CN114773449B - 一种β-酪蛋白的人工优化与合成方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人工优化β‑酪蛋白的方法，通过计算机辅助分析乳蛋白的表面可及性与抗原指数氨基酸区域，结合乳蛋白晶体结构数据与Schema同源结构域重组策略构建低致敏性优良β‑酪蛋白分子。实验结果表明，本发明获得优化乳蛋白分子，降低致敏原的同时提高乳蛋白的应用性能，实现靶标β‑酪蛋白全局优化与高效合成。

Description

一种β-酪蛋白的人工优化与合成方法及其应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体地，涉及一种优化β-酪蛋白、编码该重组β-酪蛋白的基因、插入有该基因的重组表达载体、导入有该重组表达载体的转化体、制备该重组β-酪蛋白的方法以及一种人造乳。

背景技术

目前，乳制品的需求量不断增加，天然动物奶及其乳制品是最理想的蛋白营养来源，其营养成分主要是乳蛋白，同时还含有生物活性肽、脂肪、乳糖、维生素和矿物质等。

但是，因含有各种致敏原，天然动物奶是婴幼儿群体中排在首位的致敏源食物。牛奶及其乳制品是FAO和WHO认定的导致人类食物过敏的主要食品之一。目前，牛奶中已知的主要致敏原包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β乳球蛋白和β-酪蛋白等。

β-酪蛋白由226个氨基酸残基组成，分子量为25382Da。β-酪蛋白含有大量的谷氨酰胺，此氨基酸序列是非常保守的，在N-末端附近形成了主要的磷酸化作用位点，β-酪蛋白磷酸化位点的数量和磷酸化水平比α-酪蛋白少。

β-酪蛋白广泛存在于哺乳动物(牛、牦牛、山羊、马、兔等)和人的乳汁中，是由乳腺腺泡上皮细胞合成的磷酸化蛋白质。β-酪蛋白在人初乳中的含量为0.26mg/100mL，在成熟乳中含量为0.3-0.5mg/100mL。

目前，野生型的β-酪蛋白仍然具有较高的致过敏性。

发明内容

本发明的目的在于降低β-酪蛋白的致过敏性。

本发明的发明人通过对β-酪蛋白的序列和晶体结构进行分析，基于多序列比对和系统发育分析，利用同源结构元件交叉重组策略对乳蛋白按功能域分割与创建重组蛋白文库，替换或消除致敏序列和表观位点，计算蛋白分子自由能稳定系数，完成乳蛋白进行理性设计与定向进化，实现基于应用属性的乳蛋白序列全局优化，得到了具有较低致过敏性的β-酪蛋白。

为了实现上述目的，本发明提供了一种重组β-酪蛋白，所述重组β-酪蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码如上所述的重组β-酪蛋白的基因。

可选地，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的重组β-酪蛋白的表达框。

可选地，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种转化体，所述转化体导入有如上所述的重组表达载体。

可选地，其中，所述转化体的宿主为毕赤酵母。

本发明还提供了一种制备如上所述重组β-酪蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组β-酪蛋白。

可选地，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。

本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的优化β-酪蛋白。

通过上述技术方案，本发明得到了致敏性几乎消失的重组β-酪蛋白，可以用于制备具有更高应用价值的人造乳制品。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为β-酪蛋白致敏表位分析。A，β-酪蛋白的三级结构；B，β-酪蛋白的二级结构；C，β-酪蛋白致敏表位。

图2为乳蛋白表达载体的构建示意图。

图3为β-酪蛋白的表达纯化结果。M，标准分子量；1，β-酪蛋白；2，人工重组β-酪蛋白AFCS2。

图4为重组优化β-酪蛋白的致敏性ELISA检测分析结果。

序列表说明

SEQ ID NO.1，人工优化β-酪蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO.2，人工优化β-酪蛋白的核酸序列；

SEQ ID NO.3，人工优化β-酪蛋白的重组表达载体核酸序列；

SEQ ID NO.4，人工优化κ-酪蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种重组β-酪蛋白，所述重组β-酪蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。该重组β-酪蛋白具有低致敏性。

