KR102165358B1 - 구제역 바이러스 a형 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 바이러스 A형 백신 조성물 및 개체에서 구제역 바이러스 A형에 대한 면역 반응을 생성하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 구제역 백신 조성물 및 면역반응 생성 방법은 동아시아, 중국 또는 대만 등 한국과 주변 국가에서 발생하는 구제역 A형 바이러스 아시아 지역형을 효과적으로 방어하는데 유용하다.

Description

구제역 바이러스 A형 백신 조성물{VACCINE COMPOSITION FOR FOOT AND MOUTH DISEASE VIRUS A SEROTYPE}

본 발명은 구제역 바이러스 A형에 대한 면역반응 생성에 관여하는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 이들을 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 개체에서 구제역 바이러스 A형에 대한 면역반응을 생성하는 방법에 관한 것이다.

구제역(Foot and Mouth Disease, FMD)은 가축(소, 돼지, 양, 염소, 사슴 등) 및 다양한 야생 동물을 포함하는, 발굽이 갈라진 우제류에서 나타나는 바이러스성 질환으로, 입, 코, 유두, 발굽 등에 수포가 형성되는 것이 특징이다. FMD는 전염성이 매우 강하고 치사율이 40% 이상으로 사회 경제적으로 미치는 영향이 큰 질병이다. 이 때문에 국제수역사무국(OIE)에서 FMD를 A급 질병으로 분류하여 관리하고 있으며, 대부분 국가에서도 제1종 가축전염병으로 지정하여 관리하고 있다. 게다가, 경제적으로 엄청난 손상을 준 FMD 집단발병이 거의 모든 대륙에서 과거 십 년에 걸쳐 일어났다.

구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)는 피코르나바이러스과의 애프도바이러스속에 속하는 단일가닥 포지티브 RNA 바이러스로서, 침입력이 강할 뿐만 아니라 감염 범위가 넓다. 잠복기간은 동물마다 다르나 약 6~10일 정도로 짧다. 또한 임상 증상을 나타내기 이전에 이미 바이러스를 체외로 배설하기 때문에 전파가 쉽게 일어날 수 있다. FMDV는 호흡기, 소화기, 생식기 등을 통해 감염되는데, 특히 호흡기로 배출된 바이러스는 최고 250km까지 공기를 통해 전파될 수 있다. FMDV는 VP1의 코딩 영역 서열에 따라 7가지의 혈청형(O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3, Asia 1)으로 구분되며, 각 혈청형은 유전자 특성에 따라 최대 80여 종의 서브타입으로 분류된다. 그동안 한국을 포함한 아시아와 유럽 등지에서 문제되던 구제역은 대부분 O형이었으며, 이에 따라 한국은 지금까지 O형 백신 위주로 접종을 실시하였다. 그러나 최근 국내 일부 지역에서 발생한 FMD는 A형 바이러스가 추가 감염을 일으킨 것으로 확인되었다. A형 FMDV는 ME-SA(중동-남아시아), AFRICA(아프리카), ASIA(아시아)의 3가지의 지역형이 있다. 이 지역형 간에도 변이율이 높아 바이러스 공격에 대한 방어가 되지 않는 경우가 많기 때문에, A형 바이러스에 대한 여러 종류의 백신의 개발이 필요하다. 특히 최근 국내에서 발생한 FMD는 Sea-97 계통(Sea-97 lineage)에 속하는 바이러스에 의한 것으로, 이 바이러스는 아시아 지역에서 계속적으로 발생하고 있다. 현재 A형 FMDV에 대한 백신은 존재하지만 상기 바이러스에 대한 항원 연관성이 낮아 그 백신이 접종되더라도 방어 면역성은 비교적 낮을 것으로 추정된다. 따라서, FMD의 효과적 예방 및 감염에 의한 경제적 피해를 막기 위해 A형 FMDV, 특히 Sea-97 계통(Sea-97 lineage)에 속하는 바이러스에 대한 백신이 강력하게 요구되는 실정이다.

본 발명의 일 목적은 구제역 바이러스 A형에 대한 면역반응을 생성할 수 있는 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 구제역 바이러스 A형에 대한 면역반응을 생성할 수 있는 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 구제역 바이러스 A형에 대한 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 개체에서 구제역 바이러스 A형에 대한 면역반응을 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 제공한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열은 구제역 바이러스 A 혈청형의 VP1 영역에 해당하는 서열일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "상동성"은 주어진 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 폴리펩티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 상기 상동성은 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 예를 들어 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 바람직하게 구제역 바이러스 A형 아시아 지역형으로부터 유래한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게 구제역 바이러스 A ASIA Sea-97형으로부터 유래한 것일 수 있다. 가장 바람직하게 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 GDMM/CHA/2013-S(KF450794), CAM/2/2008(HQ116294), MAY/4/2012(KT223560), A/VIT/3/2008(HQ116371), MAY/97 또는 VN/T11D/2013 균주들로부터 유래한 것일 수 있다. 일 구체예에서, GDMM/CHA/2013-S, CAM/2/2008, MAY/4/2012, 및 A/VIT/3/2008 바이러스의 VP1 영역 서열의 공통서열을 조사한 후, 미스매치되는 부분 및 중화항체 생성에 중요한 서열을 VN/T11D/2013 바이러스의 VP1을 바탕으로 재조합하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 생성하였다. 용어 "재조합"은 자연계에 존재하지 않거나, 또는 자연계에서 발견되지 않는 배열로 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드에 연결된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드의 반합성, 또는 합성 기원을 의미한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열은 바람직하게 서열번호 2의 아미노산 서열일 수 있다. 일 구체예에서, GDMM/CHA/2013-S, CAM/2/2008, MAY/4/2012 및 A/VIT/3/2008 바이러스의 VP1 영역 서열의 공통서열을 조사한 후, 미스매치되는 부분 및 중화항체 생성에 중요한 서열을 MAY/97 바이러스의 VP1을 바탕으로 재조합하여 서열번호 2의 아미노산 서열을 생성하였다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열 및 상기 서열번호 2의 아미노산 서열 각각은 최근 국내에서 발생한 A ASIA Sea-97 계통의 구제역 바이러스와 상동성이 높으며, 국내 검역원이 보유한 MAY/97 또는 VN/T11D/2013 바이러스와도 상동성이 높다. 특히 서열번호 1의 아미노산 서열은 최근 국내에서 발생한 A ASIA Sea-97 계통의 구제역 바이러스와 상동성이 더욱 높다. 따라서, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 구제역 바이러스 A형에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 항원으로서 효과적으로 작용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 구제역 바이러스의 VP 2 내지 4 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

