CN110747216A

CN110747216A - 一种多基因共表达成套载体及其应用

Info

Publication number: CN110747216A
Application number: CN201911084755.3A
Authority: CN
Inventors: 刘翠敏; 刘小强
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2020-02-04
Also published as: WO2021088943A1

Abstract

本发明公开了一种多基因共表达的成套载体及其应用。本发明首先公开了一种多基因共表达的成套载体，该成套载体包括质粒1、质粒2和质粒3；所述质粒1、质粒2和质粒3含有不相同的复制子、不相同的抗性基因、诱导外源基因表达的调控基因和一到多个串联的外源基因表达盒。本发明进一步公开了上述成套载体在诱导多基因共表达中的应用。本发明多基因共表达的成套载体中各质粒采用不同抗生素筛选标记，保证共表达；采用不同复制子，排除质粒不相容性，保证共表达；采用不同诱导剂控制表达，可以实现多基因的定时、定量表达；采用pQlink串联方法实现多基因在各质粒上的串联，每个基因由独立的启动子和终止子控制，保证互不干扰。

Description

一种多基因共表达成套载体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多基因共表达成套载体及其应用。

背景技术

随着生命科学研究的不断深入，对基因表达技术提出更高的要求，可以实现多基因定时、定量的协同表达。例如，对整条代谢途径的研究涉及到多步催化酶蛋白的表达；对生物大分子复合体的研究涉及到多亚基蛋白的表达；合成生物学中对不同代谢途径的改造等等。对这些复杂生命过程的研究要求对多基因表达的精细调控。

因此，开发一套包括多质粒的共表达系统，对实现多基因的精细诱导调控表达具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题为如何实现对多基因共表达的精细调控。

为解决上述问题，本发明提供了一种多基因共表达的成套载体。

本发明多基因共表达的成套载体包括质粒1、质粒2和质粒3；所述质粒1、质粒2和质粒3含有不相同的复制子、不相同的抗性基因、诱导外源基因表达的调控基因和一到多个串联的外源基因表达盒。

上述成套载体中，所述复制子可以为序列1第2574-3312位所示的大肠杆菌CDF复制子、序列7第2672-3260位所示的大肠杆菌Col1复制子或序列12第1215-2053位所示的大肠杆菌p15A复制子。

上述成套载体中，所述抗性基因可以为序列1第1646-2434位所示的壮观霉素抗性基因、序列7第3434-4291位所示的氨苄青霉素抗性基因或序列12第194-853位所示的氯霉素抗性基因。

上述成套载体中，所述诱导外源基因表达的调控基因可以相同也可以不同，具体的，所述诱导外源基因表达的调控基因为序列1第748-1371位所示的四环素抑制蛋白基因或序列7第994-2076位所示的LacI阻遏蛋白基因。

上述成套载体中，所述一到多个串联的外源基因表达盒位于诱导外源基因表达的调控基因的下游，所述一到多个串联的外源基因表达盒和诱导外源基因表达的调控基因间还包含如序列1第265-295位所示或序列7第4505-4547位所示的Linker1，在所述多个串联的外源基因表达盒的的下游还包含如序列1第518-583位所示或序列7第1-51位所示的Linker2。

上述成套载体中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达外源基因的DNA，该DNA不但包括启动外源基因转录的启动子，还可包括终止外源基因转录的终止子。

上述成套载体中，所述外源基因表达盒的终止子为序列1第475-517位所示的T7转录终止子；当所述诱导外源基因表达的调控基因为序列1第748-1371位所示的四环素抑制蛋白基因时，所述外源基因表达盒的启动子为序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子；当所述诱导外源基因表达的调控基因为序列7第994-2076位所示的LacI阻遏蛋白基因时，所述外源基因表达盒的启动子为序列5第1-19位所示的T7启动子，且所述T7启动子的下游还包括序列5第20-44位所示的Lac操纵子。

上述成套载体中，所述质粒1包含依次连接的序列1第2574-3312位所示的大肠杆菌CDF复制子、序列1第1646-2434位所示的壮观霉素抗性基因、序列1第748-1371位所示的四环素抑制蛋白基因、序列1第265-295位所示的Linker1、一到多个串联的外源基因表达盒、序列1第518-583位所示的Linker2；所述外源基因表达盒包含依次连接的序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子、外源基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子；

所述质粒2包含依次连接的序列7第2672-3260位所示的大肠杆菌Col1复制子、序列7第3434-4291位所示的氨苄青霉素抗性基因、序列7第994-2076位所示的LacI阻遏蛋白基因、序列7第4505-4547位所示的Linker1、一到多个串联的外源基因表达盒、序列7第1-51位所示的Linker2；所述外源基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、外源基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子；

所述质粒3包含依次连接的序列12第1215-2053位所示的大肠杆菌p15A复制子、序列12第194-853位所示的氯霉素抗性基因、序列7第994-2076位所示的LacI阻遏蛋白基因、序列7第4505-4547位所示的Linker1、一到多个串联的外源基因表达盒、序列7第1-51位所示的Linker2；所述外源基因表达盒包含依次连接的序列5第1-19位所示的T7启动子、序列5第20-44位所示的Lac操纵子、外源基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子。

在本发明具体的一个实施例中，所述质粒1包含两个串联的外源基因表达盒，所述两个串联的外源基因表达盒的外源基因分别为衣藻Rubisco的大亚基基因(CrRbcL)和衣藻Rubisco的小亚基基因(CrRbcS)；所述CrRbcS基因的序列如序列3所示；所述CrRbcL基因的序列如序列4所示；

所述质粒2的外源基因包含四个串联的外源基因表达盒，所述四个串联的外源基因表达盒的外源基因分别为衣藻Rubisco大亚基基因折叠的四个分子伴侣素基因(CrCpn60α、CrCpn60β1、CrCpn60β2和CrCpn20)；所述CrCpn60a的序列如序列8所示，所述CrCpn60β1的序列如序列9所示，所述CrCpn60β2的序列如序列10所示，所述CrCpn20的序列如序列11所示；

所述质粒3包含三个串联的外源基因表达盒，所述三个串联的外源基因表达盒的外源基因分别为拟南芥Rubisco组装的两个分子伴侣蛋白基因(AtRaf2和CrRbcX1)和蓝细菌Rubisco组装的分子伴侣蛋白基因(AnaCARbcX)，所述AtRaf2的序列如序列13所示，所述CrRbcX1的序列如序列14所示，所述AnaCARbcX的序列如序列15所示。