本发明还提供了编码如上所述的重组β-酪蛋白的基因。

可选地，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的重组β-酪蛋白的表达框。

可选地，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种转化体，所述转化体导入有如上所述的重组表达载体。

可选地，其中，所述转化体的宿主为毕赤酵母。

本发明还提供了一种制备如上所述重组β-酪蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组β-酪蛋白。

可选地，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。

本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的重组β-酪蛋白。

优选地，所述人造乳还含有SEQ ID NO.4所示的κ-酪蛋白。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。表达载体pPIC9K-His：为淼灵生物公司市售产品；酵母表达菌株GS115：为淼灵生物公司市售产品。

实施例1乳蛋白致敏原的删除与结构优化

数据库获取牦牛、水牛、山羊、骆驼等不同物种β-酪蛋白序列。通过Emini-SurfaceProbability方法进行分析乳蛋白的表面可及性；通过Jameson-Wolf的方法计算抗原指数氨基酸区域。

利用全序列比对法比较等致敏性乳蛋白与致敏原序列相似性，比对牦牛、水牛、山羊、骆驼β-酪蛋白的致敏原与构象性表位的结构基序组成与定位，获得β-酪蛋白致敏原的保守结构域。

结合分子生物学Swissprot数据库中β-酪蛋白的晶体数据进行结构分析。基于多序列比对和系统发育分析，利用Schema同源结构元件交叉重组策略对乳蛋白按功能域分割与创建重组蛋白文库，替换或消除致敏序列和表观位点，计算蛋白分子自由能稳定系数，完成乳蛋白进行理性设计与定向进化。

基于乳蛋白的性质特征，选择亲水性好、表面可及性和可塑性较高且抗原指数较高的区域作为DNAStar预测的结构，所以通过DNAstar Protean软件预测高原牦牛β-酪蛋白(图1)的残基表位。研究结果显示，高原牦牛β-酪蛋白的抗原表位为1-15、5-69、80-92、107-120和185-209。利用同源结构交叉重组策略对乳蛋白进行优化，删除乳蛋白致敏性线性表位，完成人工优化β-酪蛋白(SEQ ID NO.1)的理性设计与定向进化，得到SEQ ID NO.1所示的重组β-酪蛋白。

实施例2优质β-酪蛋白在酵母中的高效生物合成

针对酵母细胞工厂表达特性对优化乳蛋白的DNA编码序列进行密码子优化。利用化学合成法合成优化后乳蛋白编码基因AF-CS2。

将人工优化的乳蛋白基因两端添加限制性内切酶EcoRI与NotI序列连接酵母表达载体pPIC9K-His多克隆位点中。将连接产物热激转化大肠杆菌感受态细胞并涂布含氨苄青霉素抗性的LB平板，筛选含有重组表达质粒的菌株。

利用限制性内切酶SacI切割将验证正确的阳性重组表达载体，制备线性化质粒DNA，电击转化毕赤酵母GS115中。利用遗传霉素抗性平板筛选阳性重组酵母菌株，并利用PCR进行鉴定。研究结果显示，成功构建了优化β-酪蛋白酵母表达菌株GS-AFCS2。同样方法获得天然β-酪蛋白表达菌株。

挑取乳蛋白表达菌株至种子液培养基中，30℃培养20小时，以2％浓度转接与100mL发酵培养基中，30℃转速220rpm摇瓶发酵72h，每隔24h补加一次甲醇。离心收集发酵上清液，利用人工乳蛋白的His-Tag，Ni-NTA-resin纯化柱纯化乳蛋白，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测靶标乳蛋白的表达情况。

本实施例中，利用化学合成法合成优化后乳蛋白编码基因AF-CS2(序列如SEQ IDNO.2)。通过表达载体构建与酵母转化(图2)，成功构建优化的β-酪蛋白酵母表达菌株GS-CS2。通过摇瓶发酵诱导β-酪蛋白异源表达。研究结果显示，优化β-酪蛋白在胞外大量表达(图3)。