상기 폴리펩티드에서 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열은 바람직하게 구제역 바이러스부터 유래한 VP 2, VP 3 및 VP 4 단백질에 해당하는 아미노산 서열과 순차적으로 연결될 수 있다. 예를 들면, VP 4 영역 아미노산 서열 - VP 2 영역 아미노산 서열 - VP 3 영역 아미노산 서열- 서열번호 1의 아미노산 서열(또는 서열번호 2의 아미노산 서열)의 순서로 연결될 수 있다. 각 아미노산 서열 사이에는 추가적인 아미노산 서열이 포함될 수 있다. 예를 들면, 각 VP 영역의 서열 사이에는 퓨린 절단 부위(furin cleavage site)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 IgE leader 서열 및/또는 2A 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 IgE leader 서열 - VP 4 영역 아미노산 서열 - VP 2 영역 아미노산 서열 - VP 3 영역 아미노산 서열 - 서열번호 1의 아미노산 서열(또는 서열번호 2의 아미노산 서열) - 2A 아미노산 서열을 포함할 수 있다 (바람직하게는 상기 순서대로 포함). 또한 이 경우 바람직하게 각 영역의 서열 사이에는 퓨린 절단 부위의 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다.

상기 VP 2 내지 VP 4 단백질의 아미노산 서열은 바람직하게 A형 구제역 바이러스로부터 유래한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게 A24/Cruzeiro 바이러스로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 VP 2 내지 VP 4 단백질의 아미노산 서열은 각각 바람직하게 서열번호 3의 아미노산 서열에 포함된 해당 영역의 아미노산 서열일 수 있다. 또한 상기 VP 2 내지 VP 4 단백질의 아미노산 서열이 연결된 아미노산 서열은 바람직하게 서열번호 3의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 VP 2, VP 3 및 VP 4 단백질 아미노산 서열을 포함하며, 또한 각 VP 단백질 사이에 퓨린 절단 부위의 아미노산 서열을 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다. 또한 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 보다 바람직하게 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 면역반응을 생성하고자 하는 동물에 최적화된 코돈으로 변경시킨 서열일 수 있다. 상기 동물은 예를 들면, 돼지, 소, 양 등 구제역이 발병할 수 있는 동물이면 모두 포함되며, 바람직하게 돼지일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 서열과 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 서열번호 1의 서열과 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열은 바람직하게 서열번호 2의 아미노산 서열일 수 있다. 상기 서열번호 1의 서열과 90% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1의 서열과 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 제공한다.

용어 "플라스미드"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 플라스미드는 벡터, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 본 명세서에서 플라스미드는 벡터(또는 바이러스 벡터)와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 플라스미드에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 달리 언급하지 않는 한 상기에서 언급한 바와 동일하다. 상기 포함되는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 보다 바람직하게 서열번호 4 또는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 플라스미드는 구제역 바이러스의 VP 2 내지 4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 또한 이 경우, 상기 플라스미드에서 서열번호 4 또는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열은 구제역 바이러스의 VP 2 내지 4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 연결될 수 있으며, 바람직하게 구제역 바이러스부터 유래한 VP 2, VP 3 및 VP 4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 순차적으로 연결될 수 있다. 예를 들면, 상기 플라스미드는 VP 4 영역의 뉴클레오티드 서열 - VP 2 영역의 뉴클레오티드 서열 - VP 3 영역의 뉴클레오티드 서열 - 서열번호 2 또는 3의 뉴클레오티드 서열의 순서(5'->3' 기준)로 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 각 영역의 뉴클레오티드 서열 사이에는 추가적인 뉴클레오티드 서열이 포함될 수 있다. 상기 추가적인 뉴클레오티드 서열은 퓨린 절단 부위 영역에 해당하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 VP 2 내지 VP 4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게 A형 구제역 바이러스로부터 유래한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게 A24/Cruzeiro 바이러스로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 VP 2 내지 VP 4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 바람직하게 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열에 포함된 해당 영역의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 또한 상기 VP 2, VP3 및 VP 4 영역의 뉴클레오티드 서열이 연결된 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직하게 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 플라스미드는 가장 바람직하게 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4 또는 5, 및 A24/Cruzeiro 바이러스로부터 유래한 VP 2, VP3 및 VP 4 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한 상기 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열은 Kozak 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 플라스미드를 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공한다.

상기 구제역 백신 조성물에서 상기 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 플라스미드는 달리 언급하지 않는 한 상기한 바와 같다.

용어 "백신"은 개체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.