本发明进一步还公开了上述多基因共表达的成套载体在诱导多基因共表达中的应用。

本发明多基因共表达的成套载体中各质粒采用不同抗生素筛选标记(即抗性基因)，保证共表达；采用不同复制子，排除质粒不相容性，保证共表达；采用不同诱导剂(即诱导外源基因表达的调控基因表达盒)控制表达，可以实现多基因的定时、定量表达；采用pQlink串联方法实现多基因在各质粒上的串联，每个基因由独立的启动子和终止子控制，保证互不干扰。

附图说明

图1为三个质粒的结构示意图。

图2为三个质粒串联的基因的被诱导表达情况；其中，CrRbcL：衣藻Rubisco的大亚基基因，CrRbcS：衣藻Rubisco的小亚基基因，CrCpn60β1：参与衣藻Rubisco大亚基折叠的分子伴侣素60β1亚基基因，CrCpn60β2：参与衣藻Rubisco大亚基折叠的分子伴侣素60β2亚基基因，CrCpn60α：参与衣藻Rubisco大亚基折叠的分子伴侣素60α亚基基因，CrCpn20：参与衣藻Rubisco大亚基折叠的辅分子伴侣素20亚基基因，CrRaf2：参与衣藻Rubisco组装的分子伴侣蛋白基因，CrRbcX1：参与衣藻Rubisco组装的分子伴侣蛋白基因，AnaCARbcX：参与衣藻Rubisco组装的分子伴侣蛋白基因。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1质粒1的构建

一、构建pTetlinker载体

1、用引物(pLCM1 For：cacggtcacactgcttccggta，pLCM1 Rev：gggatctcgaccgatgcccttgag)PCR扩增质粒pCDFDuet-1(购自addgene：http：//www.addgene.org/)，得到扩增片段A(序列1第1499-3479位)，所述扩增片段A包含大肠杆菌CDF复制子(序列1第2574-3312位)和壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)的表达盒。

2、用引物(pJKR-Tet For：agggcatcggtcgagatccc Gagtagggaactgccaggcatcaa，pJKR-Tet Rev3：gtgcttctcgcctgaggttCCGTGTGCTTCTCGCCTGAGGTT)PCR扩增质粒pJKR-H-TetR(购自addgene：http：//www.addgene.org/)，得到扩增片段B(序列2)，所述扩增片段B包含四环素抑制蛋白基因(序列2第1404-2027位)的表达盒和GFP基因表达盒(序列2第265-2128位)，所述GFP基因表达盒包含四环素诱导启动子(序列2第265-355位)、GFP基因和T7转录终止子(序列2第2086-2128位)。

3、将上述得到的扩增片段A和扩增片段B无缝克隆连接，得中间载体pLCM1-Tet-GFP。用100ng/L四环素诱导pLCM1-Tet-GFP表达，检测GFP可以正常被诱导表达。

4、人工合成序列1第250-596所示的TetRlink元件，其中，该TetRlink元件包含linker1(序列1第265-295位)、四环素诱导启动子(序列1第296-386位)、T7转录终止子(序列1第475-517位)和Linker2(序列1第518-583位)；用引物(pTetR sy For：GCAAGTAAGGCCGACGAGCTTAA，pTetR sy Rev：GGTGTTAGCTGTGTCTCGCCAAGCTA)PCR扩增人工合成TetRlink元件，得到扩增片段C(序列1第250-596位)。

5、用引物(pTet inter For：cgagacacagctaacaccacgtcgtccctat，pTet interRev：gctcgtcggccttacttgctagcagagttt)PCR扩增中间载体pLCM1-Tet-GFP，得到扩增片段D(序列1第1-268和第579-2479位)，所述扩增片段D包含大肠杆菌CDF复制子((序列1第2574-3312位)和壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)的表达盒、四环素抑制蛋白基因(序列1第748-1371位，与序列2第1404-2027位序列相同)的表达盒。

6、将扩增片段C和扩增片段D无缝克隆连接，得到将中间载体pLCM1-Tet-GFP中GFP基因表达盒替换为TetRlink元件的质粒，命名为pTetlinker(具体序列如序列1所示)，包含大肠杆菌CDF复制子((序列1第2574-3312位)、壮观霉素抗性基因(序列1第1646-2434位)、四环素抑制蛋白基因(序列1第748-1371位)、link1(序列1第265-295位)、四环素诱导启动子(序列1第296-386位)、T7转录终止子(序列1第475-517位)和Linker2(序列1第518-583位)

二、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因G1(序列3所示的Rubisco的小亚基基因CrRbcS)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因CrRbcS的片段并将CrRbcS基因克隆进pTetlinker载体，具体步骤如下：

1、用引物(CrRbcS-Tetlinker for：taagaaggagatatacatATGATGGTCTGGACCCCGGTCAA，CrRbcS-Tetlinker rev：tcactcattagggttatgcTACACGGAGCGCTTGTTGGCG)PCR扩增序列如序列3所示的Rubisco的小亚基基因CrRbcS，得到包括序列3所示的Rubisco的小亚基基因CrRbcS的扩增片段E。

2、用引物(pTetRlinker For：CATAACCCTAATGAGTGAGCTAACTTACA和pTetRlinkerRev：CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAATTTA)PCR扩增质粒pTetlinker，得到扩增片段F(序列1第419-3479位)。

3、将扩增片段E和扩增片段F无缝克隆连接。

4、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因CrRbcS被克隆到pTetlinker载体中，命名为pTetlinker-CrRbcS。

三、根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因G2(序列4所示的Rubisco的大亚基基因CrRbcL)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因CrRbcL的片段并将CrRbcL基因克隆进pTetlinker载体，具体步骤如下：

1、用引物(CrRbcL-Tetlinker for：taagaaggagatatacatATGGTTCCACAAACAGAAACTAAAGCA和CrRbcL-Tetlinker rev：tcactcattagggttatgTTAAAGTTTGTCAATAGTATCAAATTCGAATT)PCR扩增序列18所示的Rubisco的大亚基基因CrRbcL，得到包括序列4所示的Rubisco的大亚基基因CrRbcL扩增片段G。

3、将扩增片段G和扩增片段F无缝克隆连接。

4、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因CrRbcL被克隆到pTetlinker载体中，命名为pTetlinker-CrRbcL。

如需要共表达更多的外源基因G3-Gn均按照步骤1-4所述的方法克隆到pTetlinker载体中，命名为pTetlinker-G3，pTetlinker-G4，pTetlinker-G5......pTetlinker-Gn。此处实施例仅克隆G1和G2基因。

