CN101693901A - 一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明的表达载体pDXW-8，能在大肠杆菌和棒状杆菌中复制并稳定存在，含有一个在大肠杆菌和棒状杆菌中皆具有转录启动功能的tac启动子，及转录终止功能的终止子rrnBT1T2；含有一个用于棒状杆菌转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因；含有一个用于严谨控制tac启动子表达的负调控基因lacIPF104；含有一个包含11个单一的限制性内切酶切点的多克隆位点MCS。在棒状杆菌中，该载体表达外源蛋白的水平适中，尤其适用于棒状杆菌代谢工程的研究。
Description
技术领域
一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8及其构建方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术
棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，属于具有中度到高GC含量的放线菌。自人们首次分离谷氨酸棒状杆菌生产L-谷氨酸以来(Kinoshita等，1957年)，棒状杆菌的三个主要代表：谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌，和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸。这里特别指出，通过DNA-DNA杂交实验发现，这三个不同物种之间只有很小的差别(Liebl等，1991)。
由于已累计了大量的关于谷氨酸棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识(Eggeling and Bott，2005；Burkovski，2008)，代谢工程已经取代经典的随机突变，成为棒状杆菌菌种改良的主要策略。
可应用于棒状杆菌的载体系统的构建，是生产菌株的代谢工程改良以及棒状杆菌基础研究的基础。目前，已经有一些可以应用于棒状杆菌的表达载体(Eggeling and Bott，2005)。根据不同的棒状杆菌复制子，我们把这些表达载体分为四组。第一组包括pEKEx1和pXMJ19，其复制子来自质粒pBL1；第二组包括pVWEx1和pZ8-1，其复制子来自质粒pHM1519；第三组包括pECTAC-K99，pECTAC-XK99E，pECTAC-XC99E和pECTAC-XT99A，其复制子来自质粒pHM1519；第四组包括pAPE12，其复制子来自质粒pNG2。所有这些载体都有两个缺点：一是在多克隆位点处含有较少的单限制酶酶切位点，另一是基因组成型表达或在lacIq的控制下进行诱导表达。
应用代谢工程进行菌种改良时，我们将经常要共表达来自同一个生物合成或降解途径的多个基因。携带许多限制性内切酶的多基因大片段DNA可能不能被克隆到含较少单限制酶酶切位点的多克隆位点处(Radmacher等，2002)。此外，在棒状杆菌中，lacIq启动子不能很有效地行使转录功能，从而导致tac启动子不能被严谨控制(Billman-Jacobe等，1994)。在本发明中，我们构建了新型棒状杆菌表达载体pDXW-8，新的载体改善了多克隆位点的切点数目，并且用lacIPF104取代了lacIq，能对基因的表达进行严谨控制。作为一个引用例子，我们在黄色短杆菌中成功地应用pDXW-8表达了编码透明颤菌血红蛋白(VHb)的vhb基因(Khosla and Bailey，1988)。
发明内容
本发明的目的是构建一种在大肠杆菌和棒状杆菌中能表达外源基因的表达载体，最终能使外源基因在此载体相关元件的控制下，在大肠杆菌和棒状杆菌中实现诱导表达。
本发明的技术方案：一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。
表达载体pDXW-8，含有一个在大肠杆菌和棒状杆菌中具有转录启动功能的tac启动子；从79位到18位；
含有在大肠杆菌和棒状杆菌中具有转录终止功能的终止子rrnBT1T2，分别从9272到9229位，及从9097到9070位；
含有用于棒状杆菌转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因，从413位到1228位；
含有使质粒能在棒状杆菌宿主中复制并稳定存在的rep片段，从1635位到4320位。
含有用于严谨控制tac启动子表达的负调控基因lacIPF104，从6985到5903位，其携带的外源启动子PF104及SD序列，PF104及SD序列核苷酸序列为cagcgtattt gaccgatccg gacacctggg ataatgtgtg gattttgtcg 
tg gtgaat，其中，划线部分为启动子PF104序列，加框部分为SD序列。
含有用于克隆外源基因的人工合成的74bp多克隆位点MCS，从9546位到9478位，包含如下11个单一的限制性内切酶切点EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII，其核苷酸序列为gaattcgctagcgagctccc atgggcggcc gcctcgaggg taccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt。
表达载体pDXW-8的构建方法：
首先，以质粒pET-28a为模板，kan-F和kan-R为引物，通过PCR扩增1023bp的卡那霉素抗性基因。在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶SgrAI酶切位点。PCR产物用SgrAI酶切，pKK223-3同样用SgrAI酶切，用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化；两者连接，由此产生的质粒大小为5617bp，命名为pDXW-5。
第二步，以质粒pC2为模板，rep-F和rep-R为引物，通过PCR扩增2686bp的rep片段。rep片段与质粒的复制相关，最初来源于乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)隐蔽质粒pBLI(Fernandez-Gonzalez et al.，1994)。在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶PshAI酶切位点。PCR产物用PshAI酶切，并连接到同样用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-5。由此产生的质粒大小为8313bp，命名为为pDXW-6。为了证明rep片段和卡那基因片段在棒状杆菌中的功能，我们用质粒pDXW-6转化黄色短杆菌B.flavum，并选择卡那霉素抗性克隆。
