CN111019966B - 一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为一种具有较髙棒状杆菌复制能力的表达质粒，所述表达质粒的第1786位点的核苷酸为A或G，其余位点与质粒pXMJ19相同；所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。通过在pXMJ19载体的棒状杆菌复制子调节部位，将第1786位点的核苷酸C进行人工突变，成功获得2株比pXMJ19质粒拷贝能力高6～8.5倍的棒状杆菌/大肠杆菌双用载体pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G质粒，pXMJ19C1786A拷贝数约为115，pXMJ19C1786G质粒的拷贝数约为170。

Description

一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法。

背景技术

好的基因工程疫苗最大的特点在于它不带任何感染性病毒，因此不会引起由病毒感染带来的毒副作用，从而更加安全可靠。此外基因工程疫苗相对于传统疫苗生产过程来说具有更加简便、质量更易控制、更便于储存与运输等优势。作为一类新兴生物技术,基因工程疫苗的应用正在不断拓展,逐渐成为经济社会中疫病防治的发展新趋势。基因工程疫苗主要有两类：一类是核酸类包括DNA和RNA疫苗，另一类是含特异性抗原蛋白的亚单位疫苗。二者均通过抗原蛋白诱导宿主细胞产生应对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。

基因工程疫苗的制备虽可通过生物合成，如直接合成多肽(亚单位疫苗)或合成能在宿主细胞内表达的DNA序列(DNA疫苗)，但无论生物合成多肽还是合成核酸其造价都很高，远不能用于规模化生产，目前基因工程疫苗的制备还完全依赖于细菌或细胞这些相对便宜且易于控制的生物工厂来生产。如蛋白亚单位疫苗的生产途径主要包括制备表达质粒以及蛋白表达与纯化，抗原蛋白的制备过程包括将质粒转化进原核细胞，主要是大肠杆菌或真核细胞(针对需要三维空间或糖基化修饰的抗原蛋白)进行转录和翻译从而产生抗原蛋白作为蛋白亚单位疫苗的原材料。DNA疫苗制作过程包括把抗原基因克隆到能在真核内表达的载体拟获得表达该抗原基因的质粒，再将该质粒转化进大肠杆菌，让质粒先在细菌这个廉价工厂中大量扩增，再通过一系列步骤将质粒DNA从细菌工厂中提取出来，DNA疫苗经肌肉注射或微弹轰击等方法导入宿主体内，通过宿主细胞将疫苗携带的抗原基因表达成抗原蛋白。比之蛋白疫苗其优点是抗原蛋白在宿主体内合成，能被正确地折叠和修饰，抗原性强，由于疫苗的主要成分是DNA因此更易储存和运输。但由于进入宿主细胞的外源DNA不能在宿主细胞内复制因此能进入宿主细胞的DNA的量是除抗原自身的效价外影响疫苗效力的另一关键因素。

目前无论直接用作DNA疫苗的质粒还是用于生产抗原蛋白的质粒都是带大肠杆菌复制子的质粒，这类质粒只能在大肠杆菌中复制，由于大肠杆菌是格兰式阴性菌，含有大量内毒素，通过该菌种制备质粒最严重的问题就是产生内毒素污染，因为内毒素是重要的致热源，能产生严重毒副作用，国家食品药品监管局对其有严格的要求。此外，目前用于表达抗原蛋白的宿主细胞主要也是大肠杆菌，由大肠杆菌进行大规模抗原蛋白表达常用的纯化方法也很难避免内毒素污染，为此寻找新的更好的抗原表达质粒仍然是基因工程疫苗生产的重大攻关难题之一。

为了避免内毒素污染，最直接的方法就是避免使用大肠杆菌来生产质粒或表达蛋白，然而目前已商业化的质粒基本上全是只能在大肠杆菌内复制的质粒。棒状杆菌基于它不产生内毒素越来越受到科学工作者的青睐，谷氨酸棒状杆菌不仅已广泛用于微生物发酵工程生产谷氨酸(味精)，近年来人们也开始探讨，研发它在蛋白生产方面的应用，并受到越来越广泛的关注。然而有关棒状杆菌生物代谢和细菌复制的研究远不及大肠杆菌那样深入和全面，因而推广到市面上的能在棒状杆菌内复制的商业化载体非常少见，并且它们的拷贝能力属于中低范围，低的拷贝能力直接导致产量低下从而推高成本，很难用于大规模生产。

申请人天津大学于2019年7月15日提出了发明专利申请201910636614.1，公开了一种合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌及构建方法及应用，其构建方法为：将酿酒酵母来源的突变香叶基焦磷酸合成酶基因ERG20F96W-N127W和截短C端53个氨基酸残基的缬草来源的香叶醇合成酶基因tVoGES通过融合PCR的方法连接，同源区加入核糖体结合位点序列，插入谷氨酸棒状杆菌表达质粒pEC-XK99E的SacI和XbaI酶切位点得到质粒1；将质粒1转化进入谷氨酸棒状杆菌，得到合成香叶醇的谷氨酸棒状杆菌1；该发明为香叶醇的合成提供更多的前体，发酵时间短42-48小时，经气质检测，未检测出相应的副产物。

申请人天津科技大学于2018年4月20日提出了发明专利申请201810356892.7，公开了一种棒状杆菌诱导型启动子及含有该启动子的表达载体与应用，所述表达载体转化至谷氨酸棒状杆菌获得的5-氨基乙酰丙酸生产菌株并利用该菌株发酵法生产5-氨基乙酰丙酸。用该发明获得的启动子构建的表达载体，通过肌醇诱导实现基因的可控表达，克服了现用诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)对菌体细胞生长的抑制作用以及因其价格高昂造成的生产成本高等不足，同时具有稳定性等特性。利用该启动子整合于宿主基因组或将表达载体转化至宿主谷氨酸棒状杆菌构建获得5-氨基乙酰丙酸生产菌株，其5-氨基乙酰丙酸产量达到24.2g/L。