四、多基因在pTetlinker载体中的串联，具体步骤如下：

1、取克隆有不同外源基因载体pTetRlinker(pTetlinker-CrRbcLS和pTetlinker-CrRbcL)各500ng，用10μL不同的限制性内切酶体系进行酶切，两个载体分别使用SwaI(25℃，1h)和PacI(37℃，1h)，获得SwaI酶切反应体系和PacI酶切反应体系。

2、将两个反应体系均于65℃孵育20分钟使SwaI或PacI失活，得到SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物；各取5μL DNA产物，加入0.5μL T4 DNA聚合酶，2μL 10×NEBuffer2.1，对于SwaI酶切DNA产物加入100mM dGTP 0.5μL，对于PacI酶切DNA产物加入100mM dCTP0.5μL，并用ddH₂O补足至20μL，最终于25℃孵育30分钟，得到经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系。

3、将经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系等体积混合，放入PCR仪中加热至65℃，并逐步降温至10℃，使SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物通过退火连接在一起，得到终产物。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证阳性的克隆，其中，使用Linker1和Linker 2序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTTTTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

验证阳性的克隆经测序验证得到外源基因CrRbcL和CrRbcS共表达的载体，即得质粒1。采用同样的方法可以将更多的外源基因G3、G4基因表达盒等等全部串联在pTetlinker载体中。

获得质粒l的结构示意图如图l所示。

实施例2质粒2的构建

一、pT7linker1载体

l、人工合成序列5所示的T7启动子-lac操纵子-T7终止子序列(该序列元件包含T7启动子(序列5第1-19位)、lac操纵子(序列5第20-44位)和T7转录终止子(序列5第161-203位))替换载体pQlinkN(Scheich，C.，Kummel，D.，Soumailakakis，D.，Heinemann，U.，Bussow，K.，Vectorsfor co-expression of an unrestricted number of proteins，Nucleic Acids Research，2007，Vol.35，No.6，e43.)中的Tac promoter-λt0 ter序列(如序列6所示)得pT7linker1载体，具体步骤如下：

1、设计引物(T7 box for：gtcttgaggggttttttgagtaacaacaccatttaaatgga，T7box rev：ctatagtgagtcgtattaacaattgaatctattataattgttatccgc)PCR扩增载体pQlinkN，得到序列7所示扩增片段H，所述扩增片段H包括LacI阻遏蛋白基因(序列7第994-2076位)的表达盒、大肠杆菌Coll复制子(序列7第2672-3260位)、氨苄青霉素抗性基因(序列7第3434-429l位)的表达盒、Linker1(序列7第4505-4547位)和Linker2(序列7第1-51位)。

2、将扩增片段H与人工合成的序列5所示的T7启动子-lac操纵子-T7终止子序列无缝克隆连接，得到连接产物，体系同实施例1。

3、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker1，其包括T7启动子(序列5第1-19位)、lac操纵子(序列5第20-44位)和T7转录终止子(序列5第161-203位)、LacI阻遏蛋白基因(序列7第994-2076)的表达盒、大肠杆菌Col1复制子(序列7第2672-3260位)、氨苄青霉素抗性基因(序列7第3434-4291位)的表达盒、Linker1(序列7第4505-4547位)和Linker2(序列7第1-51位)。

二、根据要克隆外源基因的序列设计引物(正向引物5′端加NdeI限制性酶切位点紧接起始密码子，反向引物加BamHI位点紧接终止密码子)，以含有外源基因的DNA分子为模板，利用以上引物进行扩增获得包含外源基因N1的片段。本实施例中根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因N1(序列8所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN60α)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因CrCPN60α的片段且将CrCPN60α基因克隆进pT7linker1载体，具体步骤如下：

1、用引物(CrCPN60α-T7linker1 for：tacatatggctgacgctaaggagattgtgtt和CrCPN60α-T7linker1 rev：ccggatccttagatggtcatgccggagggcat)PCR扩增序列8所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN60α，得到包含序列8所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN60α的扩增片段I。

2、将pT7linker1载体和扩增片段I均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μLNdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段I。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker1载体和扩增片段I，得到终产物。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用使用Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTTTTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因CrCPN60α被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-CrCPN60α。

三、根据要克隆外源基因的序列设计引物(正向引物5′端加NdeI限制性酶切位点紧接起始密码子，反向引物加BamHI位点紧接终止密码子)，以含有外源基因的DNA分子为模板，利用以上引物进行扩增获得包含外源基因N2的片段。本实施例中根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因N2(序列9所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN60β1)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因CrCPN60β1的片段将CrCPN60β1基因克隆进pT7linker1载体，具体步骤如下：

l、用引物(CrCPN60β1-T7linker1 for：tacatatggccaaggagctgcacttcaacaag；CrCPN60β1-T7linker1 rev：ccggatccttacaggccgccgccgaagccggcggcgc)PCR扩增序列9所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN60β1，得到包含序列9所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN60β1的扩增片段J。

2、将pT7linker1载体和扩增片段J均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μLNdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时。并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段I。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker1载体和扩增片段J，得到终产物，连接体系同上述步骤二的连接体系。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTTTTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因CrCPN60β1被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-CrCPN60β1。

四、根据要克隆外源基因的序列设计引物(正向引物5′端加NdeI限制性酶切位点紧接起始密码子，反向引物加BamHI位点紧接终止密码子)，以含有外源基因的DNA分子为模板，利用以上引物进行扩增获得包含外源基因N3的片段。本实施例中根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因N3(序列10所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN60β2)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因CrCPN60β2的片段将CrCPN60β2基因克隆进pT7linker1载体

l、用引物(CrCPN60β2-T7linker1 for：tacatatggccaaggagctgcacttcaaccg；CrCPN60β2-T7linker1 rev：ccggatccttagtagtcgtagtcaccgccgccg)PCR扩增序列10所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN60β2，得到包含序列10所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN60β2的扩增片段K。

2、将pT7linker1载体和扩增片段K均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μLNdeI和1μl BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时。并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段K。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的pT7linker1载体和扩增片段K，得到终产物，连接体系同上述步骤二的连接体系。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因CrCPN60β2被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-CrCPN60β2。

五、根据要克隆外源基因的序列设计引物(正向引物5′端加NdeI限制性酶切位点紧接起始密码子，反向引物加BamHI位点紧接终止密码子)，以含有外源基因的DNA分子为模板，利用以上引物进行扩增获得包含外源基因N4的片段。本实施例中根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因N4(序列11所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN20)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因CrCPN20的片段将CrCPN20基因克隆进pT7linker1载体