第三步，以质粒pET-28a为模板，携带PF104序列正向引物lacI-F，反向引物lacI-R为引物，通过PCR扩增1191bp的lacIPF104基因。在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位点。PCR产物用EcoRI和HindIII双切，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切后的pDXW-6。由此产生的质粒大小为9510bp命名为pDXW-7。
第四步，人工合成了74bp的多克隆位点MCS的DNA片段5′gaattcgctagcgagctccc atgggcggcc gcctcgaggg taccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt 3’，它包含有11个单一的限制性内切酶切点(EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII)，用EcoRI和HindIII双切74bp的多克隆位点MCS片段，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切的pDXW-7上，以取代pDXW-7原有的多克隆位点。对新构建的质粒MCS及其两翼进行测序，以验证MCS是否正确连接到pDXW-7上。构建的质粒大小为9548bp，并命名为pDXW-8。
最后，以质粒pDXW-8为模板，分别用引物对Kan/rep-D/kan-F，Kan/rep-D/Kan-R，Kan/rep-D/rep-F，Kan/rep-D/rep-R，lacI-D/lacI-F，和lacI-D/lacI-R进行DNA片段的PCR扩增，鉴定了质粒pDXW-8上kan插入方向为正向插入，rep和lacIPF104片段的插入方向均为反向插入。以上所述的扩增引物，扩增条件详见实施例1。
本发明的有益效果：
1、本发明表达载体在大肠杆菌和棒状杆菌中皆具有表达外源基因的能力。
2、本发明的表达载体，它的MCS包含多达11个单限制性内切酶切点，能有效地克隆大片段DNA。
3、本发明的表达载体，控制基因应用了lacIPF104，使外源基因无论是在大肠杆菌，还是在棒状杆菌中的表达，都受到严谨调控。
4、本发明的表达载体pDXW-8，其tac启动子在棒状杆菌中活性相对较低，尤其适用与棒状杆菌生产次生代谢产物的代谢工程研究。
生物材料样品保藏
大肠杆菌JM109(pDXW-8){Escherichia coli JM109(pDXW-8)}已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号CCTCC NO：M 209199，保藏日期2009年9月11日。
附图说明
图1表达载体pDXW-8的构建过程图。
图2表达载体pDXW-8的物理图谱。
具体实施方式
实施例1表达载体pDXW-8的构建
表达载体pDXW-8的构建过程如图1所示。我们用大肠杆菌表达载体pKK-223-3作为构建目的载体的母质粒，pKK-223-3携带tac启动子，rrnBT1T2终止子，二者在棒状杆菌中都能有效地行使功能(Srivastava and Deb，2005)。在大肠杆菌JM109和棒状杆菌中，在诱导剂IPTG存在的情况下，可失活LacI阻遏蛋白，pKK-223-3携带的靶基因可进行诱导表达。
由于棒状杆菌对氨苄青霉素不敏感，我们向pKK223-3上引进了卡那霉素抗性基因kan作为选择标记在棒状杆菌对。以质粒pET-28a为模板，kan-F和kan-R为引物，通过PCR扩增1023bp的卡那霉素抗性基因。在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶SgrAI酶切位点。PCR产物用SgrAI酶切，并连接到同样用SgrAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pKK223-3。由此产生的质粒大小为5617bp，命名为pDXW-5。
以质粒pC2为模板，rep-F和rep-R为引物，通过PCR扩增2686bp的rep片段。rep片段与质粒的复制相关，最初来源于乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)隐蔽质粒pBLI(Fernandez-Gonzalez et al.，1994)。在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶PshAI酶切位点。PCR产物用PshAI酶切，并连接到同样用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-5。由此产生的质粒大小为8313bp，命名为pDXW-6。为了证明rep片段和卡那基因片段在棒状杆菌中的功能，我们用质粒pDXW-6转化黄色短杆菌B.flavum，选择卡那霉素抗性克隆。
为了在棒状杆菌中调节靶基因的表达，我们向质粒pDXW-6中引进lacI基因。棒状杆菌中有关启动子功能的信息表明，革兰氏阴性菌启动子与棒状杆菌启动子可能略有不同(Pátek et al.，2003)。载体pET-28a的lacI是lacIq版本，在大肠杆菌中，其LacI阻遏蛋白产量足以抑制tac启动子的表达；但在棒状杆菌中，lacIq启动子不能非常有效的转录，从而导致在棒状杆菌中，tac启动子不能被严谨地控制(Billman-Jacobe et al.，1994)。分离自棒状杆菌噬菌体ΦGA1的启动子片段PF104(GenBank登录号X90367)可以在棒状杆菌中很好地工作(Pátek et al.，1996)。在这里，我们提出lacIPF104版的lacI，lacIPF104使用启动子PF104。以质粒pET-28a为模板，携带PF104序列正向引物lacI-F，和反向引物lacI-R为引物，通过PCR扩增1191bp的lacIPF104基因。在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位点。PCR产物用EcoRI和HindIII双切，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切后的pDXW-6。由此产生的质粒大小为9510bp命名为pDXW-7。