以上两个发明专利申请都是通过对质粒pXMJ19进行酶切并插入目的基因得到重组质粒，并将重组质粒导入至谷氨酸棒状杆菌，分别用于生产香叶醇和5-氨基乙酰丙酸，其都是上述背景技术中提到的微生物发酵工程领域的应用，并未涉及到本发明提到的用于直接合成多肽(亚单位疫苗)或合成能在宿主细胞内表达的DNA序列(DNA疫苗)领域的应用。pXMJ19在棒状杆菌的复制能力仅约20拷贝。

本发明要解决的技术问题是：如何构建一种具高拷贝复制能力的棒状杆菌复制载体。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有较髙棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法，通过在pXMJ19载体的棒状杆菌复制子调节部位，将第1786位点的核苷酸C进行人工突变，成功获得2株比pXMJ19质粒拷贝能力高6～8.5倍的棒状杆菌/大肠杆菌双用载体pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G质粒，pXMJ19C1786A拷贝数约为115，pXMJ19C1786G质粒的拷贝数约为170。

本发明的技术方案为：

一种表达质粒，所述表达质粒的第1786位点的核苷酸为A或G，其余位点与质粒pXMJ19相同；

所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

pXMJ19-C1786A序列表(SEQ ID NO:13)

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pXMJ19-C1786G序列表(SEQ ID NO:14)

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具体来说，核苷酸序列如SEQ ID NO:13的表达质粒pXMJ19C1786A构建方法为：

包括以下步骤：

步骤1：以质粒pXMJ19为模板，分别设计引物通过PCR扩增将质粒pXMJ19第1786位点的核苷酸C突变为A的长度为2282bp的DNA片段1和长度为4351bp的DNA片段2；所述引物为C1786A-F、C1786A-R、V-C1786A-F、V-C1786A-R且其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～SEQID NO:4所示；所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

pXMJ19-C1786A片段1序列表(SEQ ID NO:15，大小：2282bp)

gtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccattcggggtcgttcactggttcccctttctgatttctggcatagaagaacccccgtgaactgtgtggttccgggggttgctgatttttgcgagacttctcgcgcaattccctagcttaggtgaaaacaccatgaaacactagggaaacacccatgaaacacccattagggcagtagggcggcttcttcgtctagggcttgcatttgggcggtgatctggtctttagcgtgtgaaagtgtgtcgtaggtggcgtgctcaatgcactcgaacgtcacgtcatttaccgggtcacggtgggcaaagagaactagtgggttagacattgttttcctcgttgtcggtggtggtgagcttttctagccgctcggtaaacgcggcgatcatgaactcttggaggttttcaccgttctgcatgcctgcgcgcttcatgtcctcacgtagtgccaaaggaacgcgtgcggtgaccacgacgggcttagcctttgcctgcgcttctagtgcttcgatggtggcttgtgcctgcgcttgctgcgcctgtagtgcctgttgagcttcttgtagttgctgttctagctgtgccttggttgccatgctttaagactctagtagctttcctgcgatatgtcatgcgcatgcgtagcaaacattgtcctgcaactcattcattatgtgcagtgctcctgttactagtcgtacatactcatatttacctagtctgcatgcagtgcatgcacatgcagtcatgtcgtgctaatgtgtaaaacatgtacatgcagattgctgggggtgcagggggcggagccaccctgtccatgcggggtgtggggcttgccccgccggtacagacagtgagcaccggggcacctagtcgcggataccccccctaggtatcggacacgtaaccctcccatgtcgatgcaaatctttaacattgagtacgggtaagctggcacgcatagccaagctaggcggccaccaaacaccactaaaaattaatagtccctagacaagacaaacccccgtgcgagctacAaac

pXMJ19-C1786A片段2序列表(SEQ ID NO:16，大小：4351bp)

ccgtgcgagctacaaactcatatgcacgggggccacataacccgaaggggtttcaattgacaaccatagcactagctaagacaacgggcacaacacccgcacaaactcgcactgcgcaaccccgcacaacatcgggtctaggtaacactgagtaacactgaaatagaagtgaacacctctaaggaaccgcaggtcaatgagggttctaaggtcactcgcgctagggcgtggcgtaggcaaaacgtcatgtacaagatcaccaatagtaaggctctggcggggtgccataggtggcgcagggacgaagctgttgcggtgtcctggtcgtctaacggtgcttcgcagtttgagggtctgcaaaactctcactctcgctgggggtcacctctggctgaattggaagtcatgggcgaacgccgcattgagctggctattgctactaagaatcacttggcggcgggtggcgcgctcatgatgtttgtgggcactgttcgacacaaccgctcacagtcatttgcgcaggttgaagcgggtattaagactgcgtactcttcgatggtgaaaacatctcagtggaagaaagaacgtgcacggtacggggtggagcacacctatagtgactatgaggtcacagactcttgggcgaacggttggcacttgcaccgcaacatgctgttgttcttggatcgtccactgtctgacgatgaactcaaggcgtttgaggattccatgttttcccgctggtctgctggtgtggttaaggccggtatggacgcgccactgcgtgagcacggggtcaaacttgatcaggtgtctacctggggtggagacgctgcgaaaatggcaacctacctcgctaagggcatgtctcaggaactgactggctccgctactaaaaccgcgtctaaggggtcgtacacgccgtttcagatgttggatatgttggccgatcaaagcgacgccggcgaggatatggacgctgttttggtggctcggtggcgtgagtatgaggttggttctaaaaacctgcgttcgtcctggtcacgtggggctaagcgtgctttgggcattgattacatagacgctgatgtacgtcgtgaaatggaagaagaactgtacaagctcgccggtctggaagcaccggaacgggtcgaatcaacccgcgttgctgttgctttggtgaagcccgatgattggaaactgattcagtctgatttcgcggttaggcagtacgttctcgattgcgtggataaggctaaggacgtggccgctgcgcaacgtgtcgctaatgaggtgctggcaagtctgggtgtggattccaccccgtgcatgatcgttatggatgatgtggacttggacgcggttctgcctactcatggggacgctactaagcgtgatctgaatgcggcggtgttcgcgggtaatgagcagactattcttcgcacccactaaaagcggcataaaccccgttcgatattttgtgcgatgaatttatggtcaatgtcgcgggggcaaactatgatgggtcttgttgttggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacagacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaactccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgtcgaagctcggcggatttgtcctactcaagctgatccgacaaaatccacacattatcccaggtgtccggatcggtcaaatacgctgccagctcatagaccgtatccaaagcatccggggctgatccccggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgtggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcaccattcgatggtgtcaacgtaaatgccgcttcgccttcgcgcgcgaattgcaagctgatccgggcttatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattaattaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactct

步骤2：将步骤1得到的DNA片段1和DNA片段2进行同源重组，得到如序列表SEQ IDNO:13所述的表达质粒pXMJ19C1786A。

在上述的表达质粒的构建方法中，所述步骤1中：

DNA片段1、DNA片段2的PCR扩增方法为：

DNA聚合酶1uL，dNTP Mixture 1uL，其中dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mM，引物C1786A-R为10pmoL，引物C1786A-F为10pmoL，模板pXMJ19为30ng，缓冲液25uL，加无核酸酶灭菌水至50uL；PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共30个循环，72℃保温5min；

DNA聚合酶1uL，dNTP Mixture 1uL，其中dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mM，引物V-C1786A-F为10pmoL，引物V-C1786A-R为10pmoL，模板pXMJ19为30ng，缓冲液25uL，加无核酸酶灭菌水至50uL；PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共30个循环，72℃保温5min。

在上述的表达质粒的构建方法中，所述步骤2中，同源重组的体系为：DNA片段1加入量为DNA片段1的碱基数×0.02ng；DNA片段2加入量为DNA片段2的碱基数×0.02ng，重组酶2uL，缓冲液4uL，加无核酸酶灭菌水至20uL。

核苷酸序列如SEQ ID NO:14的表达质粒pXMJ19C1786G构建方法为：

包括以下步骤：

步骤1：以质粒pXMJ19为模板，分别设计引物通过PCR扩增将质粒pXMJ19第1786位点的核苷酸C突变为G的长度为2714bp的DNA片段3和长度为3917bp的DNA片段4；所述引物为C1786G-F、C1786G-R、V-C1786G-F、V-C1786G-R且其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:5～SEQID NO:8所示；所述DNA片段3的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述DNA片段4的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；

pXMJ19-C1786G片段3序列表(2714bp)

accgagctcgaattcagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccattcggggtcgttcactggttcccctttctgatttctggcatagaagaacccccgtgaactgtgtggttccgggggttgctgatttttgcgagacttctcgcgcaattccctagcttaggtgaaaacaccatgaaacactagggaaacacccatgaaacacccattagggcagtagggcggcttcttcgtctagggcttgcatttgggcggtgatctggtctttagcgtgtgaaagtgtgtcgtaggtggcgtgctcaatgcactcgaacgtcacgtcatttaccgggtcacggtgggcaaagagaactagtgggttagacattgttttcctcgttgtcggtggtggtgagcttttctagccgctcggtaaacgcggcgatcatgaactcttggaggttttcaccgttctgcatgcctgcgcgcttcatgtcctcacgtagtgccaaaggaacgcgtgcggtgaccacgacgggcttagcctttgcctgcgcttctagtgcttcgatggtggcttgtgcctgcgcttgctgcgcctgtagtgcctgttgagcttcttgtagttgctgttctagctgtgccttggttgccatgctttaagactctagtagctttcctgcgatatgtcatgcgcatgcgtagcaaacattgtcctgcaactcattcattatgtgcagtgctcctgttactagtcgtacatactcatatttacctagtctgcatgcagtgcatgcacatgcagtcatgtcgtgctaatgtgtaaaacatgtacatgcagattgctgggggtgcagggggcggagccaccctgtccatgcggggtgtggggcttgccccgccggtacagacagtgagcaccggggcacctagtcgcggataccccccctaggtatcggacacgtaaccctcccatgtcgatgcaaatctttaacattgagtacgggtaagctggcacgcatagccaagctaggcggccaccaaacaccactaaaaattaatagtccctagacaagacaaacccccgtgcgagctacgaact

pXMJ19-C1786G片段4序列表(3917bp)

tgcgagctacgaactcatatgcacgggggccacataacccgaaggggtttcaattgacaaccatagcactagctaagacaacgggcacaacacccgcacaaactcgcactgcgcaaccccgcacaacatcgggtctaggtaacactgagtaacactgaaatagaagtgaacacctctaaggaaccgcaggtcaatgagggttctaaggtcactcgcgctagggcgtggcgtaggcaaaacgtcatgtacaagatcaccaatagtaaggctctggcggggtgccataggtggcgcagggacgaagctgttgcggtgtcctggtcgtctaacggtgcttcgcagtttgagggtctgcaaaactctcactctcgctgggggtcacctctggctgaattggaagtcatgggcgaacgccgcattgagctggctattgctactaagaatcacttggcggcgggtggcgcgctcatgatgtttgtgggcactgttcgacacaaccgctcacagtcatttgcgcaggttgaagcgggtattaagactgcgtactcttcgatggtgaaaacatctcagtggaagaaagaacgtgcacggtacggggtggagcacacctatagtgactatgaggtcacagactcttgggcgaacggttggcacttgcaccgcaacatgctgttgttcttggatcgtccactgtctgacgatgaactcaaggcgtttgaggattccatgttttcccgctggtctgctggtgtggttaaggccggtatggacgcgccactgcgtgagcacggggtcaaacttgatcaggtgtctacctggggtggagacgctgcgaaaatggcaacctacctcgctaagggcatgtctcaggaactgactggctccgctactaaaaccgcgtctaaggggtcgtacacgccgtttcagatgttggatatgttggccgatcaaagcgacgccggcgaggatatggacgctgttttggtggctcggtggcgtgagtatgaggttggttctaaaaacctgcgttcgtcctggtcacgtggggctaagcgtgctttgggcattgattacatagacgctgatgtacgtcgtgaaatggaagaagaactgtacaagctcgccggtctggaagcaccggaacgggtcgaatcaacccgcgttgctgttgctttggtgaagcccgatgattggaaactgattcagtctgatttcgcggttaggcagtacgttctcgattgcgtggataaggctaaggacgtggccgctgcgcaacgtgtcgctaatgaggtgctggcaagtctgggtgtggattccaccccgtgcatgatcgttatggatgatgtggacttggacgcggttctgcctactcatggggacgctactaagcgtgatctgaatgcggcggtgttcgcgggtaatgagcagactattcttcgcacccactaaaagcggcataaaccccgttcgatattttgtgcgatgaatttatggtcaatgtcgcgggggcaaactatgatgggtcttgttgttggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtgatggcaggttgggcgtcgcttggtcggtcatttcgaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacagacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaactccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgtcgaagctcggcggatttgtcctactcaagctgatccgacaaaatccacacattatcccaggtgtccggatcggtcaaatacgctgccagctcatagaccgtatccaaagcatccggggctgatccccggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgtggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcaccattcgatggtgtcaacgtaaatgccgcttcgccttcgcgcgcgaattgcaagctgatccgggcttatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattaattaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattc

步骤2：将步骤1得到的DNA片段3和DNA片段4进行同源重组，得到如序列表SEQ IDNO:14所述的表达质粒pXMJ19C1786G。

在上述的表达质粒的构建方法中，所述步骤1中：

DNA片段3、DNA片段4的PCR扩增方法为：

DNA聚合酶1uL，dNTP Mixture 1uL，其中dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mM，引物C1786G-F为10pmoL，引物C1786G-R为10pmoL，模板pXMJ19为30ng，缓冲液25uL，加无核酸酶灭菌水至50uL；PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共30个循环，72℃保温5min；

DNA聚合酶1uL，dNTP Mixture 1uL，其中dATP、dCTP、dGTP和dTTP的浓度均为2.5mM，引物V-C1786G-F为10pmoL，引物V-C1786G-R为10pmoL，模板pXMJ19为30ng，缓冲液25uL，加无核酸酶灭菌水至50uL；PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共30个循环，72℃保温5min。

在上述的表达质粒的构建方法中，所述步骤2中，同源重组的体系为：DNA片段3加入量为DNA片段3的碱基数×0.02ng；DNA片段4加入量为DNA片段4的碱基数×0.02ng，重组酶2uL，缓冲液4uL，加无核酸酶灭菌水至20uL。

本发明的有益效果如下：

1、本发明通过在pXMJ19载体的棒状杆菌复制子调节部位，将第1786位点的核苷酸C进行人工突变，成功获得2株比pXMJ19质粒拷贝能力高6～8.5倍的棒状杆菌/大肠杆菌双用载体pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G质粒，与pXMJ19质粒相比，pXMJ19C1786A质粒的拷贝数约为115，pXMJ19C1786G质粒的的拷贝数约为170，并且经过突变的pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G均具备较好的稳定性。

2、本发明制备的表达质粒分别可应用于亚单位抗原的表达，使用者可根据表达的特定抗原对棒状杆菌的毒性来选择具体该使用哪一种质粒；一般来说特定抗原蛋白对宿主细菌无毒的可选用高复制力的载体拟提高抗原蛋白的表达产量，而对于那些对宿主细菌具较强毒性的则选用复制能力较低的质粒拟减轻对宿主细菌的伤害，由于这些蛋白是在棒状杆菌内产生的因此在纯化过程中能完全地避免内毒素的污染，合理地减小成本并提高产品的质量。

3、本发明制备的表达质粒中具倍高复制能力的棒状杆菌复制子可替换常用的真核细胞表达载体中的大肠杆菌复制子，可以获得能在真核细胞内表达的具高复制能力的质粒，这些质粒可用于生产DNA疫苗，由于这些质粒是在棒状杆菌内复制的因而能完全避免内毒素的污染。

附图说明

附图1为pXMJ19的质粒构造图；

附图2为实施例1中PCR扩增后产物的电泳图，其中左L1和右L1分别来自PCR扩增后产生的两个片段；

附图3为实施例1中制备的表达质粒的双酶切产物的电泳图；

附图4为实施例1中制备的表达质粒pXMJ19C1786A的构造图；

附图5为实施例2中PCR扩增后产物的电泳图，其中左L1和右L1分别来自PCR扩增后产生的两个片段；

附图6为实施例2中制备的表达质粒的双酶切产物的电泳图；

附图7为实施例2中制备的表达质粒pXMJ19C1786G的构造图；

附图8为实施例1至2中制备的表达质粒的测序验证结果图；

附图9为拷贝能力测试中PCR扩增后产物的电泳图，其中L1,L2来自pXMJ19，L3,L4来自pXMJ19C1786A，L5,L6来自pXMJ19C1786G；

附图10为拷贝能力测试中将qPCR结果用软件Grapd prism 5作的图；

附图11为稳定性测试中质粒酶切产物的电泳图，其中L1，L4代表质粒pXMJ19；L2，L5代表质粒pXMJ19C1786A；L3，L6代表质粒pXMJ19C1786G；L1～L3示MluI酶切后的产物；L4～L6示BsmB1酶切后的产物。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例主要提供质粒pXMJ19第1786位点的核苷酸C突变为A的棒状杆菌表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)以质粒pXMJ19(江南大学白仲虎实验室惠赠)为模板，其质粒构造图如附图1所示，设计引物通过PCR扩增将质粒pXMJ19第1786位点的核苷酸C突变为A的长度为2282bp的DNA片段1和长度为4351bp的DNA片段2；

所述引物的核苷酸序列如下所示：

构建DNA片段1的引物

C1786A-F：gtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatac(SEQ ID NO:1)

C1786A-R：gtttgtagctcgcacgggggtttgt(SEQ ID NO:2)

构建DNA片段2的引物

V-C1786A-F：ccgtgcgagctacaaactcatatgcac(SEQ ID NO:3)