1、用引物(CrCPN20-T7linker1for：tacatatggctacccccgtgcccaagcag；CrCPN20-T7linker1 rev：ccggatccttacgagagctgggccaggatgtcgc)PCR扩增序列11所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN20，得到包含序列11所示的衣藻负责Rubisco折叠的分子伴侣素蛋白基因CrCPN20的扩增片段L。

2、将pT7linker1载体和扩增片段L均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μLNdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用gel回收试剂盒回收酶切后的pT7linker1载体和扩增片段L。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker1载体和扩增片段L，得到终产物，连接体系同上述步骤二的连接体系。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因CrCPN20被克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-CrCPN20。

如需要共表达更多的外源基因N5-Nn均按照步骤1-4所述的方法克隆到pT7linker1载体中，命名为pT7linker1-N5，......pTetlinker-Nn。此处实例仅克隆N1、N2、N3和N4基因。

六、多基因在pT7linker1载体中的串联，具体步骤如下：

1、取克隆有不同外源基因pT7linker1载体(pT7linker1-CrCPN60α和pT7linker1-CrCPN60β1)各500ng，用10μL不同的限制性内切酶体系进行酶切，两个载体分别使用SwaI(25℃，1h)和PacI(37℃，1h)进行酶切反应。

2、将两个反应体系均于65℃孵育20分钟使SwaI或PacI失活，得到SwaI酶切DNA产物和PacI酶切DNA产物；各取5μL DNA产物，加入0.5μL T4 DNA聚合酶，2μL 10×NEBuffer2.1，对于SwaI酶切DNA产物加入100mM dGTP 0.5μL，对于PacI酶切DNA产物加入100mM dCTP0.5μL，并用ddH2O补足至20μL，最终于25℃孵育30分钟，得到经T4 DNA聚合酶处理过的两个反应体系。

4、取2μL终产物转化E.coli DH5α，隔日挑选单克隆菌斑进行PCR验证，使用Linker1和Linker 2序列两侧引物序列两侧引物(pQTEV3U：5′-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3′和pQTEV3L：5′-CCAGTGATTTTTTTCTCCAT TTT-3′)，退火温度59℃。

验证阳性的克隆经测序确证后即为外源基因CrCPN60α和CrCPN60β共表达的载体。重复以上4步将CrCPN60β2再串联到外源基因CrCPN60α、CrCPN60β1的基因共表达载体得到外源基因CrCPN60α、CrCPN60β1和CrCPN60β2共表达载体和重复以上4步将CrCPN20再串联到外源基因CrCPN60α、CrCPN60β1和CrCPN60β2的载体得到外源基因CrCPN60α、CrCPN60β1、CrCPN60β2和CrCPN20共表达的载体，得质粒2。采用同样的方法可以将更多的外源基因N 5、N 6基因表达盒等等全部串联在pT7linker1载体中。

获得质粒2的结构示意图如图1所示。

实施例3质粒3的构建

一、构建pT7linker2载体

1、合成引物(chl-p15A for：agcggtatcagctcactcaaaggcacggtcacactgcttccg，ch1-p15Arev：aatggtttcttagacgtcaggtggccacaggtgcggttgctggc)PCR扩增质粒pACYC184(购自addgene：http：//www.addgene.org/)，得到序列12所示的扩增片段M，所述扩增片段M包含大肠杆菌p15A复制子(序列12第1215-2053位)和氯霉素抗性基因(序列12第194-853位)。

2、设计引物(pT7linker1 for：cacctgacgtctaagaaaccatt，pT7linker1 rev：Cctttgagtgagctgataccgct)扩增pT7linker1载体，得到去除pT7linker1载体上的大肠杆菌Coll复制子(序列7第2672-3260位)、氨苄青霉素抗性基因(序列7第3434-4291位)的表达盒的扩增片段N。

3、将扩增片段M和扩增片段N无缝克隆连接，得到连接产物，体系如实施例1中无缝克隆连接体系：

4、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker 2，其包括T7启动子(序列5第l-19位)、lac操纵子(序列5第20-44位)和T7转录终止子(序列5第161-203位)、LacI阻遏蛋白基因(序列7第994-2076位)的表达盒、大肠杆菌p15A复制子(序列12第1215-2053位)和氯霉素抗性基因(序列12第194-853位)、Linker1(序列7第4505-4547位)和Linker2(序列7第1-51位)。

二、根据要克隆外源基因的序列设计引物(正向引物5′端加NdeI限制性酶切位点紧接起始密码子，反向引物加BamHI位点紧接终止密码子)，以含有外源基因的DNA分子为模板，利用以上引物进行扩增获得包含外源基因E1的片段。如果NdeI和BamHI位点不能用，可采用无缝克隆方法。本实施例中根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因E1(序列13所示的拟南芥Rubisco组装分子伴侣蛋白基因AtRaf2)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AtRaf2的片段将AtRaf2基因克隆进pT7linker2载体，具体步骤如下：

1、用引物(AtRaf2-T7linker2 For：agaaggagatatacatatg；TCTAATCTGGCGCAGGATTTTCTT，AtRaf2-T7linker2 Rev：gctttgttagcagccgTCACGCCCAAGCTCTTTTCCTAGG)PCR扩增序列13所示的拟南芥Rubisco组装分子伴侣蛋白基因AtRaf2，得到包含序列13所示的拟南芥Rubisco组装分子伴侣蛋白基因AtRaf2的扩增片段O。

2、设计引物(pT7linker 2 for cggctgctaacaaagcccgaaagg，pT7linker2 rev：atgtatatctccttcttaaagtta)PCR扩增pT7linker2载体，得到扩增片段P。

3、扩增片段O和扩增片段P进行无缝克隆连接，得到连接产物，无缝克隆连接体系同实施例1。

4、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker2-AtRaf2。

三、根据要克隆外源基因的序列设计引物(正向引物5′端加NdeI限制性酶切位点紧接起始密码子，反向引物加BamHI位点紧接终止密码子)，以含有外源基因的DNA分子为模板，利用以上引物进行扩增获得包含外源基因E2的片段。本实施例中根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因E2(序列14所示的衣藻Rubisco组装分子伴侣蛋白基因CrRbcX1)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因CrRbcX1的片段将CrRbcX1基因克隆进pT7linker2载体，具体步骤如下：

1、用引物(CrRbcX1-T7linker2 for：cttcatatgcgg；ATGCATATCCCTGCGGATTCTT，CrRbcX1-T7linker2 rev：ccggatcctcacgcggcaccctt)PCR扩增序列14所示的衣藻Rubisco组装分子伴侣蛋白基因CrRbcX1，得到包含序列14所示的衣藻Rubisco组装分子伴侣蛋白基因CrRbcX1的扩增片段Q。