插入kan，rep和lacIPF104片段后，pKK223-3上的多克隆位点只包含EcoRI和HindIII两个单限制酶切点。为了改善单限制性内切酶切点数，我们人工合成了74bp的多克隆位点DNA片段5′gaattcgcta gcgagctccc atgggcggcc gcctcgagggtaccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt 3’，它包含有11个单一的限制性内切酶切点(EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII)，用EcoRI和HindIII双切74bp的多克隆位点MCS片段，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切的pDXW-7上，以取代pDXW-7原有的多克隆位点。我们对新构建的质粒MCS及其两翼进行测序，以验证MCS是否正确连接到pDXW-7上，构建的质粒大小为9548bp，并命名为pDXW-8。
以质粒pDXW-8为模板，分别用引物对Kan/rep-D/kan-F，Kan/rep-D/Kan-R，Kan/rep-D/rep-F，Kan/rep-D/rep-R，lacI-D/lacI-F；和lacI-D/lacI-R进行DNA片段的PCR扩增，鉴定了质粒pDXW-8上kan插入方向为正向插入，rep和lacIPF104片段的插入方向均为反向插入。
构建过程中使用的引物序列见表1，PCR反应条件见表2，表达载体pDXW-8的物理图谱见图2。
表1.本发明所用引物及其序列(划线部分为酶切位点)
表2.本发明中PCR反应相关信息
| PCR反应 | 引物1 | 引物2 | 退火温度(℃) | 延伸时间(s) | 产物长度(bp) | 反应目的 |
| 1 | kan-F | kan-R | 57 | 75 | 1023 | 扩增kan基因 |
| 2 | rep-F | rep-R | 61 | 165 | 2686 | 扩增rep片段 |
| 3 | lacI-F | lacI-R | 59 | 75 | 1191 | 扩增lacIPF104基因 |
| 4 | Kan/rep-D | Kan-R | 57 | 75 | 1243 | 确定kan基因正向插入 |
| 5 | Kan/rep-D | Kan-F | 57 | 75 | 1243 | 确定kan基因反向插入 |
| 6 | Kan/rep-D | rep-R | 57 | 255 | 4199 | 确定rep片段正向插入 |
| 7 | Kan/rep-D | rep-F | 57 | 255 | 4199 | 确定rep片段反向插入 |
| 8 | lacI-D | lacI-R | 59 | 105 | 1585 | 确定lacIPF104基因正向插入 |
| 9 | lacI-D | lacI-F | 59 | 105 | 1585 | 确定lacIPF104基因反向插入 |
| 10 | vhb-F | vhb-R | 55 | 30 | 441 | 扩增vhb基因 |
实施例2质粒pDXW-8在大肠杆菌及黄色短杆菌中的应用性评价
为了证明pDXW-8的可用性，我们在大肠杆菌中及黄色短杆菌中对vhb基因进行表达。以质粒pMD-18-T-vhb为模板，带有SD序列的引物vhb-F和vhb-R为引物，通过PCR扩增441bp vhb基因的开放阅读框。在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位点。PCR产物用EcoRI和HindIII双切，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切后的pDXW-8，产生的重组质粒pDXW-8-vhb。
1mL过夜培养的大肠杆菌JM109接种到30mL的LB培养基中，JM109(pDXW-8)及JM109(pDXW-8-vhb)分别接种到30mL的含卡那霉素的LB培养基中。同样地，1mL过夜培养的黄色短杆菌B.flavum接种到30mL的LBG培养基中，黄色短杆菌B.flavum(pDXW-8)和黄色短杆菌B.flavum(pDXW-8-vhb)分别接种到补充卡那霉素的30mL LBG培养基中。上述30mL培养物生长到在600nm光密度为0.6时，加入终浓度为1m mol/L的诱导剂IPTG。4h后，离心收获细胞并悬浮在5mL磷酸盐缓冲液(100m mol/L、pH7.8)中。在1％的SDS条件下，细胞煮沸5分钟，裂解物用于SDS-PAGE分析。用ConstantCell Disruption Systems(Constant Systems，Daventry，UK)，在20KPSI条件下，破碎细胞，离心除去细胞碎片，粗提物用于VHb蛋白的生物活性分析。此外，为了检查tac启动子是否被lacIPF104严谨控制，在不添加诱导剂条件下，30mL黄色短杆菌B.flavum(pDXW-8-vhb)生长。收获细胞和制备粗提物方法同上。
大肠杆菌JM109，JM109(pDXW-8)，JM109(pDXW-8-vhb)，黄色短杆菌B.flavum，B.flavum(pDXW-8)和B.flavum(pDXW-8-vhb)细胞裂解液分别进行SDS-PAGE分析(Ausubel et al.，1995)。大肠杆菌细胞裂解液SDS-PAGE分析结果表明，存在着一个特异性的蛋白带，其分子量约为16kD，这和据氨基酸序列预测的VHb分子量相一致。但在B.flavum(pDXW-8-vhb)的SDS-PAGE中，没有呈现出特异性的VHb蛋白条带。
为了进一步证明vhb基因的表达，我们应用CO差光谱法(Webster and Liu，1974)，分别对上述六个菌株粗提物进行了VHb的生物活性检测。对IPTG诱导的大肠杆菌JM109，大肠杆菌JM109(pDXW-8)，B.flavum和B.flavum(pDXW-8)粗提物的VHb活性进行CO差光谱分析，我们没有观察到VHb活性的CO差光谱。对IPTG诱导的大肠杆菌JM109(pDXW-8-vhb)和B.flavum(pDXW-8-vhb)粗提物的VHb活性进行CO差光谱分析，都观察到了VHb活性的CO差光谱，二者在420nm处都呈现出一个峰。峰值表明，在大肠杆菌JM109(pDXW-8)中，vhb基因诱导表达水平非常高，在所述测定条件，每mL 100mg湿重菌体含量的细胞裂解液上清液在600nm条件下光吸收达0.522；在B.flavum(pDXW-8)中，vhb基因诱导表达水平相对较低，为0.012。对非IPTG诱导的B.flavum(pDXW-8-vhb)粗提物，我们没有观察到VHb活性的CO差光谱，这证明了在B.flavum(pDXW-8-vhb)中lacIPF104严格控制了tac启动子的表达。