实施例3优化β-酪蛋白的ELISA致敏性分析

用CBS溶液将乳蛋白样品稀释至5μg mL^-1，将每种样品100μL置于96孔板中，并在4℃下包被过夜。

用Tween 20/PBS(PBS-T)洗涤4次后，添加350μL 5％脱脂奶粉，并在37℃下孵育1h。再次洗涤，然后添加BSA稀释的变应原血清(1：500)，并在室温下孵育3h。洗涤后，将100μL过氧化物酶标记的山羊抗人/大鼠IgE抗体(1：5000)添加到孔中，然后在室温下孵育板1h。

用PBS-T洗涤5次并用PBS洗涤3次后，将200μL TMB溶液添加至孔中30分钟，然后使用50μL 2M H₂SO₄终止反应。

用分光光度计在450nm下测量值。对非过敏性血清进行相同的步骤，以确定非特异性结合的程度，将其从测试血清数据中减去。对每个样品进行三个平行实验，并将平均值作为最终数据。

通过ELISA体外免疫实验对构建表达的人工优化乳蛋白进行致敏性表征。利用β-酪蛋白抗体血清对野生型乳蛋白与人工优化β-酪蛋白进行致敏性分析。研究结果显示，天然β-酪蛋白具有强的IgE结合能力，而经过结构序列人工优化β-酪蛋白的结合能力显著降低(图4)。人工优化β-酪蛋白AF-CS2的IgE结合能力降低了95％，蛋白致敏性几近消失。研究结果显示，人工优化β-酪蛋白成功地降低了变应原性。

本发明利用合成生物学方法人工设计构建了无致敏性和低致敏性的优化β-酪蛋白，提高乳蛋白的应用性能，实现靶标乳蛋白全局优化与生物合成，能够用于食品、保健品、医疗、饲料及蛋白产品等领域。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种β-酪蛋白的人工优化与合成方法及其应用

<130> 26010CAAS-B-ZW

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Glu Thr Ile Glu Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr Arg

1 5 10 15

Ile Asn Lys Lys Ile Glu Lys Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr

20 25 30

Glu Asp Gly Leu Gln Asp Lys Ile His Pro Phe Ala Gln Pro Gln Pro

35 40 45

Leu Ile Tyr Pro Phe Val Glu Pro Ile Pro Tyr Gly Phe Leu Pro Gln

50 55 60

Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Pro Ala Val Val Leu Pro Val Pro Gln

65 70 75 80

Pro Glu Ile Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys

85 90 95

His Arg Val Met Pro Val Leu Lys Ser Pro Thr Ile Pro Phe Phe Glu

100 105 110

Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu

115 120 125

Pro Leu Leu Gln Ser Trp Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro

130 135 140

Thr Val Met Phe Pro Pro Gln Ser Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys

145 150 155 160

Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Val

165 170 175

Pro Val Gln Ala Leu Leu Leu Asn Gln Glu Leu Leu Leu Asn Pro Thr

180 185 190

His Gln Ile Tyr Pro Val Thr Gln Pro Leu Ala Pro Val His Asn Pro

195 200 205

Ile Ser Val

210

<210> 2

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagaaacta ttgagtcctt gtcctcttca gaagaatcta tcactagaat caataagaaa 60