2、将pT7linker 2载体和扩增片段Q均用NdeI和BamHI酶切：2μL 10×NEBuffer，1μL NdeI和1μL BamH，500ng DNA并用ddH₂O补足至20μL，最终于37℃孵育2小时，并用ge1回收试剂盒回收酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段Q。

3、用T4 DNA连接酶连接两个回收的酶切后的pT7linker 2载体和扩增片段Q，得到终产物，连接体系同实施例2。

5、转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，确证外源基因CrRbcX1被克隆到pT7linker2载体中，命名为pT7linker2-CrRbcX1。

四、根据要克隆外源基因的序列设计引物(正向引物5′端加NdeI限制性酶切位点紧接起始密码子，反向引物加BamHI位点紧接终止密码子)，以含有外源基因的DNA分子为模板，利用以上引物进行扩增获得包含外源基因E3的片段。如果NdeI和BamHI位点不能用，可采用无缝克隆方法。本实施例中根据要克隆外源基因的序列设计引物，以含有外源基因E3(序列15所示的蓝细菌Rubisco组装分子伴侣蛋白基因AnaCARbcX)的DNA分子为模板，利用引物进行扩增获得包含外源基因AnaCARbcX的片段将AnaCARbcX基因克隆进pT7linker2载体，具体步骤如下：

1、用引物(AnaCARbcX-T7linker2 For：agaaggagatatacatatgatgaacctcaagcaaattgcg，AnaCARbcX-T7linker2 Rev：gctttgttagcagccgctaactggctaaattatcccagtca)PCR扩增序列15所示的蓝细菌Rubisco组装分子伴侣蛋白基因AnaCARbcX，得到包含序列15所示的蓝细菌Rubisco组装分子伴侣蛋白基因AnaCARbcX的扩增片段R。

3、扩增片段R和扩增片段P混合无缝克隆连接，得到连接产物，无缝克隆连接体系同实施例1。

4、取2μL连接产物转化大肠杆菌后，经过抗性筛选，挑选转化子验证并测序，得到的质粒命名为pT7linker2-AnaCARbcX。

如需要共表达更多的外源基因E4-En均按照步骤1-4所述的方法克隆到pT7linker2载体中，命名为pT7linker2-E4，pT7linker2-E5，......pT7linker2-En。此处实例仅克隆E1、E2和E3基因。

五、多基因在pT7linker2载体中的串联，具体步骤如下：

1、取克隆有不同外源基因pT7linker2载体(pT7linker2-AtRaf2和pT7linker2-CrRbcX1)各500ng，用10μL不同的限制性内切酶体系进行酶切，两个载体分别使用SwaI(25℃，1h)和PacI(37℃，1h)，进行酶切反应。

验证阳性的克隆经测序确证后即为外源基因AtRaf2和CrRbcX1共表达成套载体。重复以上4步将AnaCARbcX再串联到外源基因AtRaf2和CrRbcX1共表达成套载体，得到外源基因AtRaf2、CrRbcX1和AnaCARbcX共表达成套载体，即得质粒3。采用同样的方法可以将更多的外源基因E4、E5基因表达盒等等全部串联在pT7linker 2载体中。

获得质粒3的结构示意图如图1所示。

实施例4多质粒在大肠杆菌中的诱导表达

1、将上述构建的质粒1质粒2和质粒3通过电击转化法导入大肠杆菌BL21中，涂布含相应的抗生素壮观霉素、氨苄青霉素和氯霉素的平板上筛选，获取阳性单菌落；

2、挑选单菌落，接种至5ml LB液体培养基中(100mg/ml Amp⁺，100mg/ml Spe⁺，25mg/ml Chl⁺)，37℃，200rpm培养至OD600约0.4；

3、加入0.5mM IPTG诱导，37℃，200rpm，诱导3小时；

4、取出菌液，1000g，室温离心10min，弃上清。并用新鲜的LB液体培养基悬浮菌液，1000g，室温离心10min，弃上清；

5、加入含相应抗生素的LB液体培养基，同时加入四环素至300ng/ul，37℃诱导20h；

6、收集菌液，用100μl的裂解buffer I(100mM Tris-Cl pH7.5，50mM NaCl，2mMEDTA)悬浮菌液，超声取上清，以PAGE胶检验蛋白的诱导表达。

结果如图2所示，在三个质粒上串联的9个基因(即CrRbcL、CrRbcS、CrCPN60α、CrCPN60β1、CrCPN60β2、CrCPN20、AtRaf2、CrRbcX1和AnaCARbcX)均可以被诱导表达。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 一种多基因共表达成套载体及其应用

<130> GNCFY192044

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 60

cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg 120

gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact 180

gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc cgtcaggatg gcctttttgc gtttctacaa 240

actctgctag caagtaaggc cgacgagctt aattaacaac accatttgtc gaggttcgag 300

tccctatcag tgatagagat tgacatccct atcagtgata gagatactga gcacatcagc 360

aggacgcact gaccgaattc attaaattta actttaagaa ggagatatac atatgtagca 420

taaccctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc gcccaataac tagcataacc 480

ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgagt aacaacacca tttaaatgga 540

gtggttacaa atggagtggt taattaaggc tagcttggcg agacacagct aacaccacgt 600

cgtccctatc tgctgcccta ggtctatgag tggttgctgg ataactttac gggcatgcat 660

aaggctcgta ggctatattc agggagacca caacggtttc cctctacaaa taattttgtt 720

taactttgaa ataaggaggt aatacaaatg tctcgtttag ataaaagtaa agtgattaac 780

agcgcattag agctgcttaa tgaggtcgga atcgaaggtt taacaacccg taaactcgcc 840

cagaagctag gtgtagagca gcctacattg tattggcatg taaaaaataa gcgggctttg 900

ctcgacgcct tagccattga gatgttagat aggcaccata ctcacttttg ccctttagaa 960

ggggaaagct ggcaagattt tttacgtaat aacgctaaaa gttttagatg tgctttacta 1020

agtcatcgcg atggagcaaa agtacattta ggtacacggc ctacagaaaa acagtatgaa 1080

actctcgaaa atcaattagc ctttttatgc caacaaggtt tttcactaga gaatgcatta 1140

tatgcactca gcgctgtggg gcattttact ttaggttgcg tattggaaga tcaagagcat 1200

caagtcgcta aagaagaaag ggaaacacct actactgata gtatgccgcc attattacga 1260

caagctatcg aattatttga tcaccaaggt gcagagccag ccttcttatt cggccttgaa 1320

ttgatcatat gcggattaga aaaacaactt aaatgtgaaa gtgggtctta ataagcgact 1380

aaaaaattga atgtaggaaa ccaacatgcc agttcgagca ataactagca taaccccttg 1440

gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaacct caggcgagaa gcacacggca 1500