상기 백신은 DNA 백신일 수 있다. 용어 "DNA 백신"이라 함은, 병원균이나 바이러스 등의 유전자들 중 일부를 인공적으로 복제한 후 이를 투여함으로써 면역반응을 야기하는 백신을 의미한다. 이러한 DNA 백신은 기존 단백질 백신에 비해서 다양한 장점을 갖는 바, i) 우선 순수한 표적 병원체 항원의 유전정보만으로 합성제작이 가능하기 때문에 위험한 병원체를 직접 취급할 필요가 없으며, ii) 독성 유발에 필요한 유전자들 중 일부만을 사용하므로 투여체에 투여되더라도 별다른 독성을 나타낼 염려가 없고, iii) 플라스미드 DNA만으로 구성되는 단순함 때문에 갑자기 발생하는 다양한 감염병에 대해서 신속하게 대응하여 백신을 개발하는 것이 가능하다는 등 다양한 장점들을 보유한다.

상기 구제역 백신 조성물은 바람직하게 구제역 바이러스 A형 아시아 지역형에 대한 방어 면역능을 갖는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게 구제역 바이러스 A 아시아 Sea-97 계통에 속할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.

상기 백신 조성물은 다양한 형태로 개체에 주입될 수 있다. "주입"은 피하주사, 근육내 주사, 피하내 주사, 복막내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.

상기 백신조성물은 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 보조제 등을 포함할 수 있다. 적절한 보조제에는 펩티드, 알루미늄 하이드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 옥시드 및 Marcol 52 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일 및 하나 이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸세시틴, 다가 양이온, 다가 음이온 같은 표면 활성물질 등이 포함된다.

본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 구제역 바이러스 A형에 대한 면역반응을 생성하는 방법을 제공한다.

상기 면역반응 생성 방법에서 상기 백신 조성물은 달리 언급하지 않는 한 상기한 바와 같다.

용어 "면역 반응"은 항원의 도입에 대한 반응으로의 숙주의 면역계, 예를 들어 포유동물의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포 반응 또는 체액 반응, 또는 둘 모두의 형태일 수 있다.

상기 면역반응 생성 방법에서 본 발명의 백신 조성물은 효과량의 유효 성분, 즉, 전체 재조합 폴리펩티드, 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 플라스미드를 약학적으로 허용가능한 담체 및 보조제와 함께 포함할 수 있다. 상기 개체는 동물일 수 있으며, 바람직하게 유제류에 속하는 동물, 예를 들면 돼지, 소 또는 양일 수 있다. 용어 "효과량"은 백신의 성분이 백신접종되는 동물에서 구제역 바이러스 A형에 대해 특이적 면역 반응을 유도하기에 충분한 양임을 의미한다. 효과량은 당 분야의 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 예를 들면 동물에서의 통상적인 실험을 통해 결정될 수 있다.

상기 투여는 DNA 백신의 투여에 적합한 임의의 경로로 투여될 수 있고, 예를 들면 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신 조성물은 A형, 특히 A형 아시아 Sea-97 계통에 속하는 구제역 바이러스에 대해 높은 면역원성을 나타내는 DNA 백신 조성물을 제공할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 백신 조성물은 동아시아, 중국 또는 대만 등 한국 및 주변 국가에서 발생하는 A형 구제역 바이러스 아시아 지역형을 효과적으로 방어하는데 매우 유용하다.

도 1은 최근 아시아 지역에서 발생한 4종의 A형 구제역 바이러스(GeneBank Accession no.: HQ116371, HQ116294, KF450794 및 KT223560)의 VP1 아미노산 서열을 분석한 결과이다.
도 2는 4종의 A형 구제역 바이러스(GeneBank Accession no.: HQ116371, HQ116294, KF450794 및 KT223560) 및 A24/Cruzeiro 바이러스의 VP1 아미노산 서열 중 미스매치되는 부위에서 중화항체 발생에 중요한 위치(에피토프)를 조사하여 얼라인먼트한 결과이다.
도 3은 검역원이 보유한 2종의 A형 바이러스(MAY/97 및 VN/T11D/2013)와 상기 5종의 구제역 바이러스를 함께 얼라인먼트한 결과이다.
도 4는 MAY/97 바이러스에 근거하여 도출된 새로운 형태의 VP1의 아미노산 서열(A-1 type)을 나타낸다.
도 5는 VN/T11D/2013 바이러스에 근거하여 도출된 새로운 형태의 VP1의 아미노산 서열(A-2 type)을 나타낸다.
도 6은 pGX9008의 VP1 영역을 신규 합성 유전자 VP1으로 대체하는 전략을 보여주는 모식도이다.
도 7은 시퀀싱으로 확인된 서열과 신규 합성 유전자 VP1 서열을 얼라인먼트한 결과를 보여준다.
도 8은 마우스에서 본 발명의 백신 투여에 따른 항체 형성 효과를 SPC ELISA로 분석한 결과를 나타낸다.
도 9는 미니피그에서 본 발명의 백신 투여에 따른 항체 형성 효과를 SPC ELISA로 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 미니피그에서 본 발명의 백신 투여에 따른 중화 항체 형성 효과를 보여준다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 연천 A형 구제역 바이러스와 pGX9008 간 상동성 분석

2017년 2월 국내 연천에서 발생한 구제역은 혈청형 A 바이러스로 판정되었으며, 유전자분석을 통해 계통은 A ASIA Sea-97로 확인되었다. 또한 아시아에서 발생한 A형 바이러스와 상동성 분석결과(VP1 영역의 633개 뉴클레오티드 서열 비교), 2016년 베트남(소, 돼지) 바이러스(VIT/14/2016)와 99.8%, 2016년 미얀마(소) 바이러스(VIT/16/2016)와 99.7%, 2013년 중국 광동성(돼지) 바이러스(GDMM/CHA/2013-S)와 99.5%의 상동성을 나타냈다.