V-C1786A-R：agagtttgtagaaacgcaaaaaggcca(SEQ ID NO:4)

所述PCR反应体系如下表1所示：

表1 PCR反应体系

表1中的Primer F为C1786A-F或V-C1786A-F；Primer R为C1786A-R或V-C1786A-R。

所述PCR反应条件为：

将PCR扩增后的产物做琼脂糖凝胶电泳，回收正确分子量的琼脂糖凝胶条带，测定浓度后备用；其PCR扩增后产物的电泳图如附图2所示，其中左L1和右L1分别来自PCR扩增后产生的两个片段，由附图2可知，左L1片段2282bp；右L1片段4351bp。

(2)胶回收后利用诺维赞同源重组试剂盒进行同源重组，得到表达质粒pXMJ19C1786A。

所述同源重组体系如下表2所示：

表2同源重组体系

DNA片段1	46ng
		DNA片段2	87ng
重组酶(诺维赞C113)	2μL
		5×CE Buffer	4μL
无核酸酶灭菌水	up to 20μL

将二片段重组后通过单菌落提取质粒DNA，重组正确的质粒使用EcoR V(Takara1042A)和NdeⅠ(Takara 1161A)双酶切应产生3944bp和2657bp的两个片段，其双酶切产物的电泳图如附图3所示，由附图3暗示该质粒可能为正确质粒pXMJ19C1786A，其构造图如附图4所示。

将实施例1制备的质粒送生工测序验证，结果如图8所示，证明实施例1制备的质粒在1786位点的核苷酸C突变成A。

实施例2

本实施例主要提供质粒pXMJ19第1786位点的核苷酸C突变为G的棒状杆菌表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)以质粒pXMJ19(江南大学白仲虎实验室惠赠)为模板，其质粒构造图如附图1所示，设计引物通过PCR扩增将质粒pXMJ19第1786位点的核苷酸C突变为G的长度为2714bp的DNA片段3和长度为3917bp的DNA片段4；

所述引物的核苷酸序列如下所示：

构建DNA片段3的引物

C1786G-F：accgagctcgaattcagcttggc(SEQ ID NO:5)

C1786G-R：agttcgtagctcgcacggg(SEQ ID NO:6)

构建DNA片段4的引物

V-C1786G-F：tgcgagctacgaactcatatgcacg(SEQ ID NO:7)

V-C1786G-R：gaattcgagctcggtacccgg(SEQ ID NO:8)

所述PCR反应体系如下表1所示：

表1 PCR反应体系

所述PCR反应条件为：

将PCR扩增后的产物做琼脂糖凝胶电泳，回收正确分子量的琼脂糖凝胶条带，测定浓度后备用；其PCR扩增后产物的电泳图如附图5所示，其中左L1和右L1分别来自PCR扩增后产生的两个片段，由附图5可知，左L1片段2714bp；右L1片段3917bp。

(2)胶回收后利用诺维赞同源重组试剂盒进行同源重组，得到表达质粒pXMJ19C1786G。

所述同源重组体系如下表2所示：

表2同源重组体系

将二片段重组后通过单菌落提取质粒DNA，重组正确的质粒使用EcoR V(Takara1042A)和NdeⅠ(Takara 1161A)双酶切应产生3944bp和2657bp的两个片段，其双酶切产物的电泳图如附图6所示。附图6的结果暗示该质粒可能为正确质粒pXMJ19C1786G，其构造图如附图7所示。

将实施例2制备的质粒送生工测序验证，结果如图8所示，证明实施例2制备的质粒在1786位点的核苷酸C已突变成G。

性能测试

一、质粒pXMJ19、pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G在棒状杆菌的拷贝能力测试

1、分别电转pXMJ19、pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G至谷氨酸棒状杆菌ATCC13032野生型菌株，具体方法如下：

(1)取100ng质粒(质粒pXMJ19、pXMJ19C1786A或pXMJ19C1786G)加入100uL自制的棒状杆菌感受态细胞，冰浴10min后转入0.1cm电转杯；

(2)1800Kv电击5ms；

(3)立即加入1mL 46℃预热的LBHIS培养液(详见LBHIS配制方法)，46℃水浴6min(不要摇晃)，转入30℃摇床200rpm摇菌2h；

(4)涂布于含有5ug/mL氯霉素抗性培养皿培养12h；

感受态细胞恢复培养基LBHIS配方如下：(g/L)

酵母粉2.5，胰蛋白胨5.0，氯化钠5.0，脑心浸液18.5，山梨醇90.0,pH 6.8-7.0去离子水定容至1L,121℃高压灭菌。

制作感受态细胞的方法

(1.)从新鲜平板挑取2-3个单个菌落在10ml BHI培养基中30℃过夜培养，同时添加终浓度为2％的葡萄糖。

(2.)在500mL摇瓶中加入100mL EPO培养液(建议EPO提前37度预热)，接种上述菌种2ml，30℃，200rpm，培养3-5h.使OD₆₀₀约0.35.

(3.)将摇瓶里的感受态细胞转移到50mL离心管中，冰浴30min.

(4.)4000rpm 4℃离心10min,弃上清。

(5.)用30mL冰上预冷的TG缓冲液(1M Tris-HCL,pH 7.5+10％甘油)充分洗涤1次，4000rpm 4℃离心10min,弃上清。

(6.)加预冷的10％甘油重复洗涤2次。

(7.)最后用1ml10％甘油重悬，分装每管100ul每管，液氮快速冷冻后置-80℃保存。

BHI培养基：(g/L)(环凯微生物货号024053)

蛋白胨10.0，脱水小牛脑浸粉12.5，脱水牛心浸粉5.0，氯化钠5.0，葡萄糖2.0，磷酸氢二钠2.5,PH＝7.4±0.2.

