KR20150003947A - 구제역 a형 한국분리주를 이용한 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 A형 한국 분리 바이러스(A/KOR/Pocheon/2010)의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하고, 구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 갖는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

Description

구제역 A형 한국분리주를 이용한 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법{Recombinant foot-and-mouth disease virus using Korean isolated strain of FMDV A serotype and the manufacturing method}

본 발명은 구제역 A형 한국분리주를 이용한 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 구제역 A형 한국 분리 바이러스(A/KOR/Pocheon/2010)의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하고, 구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 갖는 재조합 구제역 바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 국가간 전파가 가능한 매우 중요한 동물질병으로 분류되어 있으며, 이러한 특성 때문에 축산물의 국가간 교역에 있어 발생유무는 가장 중요한 점검요소로 작용하고 있다.

상기 구제역 병원체는 단일가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다.

구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus) A형 중에서도 ME-SA(중동-남아시아), AFRICA(아프리카), ASIA(아시아)의 3 가지의 지역형이 있다. 이 지역형간에도 변이율이 높아 바이러스 공격에 대한 방어가 되지 않는 경우가 많아 A형 바이러스에 대한 여러 종류의 백신의 개발이 필요한 실정이다.

A형 구제역은 2010년에 한국에서 처음으로 발생하였다. 이 당시에는 구제역 백신 접종을 실시하지 않았으나, 한국 주변지역에 2009년부터 A형의 구제역이 발생되고 있었다. 그러나 비축되어 있는 구제역 백신주는 세계적으로 널리 사용되는 A22/Iraq/24/64 바이러스 백신주이지만, 우리나라에서 발생된 바이러스와는 항원 연관성이 낮아 그 백신이 접종되더라도 방어 면역성은 비교적 낮을 것으로 추정되었다.

2010년 11월 대규모의 구제역 발생이후 처음에는 O형 백신만을 접종하다가 2011년 하반기에 O, A, Asia1형 3가 백신을 접종하기 시작하였고, 그 중 A형은 2010년 1월에 발생한 바이러스와 항원성이 중간 정도로 연관성이 있는 A Malaysia 97 바이러스주가 포함된 백신을 2011년 하반기부터 사용하였다.

한국에서 분리된 바이러스는 아시아 지역형으로서, 유전적으로는 Sea-97 계통(Sea-97 lineage)에 속하는 바이러스이며, 상기 바이러스는 아시아 지역에서 발생하는 바이러스로 현재까지도 아시아 지역에서 발생하고 있어, 상기 바이러스에 대한 백신의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 구제역 A형 아시아 지역형 바이러스에 대해 적절하게 방어하기 위하여, 한국에서 분리된 구제역 A형 바이러스(A/KOR/Pocheon/2010)의 유전자 전체 게놈을 플라스미드에 클로닝한 바이러스 벡터를 기초로, 상기 구제역 A형 한국분리주와 항원형이 동일한 새로운 구제역 재조합 바이러스를 제공할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 구비하여 백신 종독주로 유용하게 사용될 수 있는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 적어도 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스(A/KOR/Pocheon/2010)의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하고, 구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 갖는 재조합 구제역 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계, 및 (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 동아시아, 중국 또는 대만 등 한국 주변에서 발생하는 구제역 A형 바이러스 아시아 지역형을 효과적으로 방어할 수 있는 구제역 백신을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스는 바이러스 역가가 원래의 바이러스와 크게 차이를 보이지 않으면서, 동아시아, 중국 등 한국 주변에서 발생하는 구제역 A형 바이러스 아시아 지역형을 효과적으로 방어할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 구제역 A형 한국 분리주를 이용한 재조합 바이러스의 게놈 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 구제역 A형 한국 분리주의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pA-Kor-Poc)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다.
도 4는 구제역 바이러스가 감염된 세포에서의 바이러스 감염세포(형광항체법 검출) 및 세포변성효과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 염소 태아 혀 세포주(ZZ-R), 돼지 신장 세포주(IBRS-2) 및 햄스터 세포주(BHK-21)에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 적어도 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스(A/KOR/Pocheon/2010)의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하고, 구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 구제역 A형 아시아 지역형은 Sea-97 유전자형인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스에서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 (1) 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계, 및 (2) 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에 관한 것이다.

상기에서 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계는 통상적으로 유전자를 플라스미드에 삽입하는 방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 (1) 단계에서 구축된 재조합 플라스미드를 세포에 주입하는 상기 (2) 단계에서의 세포는 염소 태아 혀 세포(ZZ-R), 돼지 신장 세포주(IBRS-2) 및 햄스터 세포주(BHK-21) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스의 제조방법에서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신에 관한 것이다.

본 발명의 상기 백신은 약독 생백신이거나 불활화된 백신일 수 있고, 상기 백신을 제조하는 방법은 통상적인 백신의 제조방법을 이용할 수 있으면 족하므로, 이에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.

이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합 플라스미드 pA-Kor-Poc의 제작

구제역 A형 한국 분리 바이러스(A/KOR/Pocheon/2010)의 전체 유전자(진뱅크 억세션 넘버 KC588943를 PCR에 의하여 증폭하고, 플라스미드(pBluescript SK II)에 상기 A/KOR/Pocheon/2010의 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pA-Kor-Poc를 제작하였다.