연천에서 발생한 구제역 바이러스와 남미형 구제역 바이러스 백신 pGX9008 간 상동성 분석을 위해, GB 데이터베이스(NCBI)에서 이용할 수 있는 GDMM/CHA/2013-S (연천 A형과 99.5% 일치)의 서열을 활용하였다 (GDMM/CHA/2013-S (연천 A형과 99.5% 일치)와 약 3개의 뉴클레오티드 서열이 상이하였고, 아미노산 서열로 번역시 최대 1개가 상이하지만 거의 동일하다고 판단함). GDMM/CHA/2013-S와 pGX9008의 P1 구조 단백질의 일부인 VP1 부위의 아미노산 서열을 비교한 결과, 178/211(84%)의 상동성을 보였다.

따라서 현재 보유중인 남미형 구제역 바이러스 백신 pGX9008은 우리나라를 비롯한 동남아시아에서 발생하는 FMD-A 혈청형에 대한 백신효과가 없을 것이므로 국내 또는 아시아 지역에 맞는 백신개발이 필요함을 확인하였다.

실시예 2. pGX9008의 VP1 영역 재조합을 위한 아시아 지역에 발생한 A형 FMDV 서열 조사

WRLFMD 웹 사이트로부터 최근 아시아지역에서 발생한 A형 구제역 바이러스의 VP1에 대한 ME report를 조사하였다. 조사 대상은 베트남, 대만, 한국, 러시아, 라오스, 미얀마, 카자흐스탄, 캄보디아, 말레이시아, 몽고, 필리핀, 태국, 네팔, 일본, 홍콩, 부탄 및 방글라데시 총 17개 국가이다. 이 중에서, 필리핀, 대만, 네팔, 일본, 홍콩, 부탄 및 방글라데시는 최근 A형 구제역 바이러스가 발생한 적이 없는 것으로 확인되었다. ME report 결과로부터 pGX9008의 VP1 영역 재조합을 위한 균주로서 NCBI GeneBank에서 뉴클레오티드 서열 정보를 알 수 있는(GeneBank Accession 번호가 있는) 4종의 균주를 선택하였다(표 1).

Country	Related virus	Accession no.	Nucleotide %Id
Vietnam (VIT)	GDMM/CHA/2013-S	KF450794	99.5~99.8%
South Korea	GDMM/CHA/2013-S	KF450794	99.5%
Russia	GDMM/CHA/2013-S	KF450794	98.11~99.69%
Myanmar	GDMM/CHA/2013-S	KF450794	99.84%
Laos	GDMM/CHA/2013-S	KF450794	99.53%
Kazakhstan	GDMM/CHA/2013-S	KF450794	99.53%
Mongolia	GDMM/CHA/2013-S	KF450794	98.4%
Thailand	GDMM/CHA/2013-S	KF450794	98.58~98.74%
Cambodia	CAM/2/2008	HQ116294	96.86%
Malaysia	MAY/4/2012	KT223560	94.97%
Malaysia	A/VIT/3/2008	HQ116371	96.52%

조사된 균주 중 4종의 균주 (GDMM/CHA/2013-S(KF450794), CAM/2/2008(HQ116294), MAY/4/2012(KT223560), A/VIT/3/2008(HQ116371))의 뉴클레오티드 서열을 아미노산 서열로 변환하였다. 변환된 아미노산 서열을 Clustal/muscle을 이용하여 얼라인먼트를 수행한 결과, 22개의 아미노산 미스매치를 확인하였다. 얼라인먼트 결과를 Jalview를 통해 정리한 데이터를 도 1에 나타냈다.

실시예 3. 중화항체 생성에 중요한 에피토프 영역 조사

실시예 2에서 확인한 미스매치되는 서열들 중에서 중화항체 발생에 중요한 부위(에피토프)를 논문(Res Vet Sci. 2017 Dec;115:374-381., Arch Virol. 2016 Oct;161(10):2705-16., Virus Res. 2014 Mar 6;181:72-6., 및 Vet Microbiol. 2011 Apr 21;149(1-2):242-7. 등)을 통해 조사하여 얼라인먼트를 수행하였다. 도 2는 중화항체 발생과 관련된 에피토프를 얼라인먼트한 결과를 보여준다.

또한 검역원이 보유하고 있는 A형 구제역 바이러스 균주 2종(MAY/97, VN/T11D/2013)도 함께 얼라인먼트 하였으며, 그 결과를 도 3에 나타냈다.

실시예 4. 신규 A형 구제역 바이러스 VP1 영역 합성

4.1. 신규 VP1 영역 서열 결정

GDMM/CHA/2013-S를 비교 대상 바이러스로 삼고 공격접종할 MAY/97과 VN/T11D/2013에 따라 에피토프 영역의 서열을 결정하고, 그에 따른 각 아미노산 서열을 갖는 2가지 종류의 VP1 영역 아미노산 서열을 pGX9008의 VP1 영역 재조합을 위한 후보로 선정하였다. MAY/97 바이러스에 기반한 VP1 아미노산 서열을 'New type A-1'으로 명명하고, VN/T11D/2013에 기반한 VP1 아미노산 서열을 'New type A-2'으로 명명하였다.

New type A-1과 New type A-2의 서열과 종래 A형 바이러스와 서열의 상동성을 분석한 결과, 다음과 같은 결과를 나타냈다.

New type A-2를 이용하여 재조합하는 경우, 공격접종 할 MAY/97과 VN/T11D/2013에 상동성이 높으며, 최근 한국에서 발생한 균주와도 상동성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라, New type A-2를 이용하여 pGX9008의 VP1 영역을 재조합함으로써 신규 DNA 백신을 생성하고 그 효능을 확인하였다.

4.2. 신규 VP1 영역 서열 재조합

신규 A 혈청형으로 제작될 FMDV VP1 염기서열(서열번호 4)을 돼지 코돈으로 최적화시켰다. 이 돼지 코돈으로 최적화된 유전자 서열(서열번호 5)을 pGX9008의 VP1 서열 대체에 이용하였다. 신규 A 혈청형으로 돼지 코돈 최적화된 합성 유전자 VP1 부위를 pGX9008의 VP1에 대체하는 전략은 도 6과 같다.