cggtcacact gcttccggta gtcaataaac cggtaaacca gcaatagaca taagcggcta 1560

tttaacgacc ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcatcgtg gccggatctt gcggcccctc 1620

ggcttgaacg aattgttaga cattatttgc cgactacctt ggtgatctcg cctttcacgt 1680

agtggacaaa ttcttccaac tgatctgcgc gcgaggccaa gcgatcttct tcttgtccaa 1740

gataagcctg tctagcttca agtatgacgg gctgatactg ggccggcagg cgctccattg 1800

cccagtcggc agcgacatcc ttcggcgcga ttttgccggt tactgcgctg taccaaatgc 1860

gggacaacgt aagcactaca tttcgctcat cgccagccca gtcgggcggc gagttccata 1920

gcgttaaggt ttcatttagc gcctcaaata gatcctgttc aggaaccgga tcaaagagtt 1980

cctccgccgc tggacctacc aaggcaacgc tatgttctct tgcttttgtc agcaagatag 2040

ccagatcaat gtcgatcgtg gctggctcga agatacctgc aagaatgtca ttgcgctgcc 2100

attctccaaa ttgcagttcg cgcttagctg gataacgcca cggaatgatg tcgtcgtgca 2160

caacaatggt gacttctaca gcgcggagaa tctcgctctc tccaggggaa gccgaagttt 2220

ccaaaaggtc gttgatcaaa gctcgccgcg ttgtttcatc aagccttacg gtcaccgtaa 2280

ccagcaaatc aatatcactg tgtggcttca ggccgccatc cactgcggag ccgtacaaat 2340

gtacggccag caacgtcggt tcgagatggc gctcgatgac gccaactacc tctgatagtt 2400

gagtcgatac ttcggcgatc accgcttccc tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 2460

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 2520

aacaaatagc tagctcactc ggtcgctacg ctccgggcgt gagactgcgg cgggcgctgc 2580

ggacacatac aaagttaccc acagattccg tggataagca ggggactaac atgtgaggca 2640

aaacagcagg gccgcgccgg tggcgttttt ccataggctc cgccctcctg ccagagttca 2700

cataaacaga cgcttttccg gtgcatctgt gggagccgtg aggctcaacc atgaatctga 2760

cagtacgggc gaaacccgac aggacttaaa gatccccacc gtttccggcg ggtcgctccc 2820

tcttgcgctc tcctgttccg accctgccgt ttaccggata cctgttccgc ctttctccct 2880

tacgggaagt gtggcgcttt ctcatagctc acacactggt atctcggctc ggtgtaggtc 2940

gttcgctcca agctgggctg taagcaagaa ctccccgttc agcccgactg ctgcgcctta 3000

tccggtaact gttcacttga gtccaacccg gaaaagcacg gtaaaacgcc actggcagca 3060

gccattggta actgggagtt cgcagaggat ttgtttagct aaacacgcgg ttgctcttga 3120

agtgtgcgcc aaagtccggc tacactggaa ggacagattt ggttgctgtg ctctgcgaaa 3180

gccagttacc acggttaagc agttccccaa ctgacttaac cttcgatcaa accacctccc 3240

caggtggttt tttcgtttac agggcaaaag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 3300

gatcctttga tcttttctac tgaaccgctc tagatttcag tgcaatttat ctcttcaaat 3360

gtagcacctg aagtcagccc catacgatat aagttgtaat tctcatgtta gtcatgcccc 3420

gcgcccaccg gaaggagctg actgggttga aggctctcaa gggcatcggt cgagatccc 3479

<210> 2

<211> 2154

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 60

cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg 120

gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact 180

gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc cgtcaggatg gcctttttgc gtttctacaa 240