상기에서, PCR 증폭은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

일반적으로 cDNA 합성시 사용되는 랜덤 프라이머를 이용하여 상기 한국 분리 바이러스에 대한 cDNA 작성후 이것을 이용하여 한국 분리 바이러스 유전자 정보를 기초로 증폭이 가능한 특이 프라이머들(GenBank Accession No. KC588943)을 기초로 5' 및 3' 유전자의 각 20 mers씩에 해당)를 작성하여 PCR을 실시하였으며, PCR를 위한 조건은 5X buffer (FINNZYMES, 10㎕), 10mM dNTPs (1㎕), Phusion enzyme (2U/㎕, 0.5㎕), 멸균증류수 (35.5㎕)의 용량으로 98℃ 30초 후 98℃ 10초, 65℃ 30초, 72℃ 2분 30초간 25 싸이클, 최종 72℃ 10분으로 반응을 실시하였다.

도 1은 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pA-Kor-Poc)의 모식도를 나타낸 것이다. 상기 재조합 플라스미드 pA-Kor-Poc는 서열번호 1의 염기서열을 갖는다.

<실시예 2> 재조합 구제역 바이러스의 회복

재조합 구제역 바이러스의 회복은 확보된 상기 재조합 플라스미드(pA-Kor-Poc)를 제한효소로 반응시킨 뒤, BHKT7-9 세포(T7 RNA polymerase가 발현되는 세포주)에서 바이러스를 확보한 후, ZZ-R(염소 태아 혀) 세포, 돼지 신장 세포주(IBRS-2) 및 BHK-21(햄스터 세포주)에서 증식시키고, BHK-21 세포에서 세포변성 효과를 확인하였다.

도 2는 구제역 A형 한국 분리주의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드(pA-Kor-Poc)의 모식도를 나타낸 것이다.

도 3은 간이 항원 킷트를 이용하여 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스에서 발현된 단백질이 구제역 항원 양성 반응을 보임을 나타낸 것이다. 회복된 바이러스 배양 상층액 25㎕를 간이항원 키트(PBM Co. Ltd.)로 구제역에 대한 구조 단백질(SP)에 대한 양성반응을 확인할 수 있다.

도 4는 구제역 바이러스가 감염된 세포에서의 바이러스 감염세포(형광항체법 검출) 및 세포변성효과를 보여주는 사진이다. 실험실에서 회복되어 재형성된 바이러스가 세포에 감염되어 형광항체법으로 바이러스의 감염을 검출가능하였고, 세포를 변성시키는 효과도 보였다.

도 5는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스가 염소 태아 혀 세포주(ZZ-R), 돼지 신장 세포주(IBRS-2) 및 햄스터 세포주(BHK-21)에서 자라서 바이러스 역가를 형성함을 보여주는 그래프이다. 도 5를 참조하면, 본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 야외 바이러스와 유사한 바이러스 역가를 나타냄을 알 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 보유하는 본 발명에 의한 재조합 구제역 바이러스를 이용한 구제역 백신을 제공함으로써, 구제역의 치료 및/또는 예방에 기여할 수 있다.

<110> Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency <120> Recombinant foot-and-mouth disease virus using Korean isolated strain of FMDV A serotype and the manufacturing method <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11040 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant plasmid pA-Kor-Poc <400> 1 tatgtaatac gactcactat agggttgaaa gggggcgtta gggtcccacc cctagcatgc 60 caacgactgc tcctgcgttg cactccacac ttacgttcgt gtacgcggga accgatagac 120 taccgttcac ccacctgcag ctggactcat gacaccgcgt ggtcatttag ctggattgtg 180 cggacgaaca ccgcttgcgc acctcgcgtg accgattagt actctcacca ccttccgcct 240 acttggtcgt cagcgctgtc ctgggcaccc ctgttggggg ccgctcgatg ctctacggtt 300 tcccccgcag cgggctacgg tgatggggcc gcctcgtgcg ggttgatcgt ttggtgtgcc 360 tcggttgtga tccgaagctc acctttcatc cccccccccc cccctaagca ctaccgtcgt 420 tcccgacgtt aaagggatga aactacaagc ttagcgcctt cgtgtccgaa gtcaaaggac 480 tacaaccgca agtttgagcc gccttttccg gtgttaatgg aatgtaacca caagatggac 540 cttcttccgg aagtaaaacg gtaatctcac acagttttgc 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Claims (9)

1. 적어도 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스(A/KOR/Pocheon/2010)의 전체 유전자가 삽입된 플라스미드를 포함하고, 구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 유전자가 삽입된 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
3. 제1항에 있어서, 상기 구제역 A형 아시아 지역형은 Sea-97 유전자형인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스.
5. (1). 진뱅크 억세션 넘버 KC588943의 염기서열을 갖는 구제역 A형 한국 분리 바이러스의 전체 유전자를 플라스미드에 삽입하는 단계; 및
   (2). 상기 (1) 단계에서 얻은 플라스미드를 세포에 주입하여 증식시키는 단계를 포함하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 염소 태아 혀세포(ZZ-R), 돼지 신장 세포주(IBRS-2) 및 햄스터 세포주(BHK-21) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 구제역 백신용 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 구제역 바이러스의 제조방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신.

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