구체적으로, 신규 A 혈청형으로 돼지 코돈 최적화된 합성유전자 VP1 부위가 클로닝된, pUC57-FMD new type A-2 플라스미드 (Genscript사 합성)에 제한효소 BstBI/XhoI으로 처리하여 얻은 인서트(774bp)와 pGX9008 플라스미드에 BstBI/XhoI를 처리해서 얻은 벡터 백본을 라이게이션시켜 여러 클론을 확보하였다.

확보된 클론들은 시퀀싱을 통해 의도한 pGX-FMD new type A-2 서열이 들어간 클론을 최종적으로 확인하였다. 시퀀싱으로 확인된 서열과 FMD new type A-2 돼지 코돈 최적화 서열을 얼라인먼트 수행한 결과, 100% 일치하는 것을 확인하였다(도 7). 상기 FMD New type A-2 돼지 코돈 최적화 서열을 하기에서 FMD DNA 플라스미드 백신 제조에 이용하였다.

실시예 5. 신규 DNA 백신의 항체 형성 효과 확인

5.1. FMD DNA 플라스미드 백신 제조

FMD DNA 플라스미드(FMD new type A-2 돼지 코돈 최적화 서열 함유)를 보유한 대장균을 LB 배지 2.5 L에 접종 후, 37℃에서 밤새 배양하였다. 그리고 나서 배양된 대장균으로부터 EndoFree Plasmid Giga kit (QIAGEN, Cat#12391)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 추출된 플라스미드를 엔도톡신-프리 물(Endo-free water)에 녹여 -70℃에 보관하였다. 보관된 플라스미드는 이후 동물에서의 항체 형성 효과 측정 실험(백신 접종 효과 확인)에 사용하였다. 이하에서는 제조된 신규 DNA 백신을 'PLS-A'라 명명한다.

5.2. 마우스에서 백신의 항체 형성 효과 확인

5.2.1. DNA 백신 접종

마우스 C57BL/6 (6주령, 암컷) 15마리를 그룹당 5마리씩 총 3그룹으로 나눈 다음, 각 그룹별로 아래와 같이 본 발명의 백신, 기존 백신, 목(mock) 플라스미드 접종을 2주 간격으로 3회 실시하였다. 전기천공(electroporation) 기기(cellectra 2000)를 이용하여 접종하였으며, 30㎍/마리 농도로 DNA 백신을 투여하였다.

· 그룹 1(대조군) - Mock 플라스미드 DNA

· 그룹 2(비교군) - FMD DNA type A (남미형-A24 cruzeiro, 기존 백신)

· 그룹 3(실험군) - FMD DNA type A (PLS-A, 아시아형, 본 발명의 백신)

채혈은 투여 전(0주차), 2차 투여 후(3주차) 및 3차 투여 후(5주차)에 안와채혈 방법을 이용하여 실시하였다. 채혈된 혈액으로부터 혈청(serum)을 분리하여 -80℃에 보관하였다. 보관된 혈청은 녹여서 SPC (solid phase competition) ELISA 분석을 실시하였다.

5.2.2. 항체 형성 측정 - SPC ELISA 분석

SPC ELISA는 PrioCHECK FMDV Type A ELISA KIT (Prionics lelystad B.V/네덜란드)를 사용하였으며, 실험방법은 키트 제조사에서 제공한 실험 프로토콜에 따라 수행하였다.

그 결과는 도 8에 나타내었다. 도 8에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 백신 PLS-A는 기존 백신(남미형-A24)에 비해 항체가 형성되기까지 소요되는 시간이 유의적으로 적었으며, 반응억제도(PI값)가 높은 것을 확인하였다. 여기에서, 반응억제도(PI값)가 높을수록 구제역 혈청형 A에 대한 특이적 항체가 많이 생성되었다는 것을 의미한다.

전술한 바와 같이 구제역은 전염성이 매우 강하고, 임상 증상을 나타내기 전에 이미 구제역 바이러스를 체외로 배설함으로써 동물간 전파가 쉽게 일어날 뿐만 아니라, 잠복기간이 매우 짧다는 특징을 갖고 있다. 따라서, 구제역에 대해 백신으로서 효과적인 기능을 나타내기 위해서는, 구제역 바이러스를 억제하는 효과가 우수해야 할 뿐만 아니라 구제역 바이러스에 대한 항체 생성 속도도 빨라야 할 것이다. 본 발명에 따른 백신을 투여할 경우 구제역 바이러스에 대한 억제능을 유의적으로 우수할 뿐만 아니라, 항체 생성 속도가 기존 백신에 비해 유의적으로 빨라 구제역 전염을 조기에 억제할 수 있으므로, 구제역에 대한 백신으로서 매우 효과적이다.

5.3. 미니피그에서 백신의 항체 형성 효과 확인

5.3.1. DNA 백신 접종

SPF-괴팅겐 미니피그 (4개월, 수컷) 9마리를 그룹당 3마리씩 총 3그룹으로 나눈 다음, 아래와 같이 각 그룹별로 3주 간격으로 3회 백신접종을 실시하였다. 전기천공(electroporation) 기기(cellectra 2000)를 이용하여 0.5mg/마리의 농도로 뒷다리 안쪽 근육에 백신 투여를 실시하였으며, 불활화 사백신은 2ml 목 뒤의 근육에 투여하였다. 9주차에 3mg/마리 농도로 각 백신을 추가 투여하였다.