EPO培养基配方：(g/L)

酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，氯化钠10.0，甘氨酸25.0，异烟肼5.0，Tween80 1mL，

pH 6.8-7.0，去离子水定容至1L,121℃高压灭菌。

试剂	品牌	货号
			酵母粉	OXOID	LP0021
胰蛋白胨	OXOID	LP0042
			氯化钠	大茂	7647-14-5
甘氨酸	sigma	G8898
			异烟肼	sigma	MKBQ8553V
Tween 80	scientific research special	9005-65-6

2、提取总DNA(包括细菌DNA和质粒DNA)，具体方法如下：

(1)在LB培养基中过夜培养3mL谷氨酸棒状杆菌；

(2)收集不大于3mL的菌液，室温、4000×g离心10min，沉淀细菌；

(3)弃培养基，加入100uL的TE Buffer重悬细菌，然后加入10uL Lysozyme(溶菌酶)，37℃水浴30min；

(4)加25mg的玻璃珠，在室温条件下高速涡旋5min,静置让玻璃珠沉淀下来，转移上清液至新的1.5mL的离心管中；

(5)加入100uL BTL Buffer(Omega BTL buffer 101QG)和20uL Proteinase KSolution涡旋混匀，将样品放置在55℃水浴摇床中使细胞完全裂解，一般1小时左右；

(6)加入5uL RNase A(全式金GE101-01)并反复颠倒混匀，在室温条件下孵育5min；

(7)室温条件下，10000×g离心2min，沉淀不溶解的物质，转移上清液到新的离心管中；

(8)加入220uL BDL Buffer涡旋混匀，65℃孵育10min；

(9)加入220uL 96％～100％的无水乙醇，高速涡旋20秒，如有沉淀出现，用枪头反复吹打以破碎沉淀；

(10)将

DNA Mini结合柱套在一个2mL收集管上，将步骤(9)得到的所有液体转至于柱子內，室温10000×g离心1min，弃收集管和滤液；

(11)将

DNA Mini结合柱套在新的2mL收集管上，加入500uL的HBCBuffer，室温10000×g离心1min，弃滤液；

(12)将

DNA Mini结合柱套在同一个2mL收集管上，加入700uL DNA WashBuffer，室温10000×g离心1min，弃滤液；

(13)重复步骤(12)；

(14)将

DNA Mini结合柱套在同一个2ml收集管上，高速离心2min(≥10000×g)以干燥

DNA Mini结合柱的基质，该步骤是用来除去可能会影响下游实验的乙醇；

(15)将

DNA Mini结合柱套在1.5ml离心管上，加入50～100uL预热至65℃的Elution Buffer，室温下放置3～5min；

(16)室温10000×g离心1min，洗脱基因组DNA；

(17)重复步骤(15)和(16)，加入预热至65℃的Elution Buffer，进行二次洗脱以提高产率；

3、通过荧光定量PCR测定质粒的相对复制能力

(1)选择以下引物进行荧光定量PCR测定质粒pXMJ19、pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G的相对复制能力，所述引物的核苷酸序列如下所示：

用于测定棒状杆菌内源DNA的引物是

A(DnaA_1F)：ggtcgatgacatccagttcc(SEQ ID NO:9)

A(DnaA_1R)：gcttatctgcctggtgcaat(SEQ ID NO:10)

用于测定质粒DNA的引物是

C(p_3_F)：tgcgtggataaggctaagga(SEQ ID NO:11)

C(p_3_R)：tccccatgagtaggcagaac(SEQ ID NO:12)

由于测定质粒DNA的引物位于质粒pXMJ19、pXMJ19C1786A和pXMJ19C1786G的共享区，因此可以通用。

(2)反应液的配制：

每个样品做3个平行孔，总体系配好之后，用枪吸打混匀，然后每管分装20uL至八联管中，加Dye发光液时避免强光直射；将10ng样品总DNA用灭菌纯水梯度稀释至10-3和10-4，相当于10pg/uL和1pg/uL即可加入至刚配好的反应体系中；将各排八联管在掌上离心机离心数秒；

(3)上机qPCR反应体条件如下：

将扩增后的PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，结果如附图9所示，产物为140bp；

L1，L2来自pXMJ19，L3，L4来自pXMJ19C1786A，L5，L6来自pXMJ19C1786G；

将qPCR结果通过用2-△△Ct定量，将质粒DNA的Ct值除以基因组DNA的Ct值，计算出各组之间的差异倍数，再用pXMJ19的拷贝数乘以差异倍数即得到相对的质粒拷贝数。

其结果为pXMJ19C1786A的拷贝数为115.6，pXMJ19C1786G的拷贝数为170。用软件Grapd prism 5作图如附图10所示。

4、通过质粒提取质粒DNA验证上述质粒的复制能力

用革兰氏阳性菌DNA提取试剂盒(M2350)分别从10mL上述菌液提取质粒DNA并测定其含量，其结果与上述qPCR结果吻合，进一步证明上述在1786位点的突变能提高pXMJ19的复制能力。

二、质粒在棒状杆菌的稳定性测试

用MluI和BsmB1限制性内切酶对质粒pXMJ19、pXMJ19C1786A、pXMJ19C1786G和作酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳比较其产物DNA片段的大小，得到的质粒酶切产物的电泳图如附图11所示，其中其中L1，L4代表质粒pXMJ19；L2，L5代表质粒pXMJ19C1786A；L3，L6代表质粒pXMJ19C1786G；L1～L3示MluI酶切后的产物；L4～L6示BsmB1酶切后的产物，其结果显示这些突变株与其母体pXMJ19的酶切结果没有差别，间接证明在1786位点的点突变没有对质粒构成明显不稳定的因素。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gtttctacaa actcttttgt ttatttttct aaatac 36

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gtttgtagct cgcacggggg tttgt 25

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccgtgcgagc tacaaactca tatgcac 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

agagtttgta gaaacgcaaa aaggcca 27

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

accgagctcg aattcagctt ggc 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

agttcgtagc tcgcacggg 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tgcgagctac gaactcatat gcacg 25

