CN101721698B

CN101721698B - 抗口蹄疫疫苗组合物及其制备和应用

Info

Publication number: CN101721698B
Application number: CN200810172927.8A
Authority: CN
Inventors: 王歈
Original assignee: Pharos Vaccine Inc
Current assignee: Pharos Vaccine Inc
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2008-10-24
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2028-10-24
Also published as: WO2010045881A1; EP2351581B1; KR101313159B1; JP2014147389A; CN101721698A; KR20110088526A; EP2351581A9; EP2351581A4; JP2012506242A; HK1144787A1; AU2009306900A1; US20110206718A1; CA2741419A1; JP5565877B2; EP2351581A1; US8551495B2; CA2741419C; AU2009306900B2

Abstract

本发明涉及免疫学和基因工程领域，具体涉及抗口蹄疫重组疫苗的构建、制备及其应用。所述疫苗包括口蹄疫病毒、特别是O型口蹄疫病毒的VP1蛋白抗原性表位的串联重复、免疫球蛋白重链恒定区或其功能性片段、和口蹄疫病毒的3D蛋白或其免疫原性片段。所述疫苗能够诱导动物产生抗口蹄疫病毒的保护性免疫应答。

Description

抗口蹄疫疫苗组合物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及免疫学和基因工程领域，具体涉及抗口蹄疫病毒、特别是抗O型口蹄疫病毒的重组疫苗组合物及其制备和应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是动物A类传染病之首，是当今世界上严重危害猪、牛、羊等偶蹄类动物的烈性传染病。近年来，口蹄疫的爆发和流行，给很多国家的畜牧业造成了巨大的经济损失。目前已知口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)有7种血清型(欧洲型A、O和C；非洲型SAT1、SAT2和SAT3；以及亚洲I型)以及多种亚型(例如见Kleidet al.，1981，Science214：1125-1129)，其中传播最为广泛的是O型FMDV。

FMDV是细小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄病毒属(Aphthovirusgenus)的成员，由三种外壳病毒蛋白(包括VP1、VP2、和VP3)的60个拷贝包绕一条单链正义RNA(～8.5kb)所构成。研究表明，在O型FMDV中，这三种病毒蛋白中的VP1与病毒的感染能力最相关。在VP1蛋白中存在两个免疫原性区域，即第141-160位和第200-213位氨基酸残基部分。它们分别位于两个突出的、无序的、高弹性的环状结构内。第145-147位区域的环状结构包含一个保守的三体结构Arg-Gly-Asp(RGD区)，参与细胞表面受体附着(Belsham GJ and Martinez-Salas E，Genome organization，translation andreplication of foot-and-mouth disease virus RNA，p.19-52，2004，Foot andMouth Disease Current Perspectives，Edited by：Sobrino F and Domingo E)。3D蛋白是FMDV中的RNA-依赖性的RNA聚合酶，拥有被猪T细胞所识别的抗原性表位(Belsham GJ and Martinez-Salas E，Genome organization，translation and replication of foot-and-mouth disease virus RNA，p.19-52，2004，Foot and Mouth Disease Current Perspectives，Edited by：Sobrino F andDomingo E)。

预防接种应能控制FMDV的传播。现有的抗口蹄疫疫苗使用灭活的病毒为疫苗，实践证实，此种疫苗可通过病毒RNA的体内重组而引起疾病的传播(Brown，F.An overview of the inactivation of FMDV and the implicationswhen residual virus is present in vaccines.Dev Biol Stand1991；75：37-41)。同时，此种疫苗使用化学灭活剂进行病毒的灭活，在运输过程中需要低温冷链运输和冰箱保存。在一些发展中国家的农村没有冰箱，因此，疫苗在注射时可能已经失去了大部分效力。而生产过程中FMDV活病毒泄露的可能性，使得这种疫苗的生产成为环境不安全因素。

而本发明的FMDV表位特异性疫苗可以诱导接种疫苗的动物产生针对FMDV的抗体反应，其使用和生产都非常安全，易于处理、储存和运输。同时，这种疫苗还可以设计满足特殊的需求。