· 그룹 1(음성대조군) - Mock 플라스미드 DNA

· 그룹 2(양성대조군) - 불활화 사백신 (코미팜, 혈청형 O/A 2가 백신)

· 그룹 3(실험군) - FMD DNA type A (PLS-A, A형, 본 발명의 백신)

투여 전(0주차), 1차 투여 후 (3주차), 2차 투여 후(6주차) 및 4차 투여 후(12주차)에 채혈을 실시하였다. 채혈된 혈액으로부터 혈장(Plasma)을 분리하고, 분리된 혈장은 -80℃에 보관하였다. 보관된 혈장은 녹여서 SPC (solid phase competition) ELISA 분석을 실시하였다.

5.3.2. 항체 형성 측정 - SPC ELISA 분석

SPC ELISA는 PrioCHECK FMDV Type A ELISA KIT (Prionics lelystad B.V/네덜란드)를 사용하였으며, 실험방법은 키트 제조사에서 제공한 실험 프로토콜에 따라 수행하였다.

그 결과는 도 9에 나타내었다. 도 9에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 백신 PLS-A는 4차 투여 후 12주차에 반응억제도(PI값)가 현저하게 증가하였으며, 특히 양성대조군인 불활성화 사백신에 비해서도 더 높은 수치가 확인되었다.

5.4. 미니피그에서 백신 투여에 따른 중화 항체 형성 효과 확인

5.4.1. DNA 백신 접종

SPF-괴팅겐 미니피그 (4개월, 암컷) 9마리를 그룹당 3마리씩 총 3 그룹으로 나눈 후, 3주 간격으로 3회 백신접종을 실시하였다. 투여한 DNA 백신의 농도는 6mg/마리이며, 전기천공 기기(cellectra 2000)를 이용하여 뒷다리 안쪽 근육에 백신 투여를 실시하였으며, 불활화 사백신은 2ml 목 뒤 근육에 투여하였다.

· 그룹 1(음성대조군) - Mock 플라스미드 DNA

· 그룹 2(양성대조군) - 불활화 사백신 (코미팜, 혈청형 O/A 2가 백신)

· 그룹 3(실험군) - 3가 FMD DNA type A (PLS-A, A형) + O형 + Asia1형

그룹 3에서 3가 백신을 제작하는데 사용된 O형과 Asia1형은 시판되는 것을 구입하였다. 투여 후(9주차)에 채혈을 실시하고 채혈된 혈액으로부터 혈장(Plasma)을 분리하고, 분리된 혈장은 -80℃에 보관하였다. SPC (solid phase competition) ELISA 분석과 중화능 시험 시 분리된 혈장을 녹여서 VNT 중화능 시험을 실시하였다.

5.4.2. Virus neutralization test (VNT-중화능 시험)

가검혈청을 이용하여 농림축산검역본부 구제역백신연구센터에서 중화시험을 수행하였으며, OIE 메뉴얼에 따라 실시하였다.

중화역가 확인을 위한 VNT는 A형 MAY/97 구제역 바이러스를 사용하였다. A/MAY/97 100 TCID50과 가검혈청, 양성혈청, 음성혈청 등을 적정한 희석배율로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. LFBK (fetal porcine kidney cell line) 세포주를 분주하고 2~3일 반응한 후, 세포변성효과(cytopathic effect)를 관찰하였다. 중화항체가 양성기준은 OIE 양성기준 16배(로그값 1.20)이며, 국내검정기준은 돼지기준 32배(로그값 1.51)이다.

그 결과는 도 10에 나타내었다. 도 10에서 볼 수 있듯이, 투여 후 9주차에 PLS-A를 포함하는 3가 DNA 백신은 모든 개체들에게서 200배 이상의 중화항체가를 나타내었으며, 양성인 것으로 확인되었다.

또한, 도 9는 2가 백신 양성대조군과 본 발명에 따른 백신의 반응억제도(PI값)를 비교한 것인 반면, 도 10에는 2가 백신 양성대조군과 본 발명에 따른 백신을 포함하는 3가 백신의 반응억제도(PI값)를 비교한 것이 보여진다. 여기서 본 발명에 따른 백신은 단독으로 작용할 때에도 A형 FMDV에 대해 우수한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 다른 타입과 함께 3가 백신의 형태로 작용할 때에도 A형 FMDV에 대해 우수한 효과를 나타낸다는 점을 알 수 있다. 이는 본 발명에 따른 백신이 단가 백신과 다가 백신으로서 모두 활용성이 높다는 것을 의미한다.

