cccttcttac 480

gtaaatattt ttctttttaa ttctaaatca atctttttca attttttgtt tgtattcttt 540

tcttgcttaa atctataact acaaaaaaca catacataaa ctaaaaatgg ctgttggttc 600

gatgaatgtc gaagaaggca ctaaagcttt tcctgcgaag ctgacaggtc aagtctttct 660

ttgctgtgtc attgctgctg ttggtggtct catgtttggt tacgacatcg gaatctcagg 720

aggtgtaacg agtatggaca ctttcttgtt agattttttc ccacacgtgt acgagaagaa 780

acacagagta cacgaaaaca actactgcaa attcgatgac cagctcttgc agttgttcac 840

ttcctcactc tacttggctg gaatcttcgc tagctttatt tcttcctatg tttctagggc 900

ttttggaaga aaacccacaa tcatgctcgc ctccatcttc ttcctcgtcg gtgctatcct 960

caacttatct gcccaagaac tcggcatgtt gatcggtggt cgtattcttc tcggctttgg 1020

tatcggtttc ggtaaccaga ccgttccatt gttcatctca gagattgctc cggcgagata 1080

cagaggagga ctaaacgtca tgttccagtt tctcatcacc attggaatct tagcagcaag 1140

ttatgtgaac tacttaactt ccacgttgaa aaacggctgg agatattctc tcggtggtgc 1200

tgctgtcccc gctttaatcc tcttgatagg atccttcttt atccacgaga ctccggctag 1260

tctcatcgag cgcggtaaag acgaaaaggg gaagcaagtc ctgaggaaga tcagaggcat 1320

tgaagatatt gagctcgagt tcaatgagat caaatacgca acagaggtag cgacaaaggt 1380

gaaaagccca ttcaaagaac tcttcaccaa gagtgagaac agaccaccat tggtgtgtgg 1440

aacgttactt cagttctttc aacagttcac cggtatcaac gtggttatgt tctacgctcc 1500

agttttgttc cagacgatgg gtagtggtga caacgcttct ctgatctcta ctgttgtcac 1560

caatggtgtg aacgcaatcg ctacagttat ctctctttta gtggttgatt tcgccggtag 1620

aaggtgtctt ctgatggaag gagctctcca gatgaccgct acacagatga caattggagg 1680

cattctctta gctcacttga agctagttgg tcctattact ggccatgccg tgccgctgat 1740

tgtattgatc ctcatctgcg tatacgtgtc tggatttgca tggtcttggg gtccattggg 1800

atggcttgtt ccgtctgaga tctaccctct tgaagtgaga aatgctggtt acttctgtgc 1860

ggtggcgatg aacatggtct gcactttcat cattggacag ttcttcttgt ctgctctctg 1920

cagattcaga tcattattgt tcttcttctt cggaataatg aacattatca tgggactatt 1980

tgtcgtgttt tttcttcccg aaaccaaagg tgttcctatt gaggaaatgg ccgagaagcg 2040

ttggaaaacg cacccgcgtt ggaagaaata tttcaaagac tagatgattg caatgaaaag 2100

tttaagttaa gcaaaaggag gtaaaaatgg catgcacttt aatttttata caatcgtttt 2160

tttgtcataa gacttattta tgtatctgtt gtttttcttt ttctatcctc tatttttgtc 2220

tatttgtctt tgttttactc tttttcatta ttatttcttt atataatttt tgtacgatat 2280

gatacacata acaatgagca atgaacatat ttctaatcct aaccattaga tatacttttc 2340

aactgaggaa taatggcgcc ttgattaaac taagctatgg aatttgcatt attcaagttt 2400

tagggtgtgc ttaatctgc 2419

<210> 6

<211> 3558

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgggtaagga aaagactcac gtttcgaggc cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt 60

tatatgggta taaatgggct cgcgataatg tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat 120

tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca 180

atgatgttac agatgagatg gtcagactaa actgggcggc cgcagaggcg gtttgcgtat 240

tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 300

agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 360

aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 420

gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 480

tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 540

cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 600

ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 660

cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 720

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 780

agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 840

gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 900

gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 960

tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 1020

agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 1080

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atctcatgag cggatacata 1140

tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 1200

ccacctgggt ccttttcatc acgtgctata aaaataatta taatttaaat tttttaatat 1260

aaatatataa attaaaaata gaaagtaaaa aaagaaatta aagaaaaaat agtttttgtt 1320

ttccgaagat gtaaaagact ctagggggat cgccaacaaa tactaccttt tatcttgctc 1380

ttcctgctct caggtattaa tgccgaattg tttcatcttg tctgtgtaga agaccacaca 1440

cgaaaatcct gtgattttac attttactta tcgttaatcg aatgtatatc tatttaatct 1500

gcttttcttg tctaataaat atatatgtaa agtacgcttt ttgttgaaat tttttaaacc 1560

tttgtttatt tttttttctt cattccgtaa ctcttctacc ttctttattt actttctaaa 1620

atccaaatac aaaacataaa aataaataaa cacagagtaa attcccaaat tattccatca 1680

ttaaaagata cgaggcgcgt gtaagttaca ggcaagcgat ccgtcctaag aaaccattat 1740

tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt 1800

cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct 1860

gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg 1920

tcggggctgc ggccgcctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 1980

tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggcaaaacag cattccaggt 2040

attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 2100

ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgattaag ccagctgaag 2160

cttcgtacgc tgcaggtcga caacccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa 2220