发明内容

本发明提供安全有效的针对FMDV、特别是O型FMDV的重组疫苗及其制备方法和应用。

在一个方面，本发明提供一种用于诱导动物产生抗FMDV的特异性免疫应答的疫苗组合物，其包含重组蛋白质，所述重组蛋白质从N端到C端包括：

-FMDV外壳蛋白抗原性表位的串联重复；

-免疫球蛋白重链恒定区或其功能性片段；和

-FMDV的3D蛋白或其免疫原性片段。

在另一个方面，本发明提供一种用于诱导动物产生抗FMDV的特异性免疫应答的疫苗组合物，其包含：

(i)重组蛋白质，所述重组蛋白质从N端到C端包括：

-FMDV外壳蛋白抗原性表位的串联重复；和

-免疫球蛋白重链恒定区或其功能性片段；以及

(ii)FMDV的3D蛋白或其免疫原性片段。

在本发明的疫苗组合物的优选实施方式中，所述重组蛋白质包括所述抗原性表位的2至5次串联重复，更优选地，所述重组蛋白质包括所述抗原性表位的3次串联重复。

在本发明的疫苗组合物的一个实施方式中，所述抗原性表位彼此通过肽接头相连接和/或所述抗原性表位的串联重复通过肽接头与所述免疫球蛋白重链恒定区序列相连接。优选地，所述肽接头为SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12。

在本发明的疫苗组合物的一个优选的实施方式中，所述FMDV是O型FMDV，且所述抗原性表位是来自O型FMDV外壳蛋白的抗原性表位。更优选地，所述抗原性表位是来自O型FMDV VP1蛋白的抗原性表位。例如，所述来自O型FMDV VP1蛋白的抗原性表位可包含选自SEQ ID NO:9(VP1的第141-160位氨基酸)和SEQ ID NO：10(VP1的第200-213位氨基酸)的氨基酸序列或由上述氨基酸组成。在本发明的上述疫苗组合物的一个具体的实施方式中，所述串联重复是两种来自O型FMDV VP1蛋白的抗原性表位的串联重复，所述两种VP1蛋白抗原性表位分别包含SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10的氨基酸序列或分别由上述氨基酸组成。

本发明的疫苗组合物可施用于猪、牛、或羊等偶蹄类动物，以诱导产生抗FMDV感染的免疫应答。优选地，在本发明的疫苗组合物中，所述重组蛋白质中的免疫球蛋白重链恒定区来自与接受疫苗接种的动物相同的物种。本发明的疫苗组合物还可包含药用可接受的载体和/或佐剂。

本发明也包括如上所述的重组蛋白质。

在另一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的疫苗组合物中的重组蛋白质。

本发明还提供制备用于本发明的抗FMDV疫苗的重组蛋白质的方法，其包括如下步骤：

-获得编码所述重组蛋白质的多核苷酸；

-构建含有所述多核苷酸的表达载体；

-将所述表达载体导入宿主细胞；和

-在适合所述重组蛋白质表达的条件下培养所述宿主细胞，收集并纯化所表达的重组蛋白质。

此外，本发明还涉及预防动物的FMDV感染的方法，其包括给有此需要的动物施用有效量的本发明的疫苗组合物。

附图说明

图1：本发明的抗FMDV疫苗的构建示意图。A：实施例中制备的疫苗组合物A，其中O型FMDV VP1蛋白的抗原性表位的串联重复片段、动物免疫球蛋白重链恒定区和FMDV的3D蛋白连接为一个重组蛋白(由“3R-IGCD”编码)。B：实施例中制备的疫苗组合物B，其中O型FMDV VP1蛋白的抗原性表位的串联重复片段和动物免疫球蛋白重链恒定区连接为一个重组蛋白(由3R-IGC编码)，而FMDV的3D蛋白为单独的成分。

图2：考马斯蓝染色本发明的疫苗组合物A中的重组蛋白质(由“3R-IGCD”编码)，M：蛋白分子量标记；泳道1：总蛋白；泳道2：可溶性蛋白；泳道3：包涵体(溶于6M尿素)；泳道4：包涵体(溶于8M尿素)。

图3：使用抗FMDV血清以免疫印迹法检测本发明的疫苗组合物A中的重组蛋白质(由“3R-IGCD”编码)，M：蛋白分子量标记；泳道1：总蛋白；泳道2：可溶性蛋白；泳道3：包涵体(溶于6M尿素)；泳道4：包涵体(溶于8M尿素)。

图4：考马斯蓝染色和免疫印迹法检测本发明的疫苗组合物B中的重组蛋白质(由“3R-IGC”编码)。A：来自表达由3R-LGC片段编码的重组蛋白质的细菌(经IPTG诱导前后)的总蛋白裂解物经考马斯蓝染色；B：以来自猪的抗FMDV血清对经IPTG诱导后的总蛋白裂解物中的重组蛋白质(由3R-IGC片段编码)进行免疫印迹法检测。

