CN113373163B - 一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因及其应用 - Google Patents

一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因及其应用，属于生物医药技术领域。所述密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过密码子优化策略，实现了大肠杆菌系统中不能表达的沙眼衣原体蛋白CTL0286的体外表达，使用表达蛋白制备的抗体可用于CTL0286蛋白的鉴定；作为沙眼衣原体中未知功能的特有蛋白，本发明可为CTL0286蛋白的功能研究和抗体开发提供基础，进而为临床衣原体治疗和鉴定提供新靶点和药物。

Description

一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因及其应用。
背景技术
众所周知，基因转录离不开RNA聚合酶的参与，衣原体RNA聚合酶(cRNAP)核心酶中的α、β、β′亚基的同源物均已找到，但直到目前为止，衣原体中是否存在ω因子的功能类似物仍未能得到证实。
衣原体启动子体外转录活性的测定，经常借用大肠杆菌RNA聚合酶(eRNAP)来模拟cRNAP，由此发明人推测衣原体中假如存在ω因子功能类似物的话，那么它与eRNAP的ω因子的同源性应该是相对较高的。
发明人从E.coli K-12菌株MG1655的ω蛋白序列出发，经多步骤Blast搜索Chlamydiae(taxid:204428)数据库，最终发现了沙眼衣原体L2(Ct L2)中潜在的ω因子功能类似物CTL0286。CTL0286是一个迄今为止仍未被研究过的衣原体蛋白，在研究该蛋白的功能之前，需要体外表达得到这个蛋白。
由于ctl0286基因中含有9个E.coli中的aga精氨酸稀有密码子(占ctl0286密码子总数的9％)，导致其蛋白不能在E.coli系统中表达。为此，发明人尝试对ctl0286基因的密码子进行全面优化，构建E.coli中的表达质粒并成功诱导表达CTL0286蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因，该ctl0286基因可成功表达CTL0286蛋白，同时，CTL0286蛋白作为衣原体特有的蛋白，后续针对该蛋白的抗体研究可为临床衣原体鉴定提供新思路。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。
一种表达载体，包含上述沙眼衣原体ctl0286基因。
进一步地，所述表达载体为pET28a载体或者pET21c载体。
一种沙眼衣原体CTL0286蛋白的表达方法，包括如下步骤：
(1)合成上述沙眼衣原体ctl0286基因；
(2)构建含有所述沙眼衣原体ctl0286基因的表达载体：
具体地，将所述沙眼衣原体ctl0286基因连接至pET28a载体或者pET21c载体的NdeI/XhoI位点，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在相应抗性的LB平板上进行抗性筛选，经PCR鉴定，即可得到表达载体；
(3)将所述表达载体转化宿主细胞、表达：
具体地，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞，涂布于相应抗性的LB平板上培养，挑取平板中生长良好的菌落接种于含有相应抗生素的LB液体培养基中培养，然后将培养的菌液接种至不含抗生素的LB液体培养基中，培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，继续振摇培养。
本发明通过对ctl0286基因密码子的全面优化，可以高表达地获得CTL0286蛋白，可实现CTL0286蛋白功能的研究，也可用于CTL0286抗体的制备。
附图说明
图1为ctl0286基因优化前后的对比。其中：Ori：CTL0286原始基因序列；Opt：CTL0286优化后的基因序列；浅灰色：优化过的精氨酸密码子；深灰色：优化过的其他氨基酸密码子。
图2为考马斯亮蓝染色验证CTL0286蛋白表达。其中：M：蛋白Marker；1：转化了pET28a-NH-CTL0286质粒的细菌裂解液；2：转化了pET21c-CH-CTL0286质粒的细菌裂解液；3：转化了pET21c-NT-CTL0286质粒的细菌裂解液；4：未转化的BL21空白菌体；5：转化了pET21c-NT-CTL0286质粒的细菌裂解液(3的3倍细菌量)。
图3为CTL0286抗体检测CTL0286蛋白表达情况。
图4为CTL0286蛋白与cRNAP的β′亚基的结合。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1、密码子优化
根据E.coli中各种氨基酸密码子的使用效率，对ctl0286基因中的密码子逐个进行优化，图1为ctl0286基因优化前后的序列对比。
密码子优化的ctl0286基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2、基因合成
合成优化后的ctl0286基因，插入pMV载体质粒，获得pMV-CTL0286融合质粒，其序列如SEQ ID NO.2所示。其中红色字体为克隆的基因，其它部分是载体序列。
以pMV-CTL0286质粒为模板，使用XB185/XB186引物对扩增ctl0286基因，采用同源重组的方法插入pET28a表达载体的NdeI/XhoI位点，获得pET28a-NH-CTL0286质粒，用于表达N末端携带His标签的CTL0286蛋白(NH-CTL0286)。
以pMV-CTL0286质粒为模板，使用XB187/XB188引物对扩增ctl0286基因，采用同源重组的方法插入pET21c表达载体的NdeI/XhoI位点，获得pET21c-CH-CTL0286质粒，用于表达C末端携带His标签的CTL0286蛋白(CH-CTL0286)。
以pMV-CTL0286质粒为模板，使用XB187/XB186引物对扩增ctl0286基因，采用同源重组的方法插入pET21c表达载体的NdeI/XhoI位点，获得pET21c-NT-CTL0286质粒，用于表达不携带标签的CTL0286蛋白(NT-CTL0286)。
引物序列：
引物名称 引物序列
XB185 CTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTCGTAAAGATCGT(SEQ ID NO.3)
XB186 GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTTCACATCGCTCCA(SEQ ID NO.4)
XB187 CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTCGTAAAGATCGT(SEQ ID NO.5)
XB188 GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCACATCGCTCCAG(SEQ ID NO.6)
3、线性载体制备。按如下制备反应体系，混匀后37℃酶切1-2h，然后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切，并用胶回收试剂盒回收载体。
反应液成分 体积
载体质粒 10-20μL
10 x bufer 5μL
NdeI 1μL
XhoI 1μL
ddH<sub>2</sub>O to 50μL
4、插入片段获得。使用Vazyme公司的
Figure BDA0003089882030000031
Max Super-Fidelity DNAPolymerase Kit(P505)，PCR扩增ctl0286基因，扩增体系如下：