序列表
<210>SEQ ID NO：1
<211>9548
<212>DNA
<213>质粒pDXW-8全长DNA
<400>1
ttctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacattata cgagccgatg 60
attaattgtc aacagctcat ttcagaatat ttgccagaac cgttatgatg tcggcgcaaa 120
aaacattatc cagaacggga gtgcgccttg agcgacacga attatgcagt gatttacgac 180
ctgcacagcc ataccacagc ttccgatggc tgcctgacgc cagaagcatt ggtgcaccgt 240
gcagtcgata agctccggat cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgct 300
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 360
gtcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca 420
tattcaacgg gaaacgtctt gctctaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt 480
atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt 540
gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa 600
tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac 660
catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg 720
gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc 780
gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag 840
cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc 900
gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca 960
taaacttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa 1020
ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc 1080
agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt 1140
acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt 1200
tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaaga attaattcat gagcggatac atatttgaat 1260
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 1320
acaccggcgc cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag 1380
atcgggctcg ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc 1440
ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg 1500
tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag 1560
agcgtcgacc gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg 1620
gcatgactat cgtcgtctac gtctgatgct ttgaatcgga cggacttgcc gatcttgtat 1680
gcggtgattt ttccctcgtt tgcccacttt ttaatggtgg ccggggtgag agctacgcgg 1740
gcggcgacct gctgcgctgt gatccaatat tcggggtcgt tcactggttc ccctttctga 1800
tttctggcat agaagaaccc ccgtgaactg tgtggttccg ggggttgctg atttttgcga 1860
gacttctcgc gcaattccct agcttaggtg aaaacaccat gaaacactag ggaaacaccc 1920
atgaaacacc cattagggca gtagggcggc ttcttcgtct agggcttgca tttgggcggt 1980
gatctggtct ttagcgtgtg aaagtgtgtc gtaggtggcg tgctcaatgc actcgaacgt 2040
cacgtcattt accgggtcac ggtgggcaaa gagaactagt gggttagaca ttgttttcct 2100
cgttgtcggt ggtggtgagc ttttctagcc gctcggtaaa cgcggcgatc atgaactctt 2160
ggaggttttc accgttctgc atgcctgcgc gcttcatgtc ctcacgtagt gccaaaggaa 2220
cgcgtgcggt gaccacgacg ggcttagcct ttgcctgcgc ttctagtgct tcgatggtgg 2280