图5：考马斯蓝染色和免疫印迹法检测本发明的疫苗组合物B中的3D蛋白质成分。

序列说明

SEQ ID NO：1：实施例中使用的编码串联重复排列的FMDV VP1蛋白抗原性表位的DNA序列；

SEQ ID NO：2：实施例中使用的串联重复排列的FMDV VP1蛋白抗原性表位的氨基酸序列；

SEQ ID NO：3：实施例中使用的编码猪免疫球蛋白重链恒定区的DNA序列；

SEQ ID NO：4：实施例中使用的猪免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列；

SEQ ID NO：5：实施例中使用的编码FMDV3D蛋白的DNA序列；

SEQ ID NO：6：实施例中使用的FMDV3D蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO：7：实施例中使用的编码本发明重组蛋白的DNA序列(“3R-IGCD”)；

SEQ ID NO：8：实施例中使用的由“3R-IGCD”编码的重组蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO：9：O型FMDV VP1蛋白的第141-160位氨基酸序列；

SEQ ID NO：10：O型FMDV VP1蛋白的第200-213位氨基酸序列；

SEQ ID NO：11：可用于本发明的肽接头GGSSGG；

SEQ ID NO：12：可用于本发明的肽接头GGGSGGGGS；

SEQ ID NO：13：实施例中使用的由“3R-IGC”编码的重组蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO：14：实施例中使用的编码本发明重组蛋白的DNA序列(“3R-IGC”)；

SEQ ID NO：15：用于扩增编码猪scIgG的cDNA片段的scIgG5＇引物；

SEQ ID NO：16：用于扩增编码猪scIgG的cDNA片段的scIgG3＇引物；

SEQ ID NO：17：用于克隆编码FMDV的3D蛋白的核酸的3D5＇引物；

SEQ ID NO：18：用于克隆编码FMDV的3D蛋白的核酸的3D3＇引物；

SEQ ID NO：19：合成3R-IGCD片段所使用的3R-IGCD5＇引物；

SEQ ID NO：20：合成3R-IGCD片段所使用的3R-IGC3＇引物1；

SEQ ID NO：21：合成3R-IGCD片段所使用的D5＇引物；

SEQ ID NO：22：合成3R-IGCD片段所使用的3R-IGCD3＇引物；

SEQ ID NO：23：扩增SEQ ID NO：14所使用的3R-IGC5＇引物和

SEQ ID NO：24：扩增SEQ ID NO：14所使用的3R-IGC3＇引物2。

具体实施方式

在一个方面，本发明提供一种用于诱导动物产生抗FMDV的特异性免疫应答的疫苗组合物，其包含重组蛋白质，所述重组蛋白质从N端到C端包括：FMDV外壳蛋白抗原性表位的串联重复；免疫球蛋白重链恒定区或其功能性片段；和FMDV的3D蛋白或其免疫原性片段。

在另一个方面，本发明提供一种用于诱导动物产生抗FMDV的特异性免疫应答的疫苗组合物，其包含：(i)重组蛋白质，所述重组蛋白质从N端到C端包括：(a)FMDV外壳蛋白抗原性表位的串联重复；和(b)免疫球蛋白重链恒定区或其功能性片段；以及(ii)FMDV的3D蛋白或其免疫原性片段。

在本发明的疫苗组合物的优选实施方式中，所述FMDV是O型FMDV，且所述抗原性表位是来自O型FMDV外壳蛋白的抗原性表位，例如是来自O型FMDV VP1蛋白的抗原性表位。

在本发明的抗O型FMDV的疫苗组合物中，用于构建所述重组蛋白质的FMDV VP1蛋白抗原性表位可以是已知的VP1蛋白主要抗原性表位，例如是O型FMDV VP1蛋白的第141-160位氨基酸(SEQ ID NO:9)或第200-213位氨基酸(SEQ ID NO：10)所代表的表位。这些表位已经被证实能激发感染FMDV的动物的B淋巴细胞反应。

为了增强本发明疫苗的重组蛋白质的免疫原性，在所构建的用作本发明的疫苗的重组蛋白质中，所述FMDV抗原性表位(例如VP1蛋白的抗原性表位)以串联重复的形式进行排列，并且所述串联重复可以是一种或多种FMDV抗原性表位(例如VP1蛋白的抗原性表位)的串联重复。就此而言，“抗原性表位的串联重复”指的是重复排列的各个(相同的或不同的)表位序列在重组蛋白质的氨基酸序列中直接地或通过接头间接地顺序相连接，从而使得各个(相同的或不同的)表位序列以串联的方式相连接并重复2至多次，例如3次。