actctgctag caagtaaggc cgactcgagt ccctatcagt gatagagatt gacatcccta 300

tcagtgatag agatactgag cacatcagca ggacgcactg accgaattca ttaaatttaa 360

ctttaagaag gagatataca tatgcgtaaa ggtgaagaac tgttcaccgg tgttgttccg 420

atcctggttg aactggacgg tgacgttaac ggtcacaaat tctctgttcg tggtgaaggt 480

gaaggtgacg ctaccaacgg taaactgacc ctgaaattca tctgcaccac cggtaaactg 540

ccggttccgt ggccgaccct ggttaccacc ctgacctacg gtgttcagtg cttcgctcgt 600

tacccggacc acatgaaaca gcacgacttc ttcaaatctg ctatgccgga aggttacgtt 660

caggaacgta ccatctcttt caaagacgac ggtacctaca aaacccgtgc tgaagttaaa 720

ttcgaaggtg acaccctggt taaccgtatc gaactgaaag gtatcgactt caaagaagac 780

ggtaacatcc tgggtcacaa actggaatac aacttcaact ctcacaacgt ttacatcacc 840

gctgacaaac agaaaaacgg tatcaaagct aacttcaaaa tccgtcacaa cgttgaagac 900

ggttctgttc agctggctga ccactaccag cagaacaccc cgatcggtga cggtccggtt 960

ctgttgccgg acaaccacta cctgtctacc cagtctgttc tgtctaaaga cccgaacgaa 1020

aaacgtgacc acatggttct gctggaattc gttaccgctg ctggtatcac ccacggtatg 1080

gacgaactgt acaaagatgc atgccagttc tagcataacc ctaatgagtg agctaactta 1140

cattaattgc gttgcgcctt aattaacggc actcctcagc aaatataatg accctcttga 1200

taacccaaga gggcattttt taatgcccat ggcgtttacc acagctaaca ccacgtcgtc 1260

cctatctgct gccctaggtc tatgagtggt tgctggataa ctttacgggc atgcataagg 1320

ctcgtaggct atattcaggg agaccacaac ggtttccctc tacaaataat tttgtttaac 1380

tttgaaataa ggaggtaata caaatgtctc gtttagataa aagtaaagtg attaacagcg 1440

cattagagct gcttaatgag gtcggaatcg aaggtttaac aacccgtaaa ctcgcccaga 1500

agctaggtgt agagcagcct acattgtatt ggcatgtaaa aaataagcgg gctttgctcg 1560

acgccttagc cattgagatg ttagataggc accatactca cttttgccct ttagaagggg 1620

aaagctggca agatttttta cgtaataacg ctaaaagttt tagatgtgct ttactaagtc 1680

atcgcgatgg agcaaaagta catttaggta cacggcctac agaaaaacag tatgaaactc 1740

tcgaaaatca attagccttt ttatgccaac aaggtttttc actagagaat gcattatatg 1800

cactcagcgc tgtggggcat tttactttag gttgcgtatt ggaagatcaa gagcatcaag 1860

tcgctaaaga agaaagggaa acacctacta ctgatagtat gccgccatta ttacgacaag 1920

ctatcgaatt atttgatcac caaggtgcag agccagcctt cttattcggc cttgaattga 1980

tcatatgcgg attagaaaaa caacttaaat gtgaaagtgg gtcttaataa gcgactaaaa 2040

aattgaatgt aggaaaccaa catgccagtt cgagcaataa ctagcataac cccttggggc 2100

ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaacctcagg cgagaagcac acgg 2154

<210> 3

<211> 422

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatggtct ggaccccggt caacaacaag atgttcgaga ccttctccta cctgcctcct 60

ctgaccgacg agcagatcgc cgcccaggtc gactacatcg tcgccaacgg ctggatcccc 120

tgcctggagt tcgctgaggc cgacaaggcc tacgtgtcca acgagtcggc catccgcttc 180

ggcagcgtgt cttgcctgta ctacgacaac cgctactgga ccatgtggaa gctgcccatg 240

ttcggctgcc gcgaccccat gcaggtgctg cgcgagatcg tcgcctgcac caaggccttc 300

cccgatgcct acgtgcgcct ggtggccttc gacaaccaga agcaggtgca gatcatgggc 360

ttcctggtcc agcgccccaa gactgcccgc gacttccagc ccgccaacaa gcgctccgtg 420

ta 422

<210> 4

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggttccac aaacagaaac taaagcaggt gctggattca aagccggtgt aaaagactac 60

cgtttaacat actacacacc tgattacgta gtaagagata ctgatatttt agctgcattc 120

cgtatgactc cacaactagg tgttccacct gaagaatgtg gtgctgctgt agctgctgaa 180

tcttcaacag gtacatggac tacagtatgg actgacggtt taacaagtct tgaccgttac 240

aaaggtcgtt gttacgatat cgaaccagtt ccgggtgaag acaaccaata cattgcttac 300

gtagcttacc caatcgactt attcgaagaa ggttcagtaa ctaacatgtt cacttctatt 360

gtaggtaacg tattcggttt caaagcttta cgtgctctac gtcttgaaga ccttcgtatt 420

ccacctgctt acgttaaaac attcgtaggt cctccacacg gtattcaggt agaacgtgac 480

aaattaaaca aatatggtcg tggtctttta ggttgtacaa tcaaacctaa attaggtctt 540

tcagctaaaa actacggtcg tgcagtttat gaatgtttac gtggtggtct tgactttact 600

aaagacgacg aaaacgtaaa ctcacaacca ttcatgcgtt ggcgtgaccg tttccttttc 660

gttgctgaag ctatttacaa agctcaagca gaaacaggtg aagttaaagg tcactactta 720

aacgctactg ctggtacttg tgaagaaatg atgaaacgtg cagtatgtgc taaagaatta 780

ggtgtaccta ttattatgca cgactactta acaggtggtt tcacagctaa cacttcatta 840

gctatctact gtcgtgacaa cggtcttctt ctacacatcc accgtgctat gcacgcggtt 900

attgaccgtc aacgtaacca cggtattcac ttccgtgttc ttgctaaagc tcttcgtatg 960

tctggtggtg accaccttca ctctggtact gttgtaggta aactagaagg tgaacgtgaa 1020

gttactctag gtatcgtaga cttaatgcgt gatgactacg ttgaaaaaga ccgtagccgt 1080

ggtatttact tcactcaaga ctggtgttca atgccaggtg ttatgccagt tgcttcaggc 1140

ggtattcacg tatggcacat gccagcttta gttgaaatct tcggtgatga cgcatgtctt 1200

cagttcggtg gtggtactct aggtcaccct tggggtaacg ctccaggtgc tgcagctaac 1260

cgtgtagctc ttgaagcttg tactcaagct cgtaacgaag gtcgtgacct tgctcgtgaa 1320

ggtggcgacg taattcgttc agcttgtaaa tggtctccag aacttgctgc tgcatgtgaa 1380

gtttggaaag aaattaaatt cgaatttgat actattgaca aactttaa 1428

<210> 5

<211> 203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60

tgtttaactt taagaaggag atatacatat gggatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg 120

aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta 180

aacgggtctt gaggggtttt ttg 203

<210> 6

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagcggataa caatttcaca cagaattcat taaagaggag aaattaacta tgggatccca 60

tatggcggcg gtcgacgcgg ccgcctagga cccagctttc ttgtacaaag tggtaagctt 120

aattagctga gcttggactc ctgttgatag atccagtaat gacctcagaa ctccatctgg 180

atttgttcag aacgctcggt tgccgccggg cgttttttat tggtgagaat 230

<210> 7

<211> 4587

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtaacaaca ccatttaaat ggagtggtta caaatggagt ggttaattaa ggctagcttg 60

gcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc 120

gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa 180

tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa 240

aataagcaca agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat 300

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tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag tgaataccac 420

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<210> 8

<211> 1647

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<210> 10

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggccaagg agctgcactt caaccgcaac atggaggcgc tgaagaagat gcaggctggt 60

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<210> 11

<211> 588

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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<210> 12

<211> 2565

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacggtcaca ctgcttccgg tagtcaataa accggtaaac cagcaataga cataagcggc 60

tatttaacga ccctgccctg aaccgacgac cgggtcgaat ttgctttcga atttctgcca 120

ttcatccgct tattatcact tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac 180

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ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga 540

gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga acactatccc 600

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tatgtgatac aggatatatt ccgcttcctc gctcactgac tcgctacgct cggtcgttcg 1380