cttgtgcctg cgcttgctgc gcctgtagtg cctgttgagc ttcttgtagt tgctgttcta 2340
gctgtgcctt ggttgccatg ctttaagact ctagtagctt tcctgcgata tgtcatgcgc 2400
atgcgtagca aacattgtcc tgcaactcat tcattatgtg cagtgctcct gttactagtc 2460
gtacatactc atatttacct agtctgcatg cagtgcatgc acatgcagtc atgtcgtgct 2520
aatgtgtaaa acatgtacat gcagattgct gggggtgcag ggggcggagc caccctgtcc 2580
atgcggggtg tggggcttgc cccgccggta cagacagtga gcaccggggc acctagtcgc 2640
ggataccccc cctaggtatc ggacacgtaa ccctcccatg tcgatgcaaa tctttaacat 2700
tgagtacggg taagctggca cgcatagcca agctaggcgg ccaccaaaca ccactaaaaa 2760
ttaatagtcc ctagacaaga caaacccccg tgcgagctac caactcatat gcacgggggc 2820
cacataaccc gaaggggttt caattgacaa ccatagcact agctaagaca acgggcacaa 2880
cacccgcaca aactcgcact gcgcaacccc gcacaacatc gggtctaggt aacactgaaa 2940
tagaagtgaa cacctctaag gaaccgcagg tcaatgaggg ttctaaggtc actcgcgcta 3000
gggcgtggcg taggcaaaac gtcatgtaca agatcaccaa tagtaaggct ctggcggggt 3060
gccataggtg gcgcagggac gaagctgttg cggtgtcctg gtcgtctaac ggtgcttcgc 3120
agtttgaggg tctgcaaaac tctcactctc gctgggggtc acctctggct gaattggaag 3180
tcatgggcga acgccgcatt gagctggcta ttgctactaa gaatcacttg gcggcgggtg 3240
gcgcgctcat gatgtttgtg ggcactgttc gacacaaccg ctcacagtca tttgcgcagg 3300
ttgaagcggg tattaagact gcgtactctt cgatggtgaa aacatctcag tggaagaaag 3360
aacgtgcacg gtacggggtg gagcacacct atagtgacta tgaggtcaca gactcttggg 3420
cgaacggttg gcacttgcac cgcaacatgc tgttgttctt ggatcgtcca ctgtctgacg 3480
atgaactcaa ggcgtttgag gattccatgt tttcccgctg gtctgctggt gtggttaagg 3540
ccggtatgga cgcgccactg cgtgagcacg gggtcaaact tgatcaggtg tctacctggg 3600
gtggagacgc tgcgaaaatg gcaacctacc tcgctaaggg catgtctcag gaactgactg 3660
gctccgctac taaaaccgcg tctaaggggt cgtacacgcc gtttcagatg ttggatatgt 3720
tggccgatca aagcgacgcc ggcgaggata tggacgctgt tttggtggct cggtggcgtg 3780
agtatgaggt tggttctaaa aacctgcgtt cgtcctggtc acgtggggct aagcgtgctt 3840
tgggcattga ttacatagac gctgatgtac gtcgtgaaat ggaagaagaa ctgtacaagc 3900
tcgccggtct ggaagcaccg gaacgggtcg aatcaacccg cgttgctgtt gctttggtga 3960
agcccgatga ttggaaactg attcagtctg atttcgcggt taggcagtac gttctagatt 4020
gcgtggataa ggctaaggac gtggccgctg cgcaacgtgt cgctaatgag gtgctggcaa 4080
gtctgggtgt ggattccacc ccgtgcatga tcgttatgga tgatgtggac ttggacgcgg 4140
ttctgcctac tcatggggac gctactaagc gtgatctgaa tgcggcggtg ttcgcgggta 4200
atgagcagac tattcttcgc acccactaaa agcggcataa accccgttcg atattttgtg 4260
cgatgaattt atggtcaatg tcgcgggggc aaactatgat gggtcttgtt gttgacaatg 4320
gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc 4380
ggcagcgctc tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg 4440
cctgtcgctt gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc 4500
cgccaccaaa cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccgacgcgct 4560
gggctacgtc ttgctggcgt tcgcgacgcg aggctggatg gccttcccca ttatgattct 4620
tctcgcttcc ggcggcatcg ggatgcccgc gttgcaggcc atgctgtcca ggcaggtaga 4680