atagaaaaat ttcagtctga ggagcagcag caaactgaag atggcctaca ggataagata 120

cacccatttg ctcaacccca gccacttatt tacccatttg tcgaacctat tccttatgga 180

tttttgccac aaaacattcc tccattgaca cagccagccg ttgttcttcc cgttccacaa 240

cccgagatca tgggtgtttc taaggtaaaa gaagccatgg caccaaaaca tagagttatg 300

ccagtattga aatctcctac cattccattt tttgaatccc agtcactgac cttgactgat 360

gttgagaatt tacacctgcc actgcctttg ttgcagagtt ggatgcacca gcctcaccaa 420

ccattgccac caactgtcat gttcccacca caatctgtct tgtctttgtc acaatcaaag 480

gttttacctg ttcctcaaaa ggctgttcca tatccacaga gagatgtacc agttcaagcc 540

cttttgctga accaagagct gctgcttaat cctactcatc aaatttatcc agttacacaa 600

cccttggccc ctgtccacaa tcctatttca gtg 633

<210> 3

<211> 9921

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcct 960

tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact 1020

acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 1080

gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg 1140

tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa 1200

agagaggctg aagcttacgt agaattcaga gaaactattg agtccttgtc ctcttcagaa 1260

gaatctatca ctagaatcaa taagaaaata gaaaaatttc agtctgagga gcagcagcaa 1320

actgaagatg gcctacagga taagatacac ccatttgctc aaccccagcc acttatttac 1380

ccatttgtcg aacctattcc ttatggattt ttgccacaaa acattcctcc attgacacag 1440

ccagccgttg ttcttcccgt tccacaaccc gagatcatgg gtgtttctaa ggtaaaagaa 1500

gccatggcac caaaacatag agttatgcca gtattgaaat ctcctaccat tccatttttt 1560

gaatcccagt cactgacctt gactgatgtt gagaatttac acctgccact gcctttgttg 1620

cagagttgga tgcaccagcc tcaccaacca ttgccaccaa ctgtcatgtt cccaccacaa 1680

tctgtcttgt ctttgtcaca atcaaaggtt ttacctgttc ctcaaaaggc tgttccatat 1740

ccacagagag atgtaccagt tcaagccctt ttgctgaacc aagagctgct gcttaatcct 1800

actcatcaaa tttatccagt tacacaaccc ttggcccctg tccacaatcc tatttcagtg 1860

gcggccgcga atcatcatca ccatcaccat taattcgcct tagacatgac tgttcctcag 1920

ttcaagttgg gcacttacga gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag aggatgtcag 1980

aatgccattt gcctgagaga tgcaggcttc atttttgata cttttttatt tgtaacctat 2040

atagtatagg attttttttg tcattttgtt tcttctcgta cgagcttgct cctgatcagc 2100

ctatctcgca gctgatgaat atcttgtggt aggggtttgg gaaaatcatt cgagtttgat 2160

gtttttcttg gtatttccca ctcctcttca gagtacagaa gattaagtga gaagttcgtt 2220

tgtgcaagct tatcgataag ctttaatgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca 2280