<110> Plumbline Life Sciences, Inc. <120> VACCINE COMPOSITION FOR FOOT AND MOUTH DISEASE VIRUS A SEROTYPE <130> DP17052KR <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> New type A-2 VP1 <400> 1 Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu 1 5 10 15 Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ala Gln Arg Arg His His Thr Asp Val 20 25 30 Gly Phe Leu Met Asp Arg Phe Val Gln Ile Lys Pro Val Ser Pro Thr 35 40 45 His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala 50 55 60 Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val 65 70 75 80 Asn His Thr Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala 85 90 95 Ala Leu Asn Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Phe 100 105 110 Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr 115 120 125 Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Arg Arg Gly 130 135 140 Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser 145 150 155 160 Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala Thr Glu Ile Gln Glu Leu Leu Val 165 170 175 Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val 180 185 190 Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala 195 200 205 Lys Gln Leu Leu 210 <210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> New type A-1 VP1 <400> 2 Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu 1 5 10 15 Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ala Gln Arg Arg His His Thr Asp Val 20 25 30 Ser Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Val Ser Pro Thr 35 40 45 His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala 50 55 60 Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val 65 70 75 80 Asn His Thr Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala 85 90 95 Ala Leu Asp Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Phe 100 105 110 Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr 115 120 125 Val Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Thr Pro Gly Ala Arg Arg Gly 130 135 140 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ccactgctta ccacaaagcg ccgttcacga ggcttgcgct cccctacacc 360 gcgccacacc gcgtgctggc aactgtgtac agcgggacga gcaagtactc cacacctcaa 420 acacggcgag gtgacctggg tcctctcgcg gcgaggctcg ctgcacagct ccctgcctcc 480 ttcaacttcg gtgcaattcg ggccacggag atccaagaac tccttgtgcg catgaagcgc 540 gccgagctct actgccccag gccactgttg gcggtggagg tgtcgtcgca agacagacac 600 aagcagaaaa tcattgcccc tgcaaaacaa ctcctg 636 <210> 5 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nex type A-2 VP1 DNA porcine codon optimization <400> 5 acaacagcca caggagaatc cgccgaccca gtgacaacca ccgtggagaa ctacggagga 60 gagacacagg ctcagcgccg gcaccacacc gacgtgggct tcctgatgga caggttcgtg 120 cagatcaagc ccgtgagccc aacccacgtg atcgacctga tgcagaccca ccagcacggc 180 ctggtgggag ctatgctgag ggctgccacc tactacttct ccgacctgga gatcgtggtg 240 aaccacaccg gaaacctgac ctgggtgcca aacggagctc cagaggccgc cctgaacaac 300 accagcaacc ccaccgccta ccacaaggct ccattcacca ggctggccct gccatacacc 360 gctccacacc gggtgctggc taccgtgtac tccggcacca gcaagtactc caccccacag 420 accaggagag gcgacctggg accactggct gctaggctgg ctgctcagct gccagcctcc 480 ttcaacttcg gagctatcag ggctaccgag atccaggagc tgctggtgag gatgaagaga 540 gccgagctgt actgccccag gccactgctg gctgtggagg tgtccagcca ggacagacac 600 aagcagaaga tcatcgcccc agccaagcag ctgctg 636 <210> 6 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGX9008 VP4-VP2-VP3 DNA <400> 6 gataagaaaa cagaggaaac caccctgctg gaggacagaa tcctgaccac aagaaacggg 60 cacactacca gcacaactca gtcttcagtg ggcgtcacac acggatactc aactgaggaa 120 gaccatgtgg ccgggccaaa taccagtggc ctggagacac gagtggtcca ggctgaaagg 180 ttctacaaga aatatctgtt tgactggacc acagataagg ccttcggcca cctggagaaa 240 ctggaactcc cctcagacca ccacggcgtg ttcggccatc tggtcgatag ctacgcctat 300 atgagaaacg gatgggacgt ggaggtctcc gctgtgggca accagttcaa tggcggatgc 360 ctgctcgtgg ctatggtgcc cgagtggaag gaatttgata ccagggaaaa ataccagctg 420 acactcttcc cacaccagtt tatctctcct agaactaaca tgaccgccca tattaccgtg 480 ccttatctgg gcgtcaatcg gtacgaccag tataagaaac acaaaccttg gaccctggtg 540 gtcatggtgg tcagtcccct cacagtgaac aatactagcg ccgctcagat caaggtctac 600 gccaacattg ctccaaccta tgtgcacgtc gcaggagagc tgccttccaa ggaacgggga 660 cgcaaacggc gctctgggat cttcccagtg gcatgtgctg acggatacgg agggctggtc 720 actaccgacc ctaagaccgc agatcccgcc tacggaaaag tgtataaccc acccaggact 780 aattacccag ggcggttcac caacctgctc gatgtggcag aggcctgccc caccttcctg 840 tgctttgacg atggcaagcc atacgtgaca actcggacag acgatactcg cctgctcgcc 900 aagtttgacc tgagcctcgc agccaaacac atgtcaaaca cctacctgag tggaatcgcc 960 cagtactata ctcagtattc cgggaccatt aatctgcatt tcatgtttac cggctctaca 1020 gactcaaagg ctcgctacat ggtggcatat atccctcccg gcgtcgagac cccacctgat 1080 acacctgaaa gggctgcaca ctgcatccat gccgagtggg acacaggact gaacagcaag 1140 ttcacttttt ccattcccta cgtgtctgcc gctgactacg cttataccgc atccgatact 1200 gccgaaacca ttaacgtgca gggatgggtc tgtatctacc agattactca cgggaaagcc 1260 gagaatgaca ccctggtggt ctccgtgtct gctggcaagg acttcgaact gcgcctccct 1320 atcgatcccc gacagcag 1338 <210> 7 <211> 2400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> new type VP for FMDV 2 serotype vaccine <400> 7 gccaccatgg attggacatg gattctgttc ctggtggctg ctgctactag agtgcattca 60 ggggccggac agtcttcacc cgcaaccgga tcacagaacc agagtggaaa taccgggagc 120 atcattaaca attactatat gcagcagtac cagaacagca tggacacaca gctgggggat 180 aacgccatca gcggcggcag caatgagggc tccacagata ccacatctac tcacactacc 240 aatacccaga acaatgactg gttctctaaa ctggcaagct ccgccttcac cggcctcttt 300 ggagctctgc tcgcaagggg aagaaagagg agaagcgata agaaaacaga ggaaaccacc 360 ctgctggagg acagaatcct gaccacaaga aacgggcaca ctaccagcac aactcagtct 420 tcagtgggcg tcacacacgg atactcaact gaggaagacc atgtggccgg gccaaatacc 480 agtggcctgg agacacgagt ggtccaggct gaaaggttct acaagaaata tctgtttgac 540 tggaccacag ataaggcctt cggccacctg gagaaactgg aactcccctc agaccaccac 600 ggcgtgttcg gccatctggt cgatagctac gcctatatga gaaacggatg ggacgtggag 660 gtctccgctg tgggcaacca gttcaatggc ggatgcctgc tcgtggctat ggtgcccgag 720 tggaaggaat ttgataccag ggaaaaatac cagctgacac tcttcccaca ccagtttatc 780 tctcctagaa ctaacatgac cgcccatatt accgtgcctt atctgggcgt caatcggtac 840 gaccagtata agaaacacaa accttggacc ctggtggtca tggtggtcag tcccctcaca 900 gtgaacaata ctagcgccgc tcagatcaag gtctacgcca acattgctcc aacctatgtg 960 cacgtcgcag gagagctgcc ttccaaggaa cggggacgca aacggcgctc tgggatcttc 1020 ccagtggcat gtgctgacgg atacggaggg ctggtcacta ccgaccctaa gaccgcagat 1080 cccgcctacg gaaaagtgta taacccaccc aggactaatt acccagggcg gttcaccaac 1140 ctgctcgatg tggcagaggc ctgccccacc ttcctgtgct ttgacgatgg caagccatac 1200 gtgacaactc ggacagacga tactcgcctg ctcgccaagt ttgacctgag cctcgcagcc 1260 aaacacatgt caaacaccta cctgagtgga atcgcccagt actatactca gtattccggg 1320 accattaatc tgcatttcat gtttaccggc tctacagact caaaggctcg ctacatggtg 1380 gcatatatcc ctcccggcgt cgagacccca cctgatacac ctgaaagggc tgcacactgc 1440 atccatgccg agtgggacac aggactgaac agcaagttca ctttttccat tccctacgtg 1500 tctgccgctg actacgctta taccgcatcc gatactgccg aaaccattaa cgtgcaggga 1560 tgggtctgta tctaccagat tactcacggg aaagccgaga atgacaccct ggtggtctcc 1620 gtgtctgctg gcaaggactt cgaactcaga ctccccattg acccaagaca gcagagaggc 1680 agaaaaagac gcagcacaac agccacagga gaatccgccg acccagtgac aaccaccgtg 1740 gagaactacg gaggagagac acaggctcag cgccggcacc acaccgacgt gggcttcctg 1800 atggacaggt tcgtgcagat caagcccgtg agcccaaccc acgtgatcga cctgatgcag 1860 acccaccagc acggcctggt gggagctatg ctgagggctg ccacctacta cttctccgac 1920 ctggagatcg tggtgaacca caccggaaac ctgacctggg tgccaaacgg agctccagag 1980 gccgccctga acaacaccag caaccccacc gcctaccaca aggctccatt caccaggctg 2040 gccctgccat acaccgctcc acaccgggtg ctggctaccg tgtactccgg caccagcaag 2100 tactccaccc cacagaccag gagaggcgac ctgggaccac tggctgctag gctggctgct 2160 cagctgccag cctccttcaa cttcggagct atcagggcta ccgagatcca ggagctgctg 2220 gtgaggatga agagagccga gctgtactgc cccaggccac tgctggctgt ggaggtgtcc 2280 agccaggaca gacacaagca gaagatcatc gccccagcca agcagctgct gcgcggccgg 2340 aaacgacgct ctaattttga cctcctgaaa ctggctggcg atgtggaatc taaccctggc 2400 2400 <210> 8 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> new type A-1 DNA <400> 8 accaccgcca ccggggaatc agcagaccct gtcacaacca ccgttgagaa ctacggtggc 60 gagacacaag cacagcggcg tcaccacacc gacgtcagct tcataatgga caggttcgtg 120 cggatcaagc ctgtgagccc cacacatgtc attgacctca tgcagacaca ccaacacggg 180 ctggtgggcg ccatgttgcg cgcggccacc tactactttt ctgatcttga gattgtggtg 240 aaccacacgg gtaacctaac gtgggtaccc aatggagcac ccgaggcagc actggataac 300 acgagcaacc ccactgctta ccacaaagcg ccgttcacga ggcttgcgct cccctacacc 360 gcgccacacc gcgtgctggc aactgtgtac aatgggacga gcaagtactc cacacctgga 420 gcccggcgag gtgacctggg ttctctcgcg gcgagactcg ctgcacagct ccctgcctcc 480 ttcaacttcg gtgcaattcg ggccacggag atccaggaac tccttgtgcg catgaagcgc 540 gccgagctct actgccccag gccactgttg gcggtggagg tgctgtcgca agacagacac 600 aagcagaaaa tcattgcccc tgcaaaacaa ctcctg 636