在本发明的疫苗组合物的优选实施方式中，所述重组蛋白质包括所述抗原性表位的2至5次串联重复。重复次数多于5次也是可行的，不过，重复次数低于5次更利于以重组方式表达本发明的重组蛋白质。更优选地，所述重组蛋白质包括所述抗原性表位的3次串联重复。

在本发明疫苗的优选实施方式中，所述重组蛋白质中的串联重复是两种O型FMDV VP1蛋白抗原性表位的串联重复。在一个具体实施方式中，串联重复中的两种VP1蛋白抗原性表位分别是O型FMDV VP1蛋白的第141-160位氨基酸(SEQ ID NO:9)和第200-213位氨基酸(SEQ ID NO：10)所代表的两种表位，其中所述两种表位是串联排列的，且这种串联排列的重复次数为3次。试验证明，这种重组蛋白质有效诱导了动物体产生针对O型FMDV的特异性免疫应答，从而保护动物。

图1以抗O型FMDV疫苗组合物为例给出了本发明疫苗的构建示意图，其中所述重组蛋白质的N端为O型FMDV VP1蛋白的抗原性表位的串联重复区，随后是家畜的免疫球蛋白重链恒定区，而FMDV的3D蛋白可直接连接于免疫球蛋白重链恒定区的C端(图1A)，也可为单独的蛋白成分(图1B)。

在本发明疫苗的优选实施方式中，所述重组蛋白质中的抗原性表位之间和/或所述串联重复之间以肽接头相连接。连接抗原性表位和/或串联重复的肽接头不能影响抗原性表位的线性结构。可用于本发明中的肽接头的实例例如为GGSSGG(SEQ ID NO：11)和GGGSGGGGS(SEQ ID NO：12)。本发明的动物实验的结果证实，以SEQ ID NO：11作为肽接头并未影响重组蛋白质中串联重复排列的抗原性表位的线性结构，且所述重组蛋白质在动物体内诱导了保护性抗体的产生。此外，在本发明疫苗的重组蛋白质中，所述抗原性表位的串联重复也可通过上述肽接头与所述免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列相连接。

为了使串联重复排列的抗原性表位能够展现在重组蛋白质分子的表面，本发明将免疫球蛋白的重链恒定区或其功能性片段连接于串联重复排列的抗原性表位，例如VP1蛋白抗原性表位。免疫球蛋白分子的重链恒定区能将抗体可变区的序列展现在免疫球蛋白分子表面。利用免疫球蛋白重链恒定区的这一特性，本发明以串联重复排列的抗原性表位区替代免疫球蛋白重链分子的可变区，由此使得免疫球蛋白重链恒定区所展现在重组蛋白质分子表面的部分为抗原性表位，例如VP1蛋白抗原性表位的串联重复。将本发明的疫苗施用到动物体内后，体液中的B细胞表面的IgM单体分子便能与重组蛋白质分子中的抗原性表位相接触，从而被激活，产生免疫应答。本发明的动物实验证实，这样设计的疫苗在动物中诱导了强烈的保护性免疫应答，达到了保护动物免于感染的目的。

用于本发明的重组蛋白质的免疫球蛋白重链恒定区优选地来自家畜。为了降低重组蛋白质分子中免疫球蛋白重链恒定区部分的免疫原性，优选地使用来自与被免疫动物相同物种的免疫球蛋白重链恒定区。所述免疫球蛋白重链恒定区可来自IgA、IgM、IgE、IgD、或IgG或其亚型。免疫球蛋白重链恒定区的“功能性片段”指的是免疫球蛋白重链恒定区的一部分，所述部分仍能够将抗原性表位的串联重复展现在重组蛋白质分子表面。

用于本发明疫苗的另一个部分或成分是FMDV3D蛋白或其免疫原性片段，优选地是完整的3D蛋白。FMDV3D蛋白可以与外壳蛋白如VP1蛋白抗原性表位来自同一类型的FMDV，例如O型FMDV，或者也可以来自不同类型的FMDV。例如，在本发明的疫苗中，VP1蛋白抗原性表位可来自O型FMDV，而3D蛋白可来自O型FMDV或者来自A型或亚洲I型FMDV。

在本发明的疫苗中，FMDV3D蛋白可直接连接于免疫球蛋白重链恒定区的C端，形成包括FMDV VP1蛋白的抗原性表位的串联重复、免疫球蛋白重链恒定区、以及FMDV3D蛋白的完整重组蛋白质。或者，所述3D蛋白可作为独立的蛋白质成分与包括VP1蛋白抗原性表位的串联重复和免疫球蛋白重链恒定区的重组蛋白质一起构成本发明的疫苗的有效成分。