gtcaggcacc gtgtatgaaa tctaacaatg cgctcatcgt catcctcggc accgtcaccc 2340

tggatgctgt aggcataggc ttggttatgc cggtactgcc gggcctcttg cgggatatcg 2400

tccattccga cagcatcgcc agtcactatg gcgtgctgct agcgctatat gcgttgatgc 2460

aatttctatg cgcacccgtt ctcggagcac tgtccgaccg ctttggccgc cgcccagtcc 2520

tgctcgcttc gctacttgga gccactatcg actacgcgat catggcgacc acacccgtcc 2580

tgtggatcta tcgaatctaa atgtaagtta aaatctctaa ataattaaat aagtcccagt 2640

ttctccatac gaaccttaac agcattgcgg tgagcatcta gaccttcaac agcagccaga 2700

tccatcactg cttggccaat atgtttcagt ccctcaggag ttacgtcttg tgaagtgatg 2760

aacttctgga aggttgcagt gttaactccg ctgtattgac gggcatatcc gtacgttggc 2820

aaagtgtggt tggtaccgga ggagtaatct ccacaactct ctggagagta ggcaccaaca 2880

aacacagatc cagcgtgttg tacttgatca acataagaag aagcattctc gatttgcagg 2940

atcaagtgtt caggagcgta ctgattggac atttccaaag cctgctcgta ggttgcaacc 3000

gatagggttg tagagtgtgc aatacacttg cgtacaattt caacccttgg caactgcaca 3060

gcttggttgt gaacagcatc ttcaattctg gcaagctcct tgtctgtcat atcgacagcc 3120

aacagaatca cctgggaatc aataccatgt tcagcttgag acagaaggtc tgaggcaacg 3180

aaatctggat cagcgtattt atcagcaata actagaactt cagaaggccc agcaggcatg 3240

tcaatactac acagggctga tgtgtcattt tgaaccatca tcttggcagc agtaacgaac 3300

tggtttcctg gaccaaatat tttgtcacac ttaggaacag tttctgttcc gtaagccata 3360

gcagctactg cctgggcgcc tcctgctagc acgatacact tagcaccaac cttgtgggca 3420

acgtagatga cttctggggt aagggtacca tccttcttag gtggagatgc aaaaacaatt 3480

tctttgcaac cagcaacttt ggcaggaaca cccagcatca gggaagtgga aggcagaatt 3540

gcggttccac caggaatata gaggccaact ttctcaatag gtcttgcaaa acgagagcag 3600

actacaccag ggcaagtctc aacttgcaac gtctccgtta gttgagcttc atggaatttc 3660

ctgacgttat ctatagagag atcaatggct ctcttaacgt tatctggcaa ttgcataagt 3720

tcctctggga aaggagcttc taacacaggt gtcttcaaag cgactccatc aaacttggca 3780

gttagttcta aaagggcttt gtcaccattt tgacgaacat tgtcgacaat tggtttgact 3840

aattccataa tctgttccgt tttctggata ggacgacgaa gggcatcttc aatttcttgt 3900

gaggaggcct tagaaacgtc aattttgcac aattcaatac gaccttcaga agggacttct 3960

ttaggtttgg attcttcttt aggttgttcc ttggtgtatc ctggcttggc atctcctttc 4020

cttctagtga cctttaggga cttcatatcc aggtttctct ccacctcgtc caacgtcaca 4080

ccgtacttgg cacatctaac taatgcaaaa taaaataagt cagcacattc ccaggctata 4140

tcttccttgg atttagcttc tgcaagttca tcagcttcct ccctaatttt agcgttcaac 4200

aaaacttcgt cgtcaaataa ccgtttggta taagaacctt ctggagcatt gctcttacga 4260

tcccacaagg tggcttccat ggctctaaga ccctttgatt ggccaaaaca ggaagtgcgt 4320

tccaagtgac agaaaccaac acctgtttgt tcaaccacaa atttcaagca gtctccatca 4380

caatccaatt cgatacccag caacttttga gttgctccag atgtagcacc tttataccac 4440

aaaccgtgac gacgagattg gtagactcca gtttgtgtcc ttatagcctc cggaatagac 4500

tttttggacg agtacaccag gcccaacgag taattagaag agtcagccac caaagtagtg 4560

aatagaccat cggggcggtc agtagtcaaa gacgccaaca aaatttcact gacagggaac 4620

tttttgacat cttcagaaag ttcgtattca gtagtcaatt gccgagcatc aataatgggg 4680

attataccag aagcaacagt ggaagtcaca tctaccaact ttgcggtctc agaaaaagca 4740

taaacagttc tactaccgcc attagtgaaa cttttcaaat cgcccagtgg agaagaaaaa 4800

ggcacagcga tactagcatt agcgggcaag gatgcaactt tatcaaccag ggtcctatag 4860

ataaccctag cgcctgggat catcctttgg acaactcttt ctgccaaatc taggtccaaa 4920

atcacttcat tgataccatt attgtacaac ttgagcaagt tgtcgatcag ctcctcaaat 4980

tggtcctctg taacggatga ctcaacttgc acattaactt gaagctcagt cgattgagtg 5040

aacttgatca ggttgtgcag ctggtcagca gcatagggaa acacggcttt tcctaccaaa 5100

ctcaaggaat tatcaaactc tgcaacactt gcgtatgcag gtagcaaggg aaatgtcata 5160

cttgaagtcg gacagtgagt gtagtcttga gaaattctga agccgtattt ttattatcag 5220

tgagtcagtc atcaggagat cctctacgcc ggacgcatcg tggccgacct gcaggggggg 5280

ggggggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc 5340

gccccatcat ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg 5400

gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga 5460

tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccgccgtccc 5520

gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa 5580

actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt 5640

tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg 5700

caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt 5760

tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg 5820

gtgagaatgg caaaagctta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac 5880

gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag 5940

cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc 6000

ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta 6060

atacctggaa tgctgttttc ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag 6120

tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag tttagtctga 6180

ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg 6240

gcgcatcggg cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc 6300

gagcccattt atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgagc 6360

aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa caccccttgt attactgttt atgtaagcag 6420