tgacgaccat cagggacagc ttcaaggatc gctcgcggct cttaccagcc taacttcgat 4740
cactggaccg ctgatcgtca cggcgattta tgccgcctcg gcgagcacat ggaacgggtt 4800
ggcatggatt gtaggcgccg ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc 4860
atggagccgg gccacctcga cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc 4920
actccaagaa ttggagccaa tcaattcttg cggagaactg tgaatgcgca aaccaaccct 4980
tggcagaaca tatccatcgc gtccgccatc tccagcagcc gcacgcggcg catctcgggc 5040
agcgttgggt cctggccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta 5100
ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga 5160
agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc 5220
cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct gcaccattat gttccggatc 5280
tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc 5340
tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca tccataccgc cagttgttta 5400
ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc 5460
ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa attccccctt acacggaggc 5520
atcaagtgac caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga 5580
cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg 5640
aatcgcttca cgaccacgct gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg 5700
acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 5760
atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg 5820
cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac ggtgcctaat gagtgagcta 5880
acttacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 5940
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg 6000
tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct 6060
gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga 6120
tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg 6180
agatatccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca 6240
tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg 6300
tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt 6360
gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta 6420
atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca 6480
gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat 6540
caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat 6600
ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg 6660
ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt 6720
gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg 6780
aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg 6840
gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt 6900
ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga 6960
catcgtataa cgttactggt ttcatattca ccatcctttc ccgacaaaat ccacacatta 7020
tcccaggtgt ccggatcggt caaatacgct ggtatactgg cttaactatg cggcatcaga 7080
gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 7140
aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 7200