gttattaggt ctagacccac acaccatagc ttcaaaatgt ttctaagctt gccttgtccc 2280

cgccgggtca cccggccagc gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg 2340

tgcgcagctc aggggcatga tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg 2400

tataatcatt tgcatccata cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct 2460

cctcgctgca gacctgcgag cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc 2520

acgccgcgcc cctgtagaga aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc 2580

atatacttcc ttttaaaatc ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac 2640

aaccatgggt accactcttg acgacacggc ttaccggtac cgcaccagtg tcccggggga 2700

cgccgaggcc atcgaggcac tggatgggtc cttcaccacc gacaccgtct tccgcgtcac 2760

cgccaccggg gacggcttca ccctgcggga ggtgccggtg gacccgcccc tgaccaaggt 2820

gttccccgac gacgaatcgg acgacgaatc ggacgacggg gaggacggcg acccggactc 2880

ccggacgttc gtcgcgtacg gggacgacgg cgacctggcg ggcttcgtgg tcgtctcgta 2940

ctccggctgg aaccgccggc tgaccgtcga ggacatcgag gtcgccccgg agcaccgggg 3000

gcacggggtc gggcgcgcgt tgatggggct cgcgacggag ttcgcccgcg agcggggcgc 3060

cgggcacctc tggctggagg tcaccaacgt caacgcaccg gcgatccacg cgtaccggcg 3120

gatggggttc accctctgcg gcctggacac cgccctgtac gacggcaccg cctcggacgg 3180

cgagcaggcg ctctacatga gcatgccctg cccctaatca gtactgacaa taaaaagatt 3240

cttgttttca agaacttgtc atttgtatag tttttttata ttgtagttgt tctattttaa 3300

tcaaatgtta gcgtgattta tatttttttt cgcctcgaca tcatctgccc agatgcgaag 3360

ttaagtgcgc agaaagtaat atcatgcgtc aatcgtatgt gaatgctggt cgctatactg 3420

ctgtcgattc gatactaacg ccgccatcca gtgtcgactc gaaggcttta atttgcaagc 3480

tctcgagaac ccttaatata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta ttaggtgata 3540

tcagatccac tagtggcc 3558

Claims

1.一种木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌株，其特征在于，作为构建基础的宿主酿酒酵母菌株是能够利用木糖转化为乙醇的酿酒酵母菌，其基因组上整合了12个以上拷贝的下述的阿拉伯糖代谢基因表达盒：

该阿拉伯糖代谢基因表达盒从上游至下游依次包括大肠杆菌来源的L-核酮糖激酶表达基因araB表达元件、地衣芽孢杆菌来源的阿拉伯糖异构酶表达基因araA表达元件、大肠杆菌来源的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶表达基因araD表达元件、酿酒酵母来源的阿拉伯糖转运体基因GAL2表达元件和拟南芥来源的阿拉伯糖转运体基因STP2表达元件，其中，

基因araB表达元件包括PGI1启动子、基因araB、FBA1终止子；基因araA表达元件包括GAP启动子、基因araA、ADH1终止子；基因araD表达元件包括HXT7启动子、基因araD、PGI1终止子；基因GAL2表达元件包括FBA1启动子、基因GAL2、GAL2终止子；基因STP2表达元件包括TPI1启动子、基因STP2和PFK1终止子。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述基因araA表达元件的碱基序列为SEQ ID NO: 1，基因araB表达元件的碱基序列为SEQ ID NO: 2，基因araD表达元件的碱基序列为SEQ ID NO: 3，基因GAL2表达元件的碱基序列为SEQ ID NO: 4，基因STP2表达元件的碱基序列为SEQ ID NO: 5。

3.如权利要求1或2所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，不包含基因STP2表达元件。

4.如权利要求1或2所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述的阿拉伯糖代谢基因表达盒被克隆在一种质粒上。

5.如权利要求4所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，质粒骨架为SEQ ID NO: 6。

6.如权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌是二倍体酿酒酵母。

7.如权利要求6所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌是菌株CIBTS0735。

8.一种构建如权利要求1-7中任一项所述的酿酒酵母菌株的方法，包括如下步骤：通过将如权利要求4中所述的质粒导入酿酒酵母而将所述的阿拉伯糖代谢基因表达盒整合到酿酒酵母染色体上，即可得到共利用木糖和阿拉伯糖的酿酒酵母菌。

9.如权利要求1-7中任一项所述的酿酒酵母菌株在发酵法生产乙醇中的用途。