acagttttat tgttcatgat gatatatttt tatcttgtgc aatgtaacat cagagatttt 6480

gagacacaac gtggctttcc cccccccccc tgcaggtcgg catcaccggc gccacaggtg 6540

cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg 6600

ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt 6660

tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc 6720

tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga gtatctatga 6780

ttggaagtat gggaatggtg atacccgcat tcttcagtgt cttgaggtct cctatcagat 6840

tatgcccaac taaagcaacc ggaggaggag atttcatggt aaatttctct gacttttggt 6900

catcagtaga ctcgaactgt gagactatct cggttatgac agcagaaatg tccttcttgg 6960

agacagtaaa tgaagtccca ccaataaaga aatccttgtt atcaggaaca aacttcttgt 7020

ttcgaacttt ttcggtgcct tgaactataa aatgtagagt ggatatgtcg ggtaggaatg 7080

gagcgggcaa atgcttacct tctggacctt caagaggtat gtagggtttg tagatactga 7140

tgccaacttc agtgacaacg ttgctatttc gttcaaacca ttccgaatcc agagaaatca 7200

aagttgtttg tctactattg atccaagcca gtgcggtctt gaaactgaca atagtgtgct 7260

cgtgttttga ggtcatcttt gtatgaataa atctagtctt tgatctaaat aatcttgacg 7320

agccaaggcg ataaataccc aaatctaaaa ctcttttaaa acgttaaaag gacaagtatg 7380

tctgcctgta ttaaacccca aatcagctcg tagtctgatc ctcatcaact tgaggggcac 7440

tatcttgttt tagagaaatt tgcggagatg cgatatcgag aaaaaggtac gctgatttta 7500

aacgtgaaat ttatctcaag atctctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct 7560

ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag 7620

acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca 7680

gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta 7740

ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc 7800

atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 7860

cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 7920

gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 7980

ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 8040

agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 8100

tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 8160

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 8220

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 8280

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 8340

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 8400

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg 8460

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 8520

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 8580

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 8640

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 8700

tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 8760

ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 8820

ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 8880

atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 8940

ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 9000

tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 9060

attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 9120

tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 9180

ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg 9240

gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 9300

gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 9360

gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga 9420

aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 9480

taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg 9540

tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 9600

tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 9660

atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 9720

tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat 9780

aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt cttcaagaat taattctcat gtttgacagc 9840

ttatcatcga taagctgact catgttggta ttgtgaaata gacgcagatc gggaacactg 9900

aaaaataaca gttattattc g 9921

<210> 4

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Glu Gln Asn Gln Glu Gln Pro Ala Cys His Glu Asn Asp Glu Arg

1 5 10 15

Pro Phe Tyr Gln Lys Thr Ala Pro Tyr Ile Pro Ile Gln Tyr Val Leu

20 25 30

Ser Arg Tyr Pro Tyr Tyr Gly Thr Asn Leu Tyr Gln Arg Arg Pro Val

35 40 45

Ala Leu Ile Asn Asn Gln Phe Leu Pro Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Pro

50 55 60

Ala Val Val Arg Pro His Ala Gln Ile Pro Gln Arg Gln Tyr Leu Ser

65 70 75 80

Asn Ser His Pro Pro Thr Val Val Arg Arg Pro His Pro His Leu Ser

85 90 95

Phe Met Ala Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro

100 105 110

Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr

115 120 125

Glu Pro Thr Val Asp Ser Val Val Thr Pro Glu Ala Phe Ser Glu Ser

130 135 140

Ile Ile Thr Ser Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala

145 150 155 160

Val

Claims (10)

1.一种重组β-酪蛋白，其特征在于，所述重组β-酪蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.编码权利要求1所述的重组β-酪蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体插入有权利要求2或3所述的基因并形成表达权利要求1所述的重组β-酪蛋白的表达框。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQID NO. 3所示。

6.一种转化体，其特征在于，所述转化体导入有权利要求4或5所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的转化体，其中，所述转化体为毕赤酵母。

8.一种制备权利要求1所述重组β-酪蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求6或7所述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组β-酪蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20 g/L的酵母提取物、1-2 g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6 mg/L的生物素和2-10 mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90 小时。

10.一种人造乳，其特征在于，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括权利要求1所述的重组β-酪蛋白。

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