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 7260
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 7320
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 7380
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 7440
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 7500
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 7560
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 7620
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 7680
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 7740
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 7800
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 7860
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 7920
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 7980
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 8040
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 8100
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 8160
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 8220
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 8280
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 8340
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 8400
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 8460
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 8520
ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 8580
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 8640
tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 8700
ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 8760
catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 8820
cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 8880
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 8940
acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 9000
ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaaagagttt 9060
gtagaaacgc aaaaaggcca tccgtcagga tggccttctg cttaatttga tgcctggcag 9120
tttatggcgg gcgtcctgcc cgccaccctc cgggccgttg cttcgcaacg ttcaaatccg 9180
ctcccggcgg atttgtccta ctcaggagag cgttcaccga caaacaacag ataaaacgaa 9240
aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgatg cctggcagtt ccctactctc 9300
gcatggggag accccacact accatcggcg ctacggcgtt tcacttctga gttcggcatg 9360
gggtcaggtg ggaccaccgc gctactgccg ccaggcaaat tctgttttat cagaccgctt 9420
ctgcgttctg atttaatctg tatcaggctg aaaatcttct ctcatccgcc aaaacagaag 9480
cttctgcagc ttaagccgcg gagatctgga tccctcgagg cggccgccca tgggagctcg 9540
ctagcgaa 9548
kan-F：agcacaccgg cgctttgatc ttttctacgg ggtc
kan-R：agcacaccgg cgtcaggtgg cacttttcgg ggaa
rep-F：agtagactat cgtccattgt caacaacaag acccatca
rep-R：agtagactat cgtcgtctac gtctgatgct ttgaatcg
lacI-F：gctgtatacc agcgtatttg accgatccgg acacctggga taatgtgtgg
attttgtcgg gaaaggatgg tgaatatgaa accagtaacg aatc
lacI-R：gtatacggtg cctaatgagt gagctaactt
Kan/rep-D：ctcacaattc cacacattat acga