Claims (14)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
2. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 및 구제역 바이러스의 VP 2 내지 VP 4 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
3. 제2항에 있어서,
   상기 구제역 바이러스의 VP 2 내지 VP 4 단백질은 A형 구제역 바이러스로부터 유래한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
5. 제4항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
6. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드.
7. 제6항에 있어서,
   상기 플라스미드는 구제역 바이러스의 VP 2 내지 VP 4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
8. 제7항에 있어서,
   상기 구제역 바이러스의 VP 2 내지 VP 4 단백질은 A형 구제역 바이러스로부터 유래한 것을 특징으로 하는 플라스미드.
9. 제6항에 있어서,
   상기 플라스미드는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제4항 또는 제5항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 플라스미드를 포함하는 구제역 백신 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    상기 구제역 백신 조성물은 A형 구제역 바이러스에 대한 방어 면역능을 갖는 것을 특징으로 하는 구제역 백신 조성물.
12. 제11항에 있어서,
    상기 A형 구제역 바이러스는 아시아 지역형인 것을 특징으로 하는 구제역 백신 조성물.
13. 제10항에 있어서,
    상기 백신은 단가 또는 다가 백신인 것을 특징으로 하는 구제역 백신 조성물.
14. 제10항의 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 A형 구제역 바이러스에 대한 면역 반응을 생성하는 방법.

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