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gaattcgagc tcggtacccg g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ggtcgatgac atccagttcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gcttatctgc ctggtgcaat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

tgcgtggata aggctaagga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

tccccatgag taggcagaac 20

<210> 13

<211> 6601

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

attcggggtc gttcactggt tcccctttct gatttctggc atagaagaac ccccgtgaac 60

tgtgtggttc cgggggttgc tgatttttgc gagacttctc gcgcaattcc ctagcttagg 120

tgaaaacacc atgaaacact agggaaacac ccatgaaaca cccattaggg cagtagggcg 180

gcttcttcgt ctagggcttg catttgggcg gtgatctggt ctttagcgtg tgaaagtgtg 240

tcgtaggtgg cgtgctcaat gcactcgaac gtcacgtcat ttaccgggtc acggtgggca 300

aagagaacta gtgggttaga cattgttttc ctcgttgtcg gtggtggtga gcttttctag 360

ccgctcggta aacgcggcga tcatgaactc ttggaggttt tcaccgttct gcatgcctgc 420

gcgcttcatg tcctcacgta gtgccaaagg aacgcgtgcg gtgaccacga cgggcttagc 480

ctttgcctgc gcttctagtg cttcgatggt ggcttgtgcc tgcgcttgct gcgcctgtag 540

tgcctgttga gcttcttgta gttgctgttc tagctgtgcc ttggttgcca tgctttaaga 600

ctctagtagc tttcctgcga tatgtcatgc gcatgcgtag caaacattgt cctgcaactc 660

attcattatg tgcagtgctc ctgttactag tcgtacatac tcatatttac ctagtctgca 720

tgcagtgcat gcacatgcag tcatgtcgtg ctaatgtgta aaacatgtac atgcagattg 780

ctgggggtgc agggggcgga gccaccctgt ccatgcgggg tgtggggctt gccccgccgg 840

tacagacagt gagcaccggg gcacctagtc gcggataccc cccctaggta tcggacacgt 900

aaccctccca tgtcgatgca aatctttaac attgagtacg ggtaagctgg cacgcatagc 960

caagctaggc ggccaccaaa caccactaaa aattaatagt ccctagacaa gacaaacccc 1020

cgtgcgagct acaaactcat atgcacgggg gccacataac ccgaaggggt ttcaattgac 1080

aaccatagca ctagctaaga caacgggcac aacacccgca caaactcgca ctgcgcaacc 1140

ccgcacaaca tcgggtctag gtaacactga gtaacactga aatagaagtg aacacctcta 1200

aggaaccgca ggtcaatgag ggttctaagg tcactcgcgc tagggcgtgg cgtaggcaaa 1260

acgtcatgta caagatcacc aatagtaagg ctctggcggg gtgccatagg tggcgcaggg 1320

acgaagctgt tgcggtgtcc tggtcgtcta acggtgcttc gcagtttgag ggtctgcaaa 1380

actctcactc tcgctggggg tcacctctgg ctgaattgga agtcatgggc gaacgccgca 1440

ttgagctggc tattgctact aagaatcact tggcggcggg tggcgcgctc atgatgtttg 1500

tgggcactgt tcgacacaac cgctcacagt catttgcgca ggttgaagcg ggtattaaga 1560

ctgcgtactc ttcgatggtg aaaacatctc agtggaagaa agaacgtgca cggtacgggg 1620

tggagcacac ctatagtgac tatgaggtca cagactcttg ggcgaacggt tggcacttgc 1680

accgcaacat gctgttgttc ttggatcgtc cactgtctga cgatgaactc aaggcgtttg 1740

aggattccat gttttcccgc tggtctgctg gtgtggttaa ggccggtatg gacgcgccac 1800

tgcgtgagca cggggtcaaa cttgatcagg tgtctacctg gggtggagac gctgcgaaaa 1860

tggcaaccta cctcgctaag ggcatgtctc aggaactgac tggctccgct actaaaaccg 1920

cgtctaaggg gtcgtacacg ccgtttcaga tgttggatat gttggccgat caaagcgacg 1980

ccggcgagga tatggacgct gttttggtgg ctcggtggcg tgagtatgag gttggttcta 2040

aaaacctgcg ttcgtcctgg tcacgtgggg ctaagcgtgc tttgggcatt gattacatag 2100

acgctgatgt acgtcgtgaa atggaagaag aactgtacaa gctcgccggt ctggaagcac 2160

cggaacgggt cgaatcaacc cgcgttgctg ttgctttggt gaagcccgat gattggaaac 2220

tgattcagtc tgatttcgcg gttaggcagt acgttctcga ttgcgtggat aaggctaagg 2280

acgtggccgc tgcgcaacgt gtcgctaatg aggtgctggc aagtctgggt gtggattcca 2340

ccccgtgcat gatcgttatg gatgatgtgg acttggacgc ggttctgcct actcatgggg 2400

acgctactaa gcgtgatctg aatgcggcgg tgttcgcggg taatgagcag actattcttc 2460

gcacccacta aaagcggcat aaaccccgtt cgatattttg tgcgatgaat ttatggtcaa 2520

tgtcgcgggg gcaaactatg atgggtcttg ttgttggcgt cccggaaaac gattccgaag 2580

cccaaccttt catagaaggc ggcggtggaa tcgaaatctc gtgatggcag gttgggcgtc 2640

gcttggtcgg tcatttcgaa gggcaccaat aactgcctta aaaaaattac gccccgccct 2700

gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac 2760

agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat 2820

atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa 2880

aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt 2940

tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa 3000

actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat 3060

ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg 3120

ccatacggaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat 3180

aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg 3240

tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc 3300

attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag 3360

ctcctgaaaa tctcgtcgaa gctcggcgga tttgtcctac tcaagctgat ccgacaaaat 3420

ccacacatta tcccaggtgt ccggatcggt caaatacgct gccagctcat agaccgtatc 3480

caaagcatcc ggggctgatc cccggcgcca gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg 3540

gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgt 3600

ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga 3660

gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga 3720

ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt 3780

gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca 3840

gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc 3900

agccagacgc agacgcgccg agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg 3960

gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat 4020

aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca 4080

ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact 4140

gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc 4200

taccatcgac accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac 4260

aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg 4320

tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc 4380

ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac 4440

ggtctgataa gagacaccgg catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt 4500

caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgca 4560

ccattcgatg gtgtcaacgt aaatgccgct tcgccttcgc gcgcgaattg caagctgatc 4620

cgggcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 4680

tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 4740

gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 4800

gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 4860

cacacaggaa acagaattaa ttaagcttgc atgcctgcag gtcgactcta gaggatcccc 4920

gggtaccgag ctcgaattca gcttggctgt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg 4980

atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt 5040

agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat 5100

ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa 5160

ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct 5220

gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg 5280

gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac 5340

ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 5400

tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 5460

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cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg 3780

agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 3840

tcacacagga aacagaatta attaagcttg catgcctgca ggtcgactct agaggatccc 3900

cgggtaccga gctcgaattc agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct 3960

gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag 4020

tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga 4080

tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa 4140

aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc 4200

tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt 4260

ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga 4320

cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc t 4351

<210> 17

<211> 2714

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

accgagctcg aattcagctt ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac 60

agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg 120

cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta 180

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cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 300

aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg 360

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ggcctttttg cgtttctaca aactcttttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 480

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 540

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 600

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 660

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 720

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atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 900

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 960

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 1020

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cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 1200

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tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 1380

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aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 1620

tttggggtgg gcgaagaact ccagcatgag atccccgcgc tggaggatca tccagccatt 1680

cggggtcgtt cactggttcc cctttctgat ttctggcata gaagaacccc cgtgaactgt 1740

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tcttcgtcta gggcttgcat ttgggcggtg atctggtctt tagcgtgtga aagtgtgtcg 1920

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ctcggtaaac gcggcgatca tgaactcttg gaggttttca ccgttctgca tgcctgcgcg 2100

cttcatgtcc tcacgtagtg ccaaaggaac gcgtgcggtg accacgacgg gcttagcctt 2160

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tagtagcttt cctgcgatat gtcatgcgca tgcgtagcaa acattgtcct gcaactcatt 2340

cattatgtgc agtgctcctg ttactagtcg tacatactca tatttaccta gtctgcatgc 2400

agtgcatgca catgcagtca tgtcgtgcta atgtgtaaaa catgtacatg cagattgctg 2460

ggggtgcagg gggcggagcc accctgtcca tgcggggtgt ggggcttgcc ccgccggtac 2520

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<210> 18

<211> 3917

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tgcgagctac gaactcatat gcacgggggc cacataaccc gaaggggttt caattgacaa 60

ccatagcact agctaagaca acgggcacaa cacccgcaca aactcgcact gcgcaacccc 120

gcacaacatc gggtctaggt aacactgagt aacactgaaa tagaagtgaa cacctctaag 180

gaaccgcagg tcaatgaggg ttctaaggtc actcgcgcta gggcgtggcg taggcaaaac 240

gtcatgtaca agatcaccaa tagtaaggct ctggcggggt gccataggtg gcgcagggac 300

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tctcactctc gctgggggtc acctctggct gaattggaag tcatgggcga acgccgcatt 420

gagctggcta ttgctactaa gaatcacttg gcggcgggtg gcgcgctcat gatgtttgtg 480

ggcactgttc gacacaaccg ctcacagtca tttgcgcagg ttgaagcggg tattaagact 540

gcgtactctt cgatggtgaa aacatctcag tggaagaaag aacgtgcacg gtacggggtg 600

gagcacacct atagtgacta tgaggtcaca gactcttggg cgaacggttg gcacttgcac 660

cgcaacatgc tgttgttctt ggatcgtcca ctgtctgacg atgaactcaa ggcgtttgag 720

gattccatgt tttcccgctg gtctgctggt gtggttaagg ccggtatgga cgcgccactg 780

cgtgagcacg gggtcaaact tgatcaggtg tctacctggg gtggagacgc tgcgaaaatg 840

gcaacctacc tcgctaaggg catgtctcag gaactgactg gctccgctac taaaaccgcg 900

tctaaggggt cgtacacgcc gtttcagatg ttggatatgt tggccgatca aagcgacgcc 960

ggcgaggata tggacgctgt tttggtggct cggtggcgtg agtatgaggt tggttctaaa 1020

aacctgcgtt cgtcctggtc acgtggggct aagcgtgctt tgggcattga ttacatagac 1080

gctgatgtac gtcgtgaaat ggaagaagaa ctgtacaagc tcgccggtct ggaagcaccg 1140

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ttggtcggtc atttcgaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc 1680

cactcatcgc agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag 1740

acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat 1800

ttgcccatgg tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa 1860

ctggtgaaac tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta 1920

gggaaatagg ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac 1980

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atacggaact ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa 2160

aacttgtgct tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc 2220

tggttatagg tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat 2280

tgggatatat caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct 2340

cctgaaaatc tcgtcgaagc tcggcggatt tgtcctactc aagctgatcc gacaaaatcc 2400

acacattatc ccaggtgtcc ggatcggtca aatacgctgc cagctcatag accgtatcca 2460

aagcatccgg ggctgatccc cggcgccagg gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc 2520

aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgtgg 2580

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cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg 2760

gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg gcactccagt 2820

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ccagacgcag acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt 2940

gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa 3000

tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg 3060

cagcttccac agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc agcccactga 3120

cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta 3180

ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa 3240

tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt 3300

tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt 3360

ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg 3420

tctgataaga gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt ttcacattca 3480

ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag gttttgcacc 3540

attcgatggt gtcaacgtaa atgccgcttc gccttcgcgc gcgaattgca agctgatccg 3600

ggcttatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg 3660

gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt 3720

tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc 3780

tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 3840

cacaggaaac agaattaatt aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccgg 3900

gtaccgagct cgaattc 3917

Claims (1)

1.一种表达质粒，其特征在于，所述表达质粒的第1786位点的核苷酸为A或G，其余位点与质粒pXMJ19相同；

所述表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

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