lacI-D：acacggaggc atcaagtgac caaa
Claims (3)
1.一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8，其核苷酸序列为：SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的表达载体pDXW-8，其特征在于：
含有用于严谨控制tac启动子表达的负调控基因lacIPF104，从6985到5903位，其携带的外源启动子PF104及SD序列，PF104及SD序列核苷酸序列为cagcgtattt gaccgatccg gacacctggg ataatgtgtg gattttgtcg g 
tg gtgaat，其中划线部分为启动子PF104序列，加框部分为SD序列；
含有用于克隆外源基因的人工合成的74bp多克隆位点MCS，从9546位到9472位，包含如下11个单一的限制性内切酶切点EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII，其核苷酸序列为gaattcgctagcgagctccc atgggcggcc gcctcgaggg taccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt。
3.如权利要求1或2所述的表达载体pDXW-8的构建方法，其特征是：
以质粒pET-28a为模板，kan-F和kan-R为引物，通过PCR扩增1023bp的卡那霉素抗性基因，在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶SgrAI酶切位点，PCR产物用SgrAI酶切；pKK223-3同样用SgrAI酶切，用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化；两者连接，由此产生的质粒大小为5617bp，命名为pDXW-5；
以质粒pC2为模板，rep-F和rep-R为引物，通过PCR扩增2686bp的rep片段，在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶PshAI酶切位点，PCR产物用PshAI酶切，并连接到同样用PshAI酶切，且用CIAP去磷酸化后的pDXW-5，由此产生的质粒大小为8313bp，命名为为pDXW-6；为了证明rep片段和卡那基因片段在棒状杆菌中的功能，我们用质粒pDXW-6转化黄色短杆菌B.flavum，并选择卡那霉素抗性克隆；
以质粒pET-28a为模板，携带PF104序列的正向引物lacI-F，和反向引物lacI-R为引物，通过PCR扩增1191bp的lacIPF104基因，在扩增产物的5′和3′末端引入限制酶EcoRI和HindIII酶切位点，PCR产物用EcoRI和HindIII双切，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切后的pDXW-6，由此产生的质粒大小为9510bp，命名为为pDXW-7；
人工合成的74bp多克隆位点MCS的DNA片段5′gaattcgcta gcgagctcccatgggcggcc gcctcgaggg taccagatct ccgcggctta agctgcagaa gctt 3’，它包含有11个单一的限制性内切酶切点：EcoRI，NheI，SacI，NcoI，NotI，XhoI，KpnI，BglII，SacII，AflII，和HindIII；用EcoRI和HindIII双切74bp的多克隆位点MCS片段，并连接到同样用EcoRI和HindIII双切的pDXW-7上，取代pDXW-7原有的多克隆位点，对该构建质粒的MCS及其两翼进行测序，以验证MCS正确连接到pDXW-7上，构建的质粒大小为9548bp，并命名为pDXW-8；
以质粒pDXW-8为模板，分别用引物对kan/rep-D/kan-F，kan/rep-D/kan-R，kan/rep-D/rep-F，kan/rep-D/rep-R，lacI-D/lacI-F，及lacI-D/lacI-R进行DNA片段的PCR扩增，鉴定了质粒pDXW-8上kan插入方向为正向插入，rep和lacIPF104片段的插入方向均为反向插入；
以上所述的PCR扩增所需引物序列：
kan-F：agcacaccgg cgctttgatc ttttctacgg ggtc
kan-R：agcacaccgg cgtcaggtgg cacttttcgg ggaa
rep-F：agtagactat cgtccattgt caacaacaag acccatca
rep-R：agtagactat cgtcgtctac gtctgatgct ttgaatcg
lacI-F：gctgtatacc agcgtatttg accgatccgg acacctggga taatgtgtgg attttgtcgggaaaggatgg tgaatatgaa accagtaacg aatc
lacI-R：gtatacggtg cctaatgagt gagctaactt
Kan/rep-D：ctcacaattc cacacattat acga
lacI-D：acacggaggc atcaagtgac caaa
PCR反应条件：
扩增kan基因PCR反应：所用引物为kan-F，kan-R；退火温度57℃，延伸时间75s；
扩增rep片段PCR反应：所用引物为rep-F，rep-R，退火温度61℃，延伸时间165s；
扩增lacIPF104基因PCR反应：所用引物为lacI-F，lacI-R，退火温度69℃，延伸时间75s；
确定kan基因正向插入PCR反应：所用引物为Kan/rep-D，Kan-R，退火温度57℃，延伸时间75s；
确定kan基因反向插入PCR反应：所用引物为Kan/rep-D，Kan-F，退火温度57℃，延伸时间75s；
确定rep片段正向插入PCR反应：所用引物为Kan/rep-D，rep-R，退火温度57℃，延伸时间255s；
确定rep片段反向插入PCR反应：所用引物为Kan/rep-D，rep-F，退火温度57℃，延伸时间255s；
确定lacIPF104基因正向插入PCR反应：所用引物为lacI-D，lacI-R，退火温度59℃，延伸时间105s；
确定lacIPF104基因反向插入PCR反应：所用引物为lacI-D，lacI-F，退火温度59℃，延伸时间105s。
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