Figure BDA0003089882030000041
PCR产物加入1μL DpnI，37℃酶切1h去除模板质粒，-20℃保存。
5、重组反应。使用Vazyme公司的
Figure BDA0003089882030000042
One Step Cloning Kit(C112)，将线性载体与插入片段按如下制备反应体系，其中线性载体X与插入片段Y摩尔比为1:2，混匀后37℃反应30min进行同源重组，产物立即置于冰上冷却5min。
Figure BDA0003089882030000043
6、重组产物转化。将上述重组产物立即转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于相应抗性的LB平板上进行抗性筛选。具体步骤如下：
(1)在冰上解冻DH5α感受态细胞(Vazyme，C502)；
(2)取10μL重组产物于100μL感受态细胞，轻弹管壁混匀(切勿振荡混匀)，冰浴中静置30分钟；
(3)42℃水浴热激活45-60sec，快速移至冰浴中，静置2-3分钟；
(4)加入预热到37℃的900μL不含抗生素LB培养液，37℃摇床220rpm振摇1h；
(5)摇菌过程中，在37℃培养箱预热相应抗性的LB固体培养基平板；
(6)5,000rpm离心5min，弃掉900μL上清，将菌体重悬于剩余的培养基内，涂布在含相应抗性的LB固体培养基平板上；
(7)37℃培养箱中倒置培养过夜。
7、重组产物鉴定。挑取平板上的菌落进行PCR鉴定，选取部分阳性克隆扩增提取质粒，送公司测序鉴定。具体步骤如下：
(1)挑取平板上若干克隆进行PCR鉴定，扩增引物一条为载体上的通用测序引物，另一条为ctl0286基因序列引物，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；
(2)PCR鉴定为阳性的菌落，选取部分克隆接种至含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振摇培养过夜，提取质粒进行测序鉴定。
8、蛋白诱导。挑选测序无误的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞(Vazyme，C504)，涂布于相应抗性的LB平板上培养过夜。挑取平板中生长良好的菌落，接种于10mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振摇培养过夜。将过夜培养的菌液按1:100接种至500mL不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃继续振摇培养4h，离心收获菌体。
9、蛋白表达鉴定。图2为考马斯亮蓝染色验证CTL0286蛋白表达。取上述1mL培养液，收集菌体，加入100μL 1 x SDS蛋白裂解液，95℃煮5min，跑15％的SDS-PAGE胶，考马斯亮蓝染色检测蛋白表达情况。结果显示，与为转化质粒的BL21菌相比，转化了pET28a-NH-CTL0286、pET21c-CH-CTL0286和pET21c-NT-CTL0286质粒的BL21菌都出现了新的蛋白条带，CTL0286蛋白成功表达。
10、包涵体纯化。取上述200mL培养液，收集菌体，非变性裂解液(40mM Tris-HCl[pH7.9]，300mM KCl，10mM EDTA，0.1mM PMSF，0.2mg/mL lysozome，0.2％sodiumdexoycholate)重悬，超声破碎(功率300W，超声5s间歇15s为一个循环，超声10·min)后离心收集沉淀。重复重悬和超声步骤3次，去除菌体杂质，收获纯化的包涵体。
11、蛋白纯化。将上述纯化的包涵体重悬于变性10mL裂解液中(25mM HEPES[pH7.0]，300mM NaCl，6M盐酸胍)，超声辅助包涵体裂解。将裂解液装入
Figure BDA0003089882030000051
6Dialysis Membranes(MWCO 3.5K)，在500mL复性液(50mM Tris-HCl[pH 9.0]，200mM KCl，10mM MgCl，10μM ZnCl2，1mM EDTA，5mM 2-mercaptoethanol，20％glycerol)中4℃透析过夜，置换新的透析液继续透析3h后，收集上清，即为纯化蛋白溶液。
实施例2
CTL0286多克隆抗体的制备。将上述得到的NT-CTL0286蛋白溶液置换为PBS缓冲液，免疫四只C57BL/6J雄鼠。初次免疫用100μg蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀，于背部皮下多点注射。初次免疫2周后，进行第一次加强免疫，用50μg蛋白，与等体积的不完全弗氏佐剂混匀后于背部皮下多点注射。之后每隔10天进行1次加强免疫，共3次。末次免疫后第7天取血，取完血后于冰上静置1h，4000rpm离心10min收集血清，即为CTL0286多克隆抗体。
图3为CTL0286多克隆抗体识别蛋白的能力。图A为4只不同小鼠来源的抗体分别识别CTL0286的能力，检测样品为NT-CTL0286细菌裂解液，一抗是1:1000稀释的anti-CTL0286抗体，二抗是1:1000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG，结果显示4只抗体均能特异性的识别NT-CTL0286。图B为1号抗体识别3种CTL0286蛋白的能力，检测样品为等量的NT-CTL0286、CH-CTL0286和NH-CTL0286蛋白，一抗是1:1000稀释的anti-CTL0286抗体1，二抗是1:1000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG，结果显示抗体1识别三种CTL0286蛋白的能力相近。
通过蛋白结合实验，验证纯化蛋白的功能。图4为CTL0286与cRNAPβ'亚基的结合能力。首先将NS-β'(N末端携带strep标签的β'蛋白)与Strep-Tactin树脂结合，对照组为NT-β'(不携带标签的β'蛋白)，然后分别加入上述纯化的NH-CTL0286、CH-CTL0286和NT-CTL0286蛋白，采用anti-CTL0286抗体1、Western Blotting法鉴定与NS-β'结合的CTL0286蛋白。结果显示，NS-β'既能结合携带His标签的CTL0286蛋白，同时也能结合不携带标签的CTL0286蛋白，这些结果验证了cRNAPβ'亚基与CTL0286之间有直接的结合作用。
本发明通过密码子优化策略，实现了大肠杆菌系统中不能表达的沙眼衣原体蛋白CTL0286的体外表达，使用表达蛋白制备的抗体可用于CTL0286蛋白的鉴定；作为沙眼衣原体中未知功能的特有蛋白，本发明可为CTL0286蛋白的功能研究和抗体开发提供基础，进而为临床衣原体治疗和鉴定提供新靶点和药物。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因及其应用
<130> 20210528
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctcgta aagatcgtct gaccaatgaa cgcctgaata aactgtttga tagcccgttt 60
agtctggtta attatgtgat taaacaggct aaaaacaaaa ttgctcgcgg tgatgttcgt 120
tcttctaacg tggcgattga agcgctgaac tttctggatc tgtatggcat tcagagcgaa 180
tatgctgaac gtgatgatcg tgaacgccat ctgtctgcta caggcgaacg tcgccgtgaa 240
cagggttttg gtaca 255