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tttcgttttc agagcaagag attacgcgca gaccaaaacg atctcaagaa gatcatctta 2040

ttaatcagat aaaatatttc tagatttcag tgcaatttat ctcttcaaat gtagcacctg 2100

aagtcagccc catacgatat aagttgtaat tctcatgttt gacagcttat catcgataag 2160

ctttaatgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcaggcacc gtgtatgaaa 2220

tctaacaatg cgctcatcgt catcctcggc accgtcaccc tggatgctgt aggcataggc 2280

ttggttatgc cggtactgcc gggcctcttg cgggatatcg tccattccga cagcatcgcc 2340

agtcactatg gcgtgctgct agcgctatat gcgttgatgc aatttctatg cgcacccgtt 2400

ctcggagcac tgtccgaccg ctttggccgc cgcccagtcc tgctcgcttc gctacttgga 2460

gccactatcg actacgcgat catggcgacc acacccgtcc tgtggatcct ctacgccgga 2520

cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggc 2565

<210> 13

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgtctaatc tggcgcagga ttttcttggt gacttcggag ctcgtgaccc ttacccggag 60

gagatagcga gtcaattcgg agataaagtg ttgggatgcc aaagcactga gcacaagatt 120

ttgataccaa acgcatctgt tttgtctctc tcccagcttc agtgttcccc tgtttcgtct 180

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agtatagtgg ataatgaagc gggtggtctg aaaataaggt gtatgtggaa agtgagggat 300

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<212> DNA

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<400> 14

atgcggatgc atatccctgc ggattctttt tcgggggctt cgccagagcg taaagctgct 60

gtagccctgc ggtcgctgtt cacgtttgtt gcagctcggg tggtgctgga gcagctgcag 120

ggccccggcg gccctgagac cacctacaac cagcaggcat acctagacct gatggacttc 180

ctgggcacgc ccatgaaggg cgatggcggc gacgagtgga tggccgctgt catgaggaag 240

aaccacgctt tggccctgcg cctgatggag gtgcgcgagg cctacctgga cgagtttgag 300

tggggaaaga ccatggagat ggccagccgc gagacgcgcg aggccaacac acgcctcatg 360

cgcgcggcgg ccatggccag cctgcaggcg tctctgacgg agccggtggg cggcggtgcc 420

ggcgccggct gcatgtctat ggaggacctg gacggccccg gcaagggtgc cgcgtga 477

<210> 15

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgaacctca agcaaattgc gaaagataca gccaaaacac tccaaagcta cctgacttat 60

caggcactaa ggactgtgct ggcacagcta ggcgaaacaa atccaccgtt ggcactttgg 120

ctgcataact tttctgccgg gaaagtccag gatggcgaaa aatacatcga agaactcttt 180

ctcgaaaagc ctgacttagc attgcgaata atgacagtca gagaacatat agctgaagaa 240

atcgctgaat tcctaccaga aatggttgtg actggtattc agcaagccaa catggaaaaa 300

cgccgccagc atttagaacg catgacgcag gtgagtttat cccatcccag tcctgagtca 360

gaacaacagc aattttccga tcctgactgg gataatttag ccagttag 408

Claims

1.一种多基因共表达的成套载体，其特征在于：所述成套载体包括质粒1、质粒2和质粒3；所述质粒1、质粒2和质粒3均含有不相同的复制子、不相同的抗性基因、诱导外源基因表达的调控基因和一到多个串联的外源基因表达盒。

2.根据权利要求1所述的成套载体，其特征在于：所述复制子为序列1第2574-3312位所示的大肠杆菌CDF复制子、序列7第2672-3260位所示的大肠杆菌Col1复制子或序列12第1215-2053位所示的大肠杆菌p15A复制子。

3.根据权利要求1或2所述的成套载体，其特征在于：所述抗性基因为序列1第1646-2434位所示的壮观霉素抗性基因、序列7第3434-4291位所示的氨苄青霉素抗性基因或序列12第194-853位所示的氯霉素抗性基因。

4.根据权利要求1-3任一所述的成套载体，其特征在于：所述诱导外源基因表达的调控基因为序列1第748-1371位所示的四环素抑制蛋白基因或序列7第994-2076位所示的LacI阻遏蛋白基因。

5.根据权利要求1-4任一所述的成套载体，其特征在于：所述一到多个串联的外源基因表达盒位于诱导外源基因表达的调控基因的下游，所述一到多个串联的外源基因表达盒和诱导外源基因表达的调控基因间还包含如序列1第265-295位所示或序列7第4505-4547位所示的Linker1，在所述一到多个串联的外源基因表达盒的的下游还包含如序列1第518-583位所示或序列7第1-51位所示的Linker2。

6.根据权利要求1-5任一所述的成套载体，其特征在于：当所述诱导外源基因表达的调控基因为序列1第748-1371位所示的四环素抑制蛋白基因时，所述外源基因表达盒的启动子为序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子；当所述诱导外源基因表达的调控基因为序列7第994-2076位所示的LacI阻遏蛋白基因时，所述外源基因表达盒的启动子为序列5第1-19位所示的T7启动子，且所述T7启动子的下游还包括序列5第20-44位所示的Lac操纵子。

7.根据权利要求1-6任一所述的成套载体，其特征在于：所述质粒1包含依次连接的序列1第2574-3312位所示的大肠杆菌CDF复制子、序列1第1646-2434位所示的壮观霉素抗性基因、序列1第748-1371位所示的四环素抑制蛋白基因、序列1第265-295位所示的Linker1、一到多个串联的外源基因表达盒、序列1第518-583位所示所示的Linker2；所述外源基因表达盒包含依次连接的序列1第296-386位所示的四环素诱导启动子、外源基因和序列1第475-517位所示的T7转录终止子；

8.根据权利要求7所述的成套载体，其特征在于：所述质粒1包含两个串联的外源基因表达盒，所述两个串联的外源基因表达盒的外源基因分别为衣藻Rubisco的大亚基基因和衣藻Rubisco的小亚基基因；

所述质粒2的外源基因包含四个串联的外源基因表达盒，所述四个串联的外源基因表达盒的外源基因分别为衣藻Rubisco大亚基基因折叠的四个分子伴侣素基因；

所述质粒3包含三个串联的外源基因表达盒，所述三个串联的外源基因表达盒的外源基因分别为拟南芥Rubisco组装的两个分子伴侣蛋白基因和蓝细菌Rubisco组装的分子伴侣蛋白基因。

9.根据权利要求8所述的成套载体，其特征在于：

所述小亚基基因的序列如序列3所示，所述大亚基基因的序列如序列4所示；

所述衣藻负责Rubisco大亚基基因折叠的四个分子伴侣素蛋白基因分别如序列8、序列9、序列10和序列11所示；

所述拟南芥Rubisco组装的分子伴侣蛋白基因如序列13和序列14所示；

所述蓝细菌Rubisco组装的分子伴侣蛋白基因如序列15所示。

10.权利要求1-9任一所述的成套载体在诱导多基因共表达中的应用。