<210> 2
<211> 2410
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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atatgctgaa cgtgatgatc gtgaacgcca tctgtctgct acaggcgaac gtcgccgtga 420
acagggtttt ggtacatctc gtcgcaaaga tccgtctctg tataactgga gcgatgtgaa 480
ataaagagac ggagtcactg ccaaccgaga cggtcatagc tgtttcctgt gtgccgcttc 540
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 600
aaaggcggta atacggttac ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 660
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 720
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 780
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 840
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 900
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 960
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 1020
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 1080
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 1140
ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 1200
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 1260
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 1320
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 1380
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 1440
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 1500
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 1560
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca ataataccgc gggacccacg 1620
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 1680
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 1740
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc atcgctacag gcatcgtggt 1800
atcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 1860
tacatgatcc cccatgttgc gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 1920
cagaagtaag ttggccgccg tgttatcact catggttatg gcagcactac ataattctct 1980
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 2040
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 2100
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 2160
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 2220
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 2280
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 2340
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 2400
atgtatttag 2410
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggtgccgc gcggcagcca tatggctcgt aaagatcgt 39
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggtggtgg tggtggtgct cgagttattt cacatcgctc ca 42
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctttaagaag gagatataca tatggctcgt aaagatcgt 39
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtggtggtgg tggtggtgct cgagtttcac atcgctccag 40

Claims (8)

1.一种密码子优化的沙眼衣原体ctl0286基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种表达载体，其特征在于：包含权利要求1所述的沙眼衣原体ctl0286基因。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pET28a载体或者pET21c载体。
4.一种沙眼衣原体CTL0286蛋白的表达方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1，合成权利要求1所述的沙眼衣原体ctl0286基因；
步骤2，构建含有所述沙眼衣原体ctl0286基因的表达载体：
步骤3，将所述表达载体转化宿主细胞、表达。
5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：步骤2是将ctl0286基因片段经同源重组插入pET28a或者pET21c表达载体的NdeI/XhoI位点，然后转化DH5α感受态细菌，即可得到表达载体。
6.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：步骤3是将所述表达载体转化BL21感受态细菌，然后经IPTG诱导蛋白表达。
7.权利要求1所述的沙眼衣原体ctl0286基因在制备CTL0286蛋白抗体中的应用。
8.权利要求1所述的沙眼衣原体ctl0286基因在制备沙眼衣原体诊断或治疗药物中的应用。
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