在本发明的疫苗中引入FMDV3D蛋白，无论其是作为重组蛋白质的一部分或是作为独立的成分，都是为了激发被免疫动物的T淋巴细胞应答。T细胞可以攻击动物体内被病毒染的细胞，通过清除这些被感染的细胞，彻底清除病毒。因此，T细胞在保护动物免于病毒感染的过程中起着关键的作用。在使用本发明的疫苗免疫动物后，疫苗的蛋白质成分被体内的抗原提呈细胞(APC)摄取、加工、处理，最终被MHC分子提呈于APC表面，诱导抗原特异性杀伤性T淋巴细胞的活化、增殖并产生免疫记忆细胞。FMDV3D蛋白的“免疫原性片段”指的是3D蛋白的一部分，所述部分同样能够有效激发被免疫动物的T淋巴细胞应答。

在本发明疫苗的一个具体实施方式中，所述重组蛋白质的N端为O型FMDV VP1蛋白的两种抗原性表位(SEQ ID NO：9(VP1的第141-160位氨基酸)和SEQ ID NO：10(VP1的第200-213位氨基酸)，表位之间以肽接头SEQID NO：11连接)的3次串联重复，所述串联重复在其C端以肽接头SEQ IDNO：11连接于免疫球蛋白重链恒定区(SEQ ID NO：4)，而重组蛋白质的C端为O型FMDV完整的3D蛋白序列，由此形成完整的重组蛋白质(SEQ IDNO：8)。在另一个具体的实施方式中，所述重组蛋白质的N端为O型FMDVVP1蛋白的两种抗原性表位(SEQ ID NO：9(VP1的第141-160位氨基酸)和SEQ ID NO：10(VP1的第200-213位氨基酸)，表位之间以肽接头SEQ IDNO：11连接)的3次串联重复，重组蛋白质的C端为免疫球蛋白重链恒定区(SEQ ID NO：4)，两者以肽接头SEQ ID NO：11连接，而完整的3D蛋白为分开的独立成分，由此所述重组蛋白质(SEQ ID NO：13)成分和3D蛋白质(SEQID NO：6)成分共同构成疫苗组合物的有效成分。

如上所述的重组蛋白质也属于本发明的范围。

在另一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的疫苗组合物中的重组蛋白质。在具体的实施方式中，所述多核苷酸包含如SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。

获得编码本发明的重组蛋白质的多核苷酸的方法是本领域人员已知的，例如可采用化学合成的方法直接制备多核苷酸分子。或者，可分别获得编码抗原性表位的串联重复、免疫球蛋白重链恒定区或其功能性片段、以及FMDV3D蛋白或其免疫原性片段的核酸分子，引入编码肽接头的序列，再连接成为编码完整重组蛋白质的多核苷酸。例如，可通过RT-PCR方法自动物脾脏细胞中扩增得到编码免疫球蛋白重链恒定区的多核苷酸，以及自FMDV样品中扩增得到编码3D蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可用于制备本发明的疫苗成分，例如通过将所述多核苷酸插入合适的载体并导入宿主细胞以表达所述重组蛋白质。

因此，在另一方面，本发明还提供制备用于诱导动物产生抗FMDV的特异性免疫应答的疫苗组合物中的重组蛋白质的方法，其包括如下步骤：

-获得编码如上所述的重组蛋白质的多核苷酸；

-构建含有所述多核苷酸的表达载体；

-将所述表达载体导入宿主细胞；和

用于将本发明的多核苷酸导入宿主细胞的表达载体也是本领域人员已知的，例如为原核或真核表达载体。

用于表达本发明的重组蛋白质的宿主细胞例如是大肠杆菌和酵母。

本发明的抗FMDV的疫苗组合物包含有效量的疫苗有效成分，即所述完整的重组蛋白质或者重组蛋白质和独立的3D成分，以及药用可接受的载体和佐剂。所述动物例如是猪、牛、或羊等偶蹄类动物。有效量是指疫苗成分的量足以诱导被免疫动物产生抗FMDV的特异性免疫应答。

合适的载体和佐剂例如为无机佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝等；有机佐剂，如CpG DNA、多聚腺苷酸等；微生物及其提取物；油佐剂等。

本发明还涉及预防动物的FMDV感染的方法，其包括给有此需要的动物施用有效量的本发明的疫苗组合物。本发明的疫苗的施用途径可以是任何合适的蛋白质疫苗的施用途径，例如为皮下注射、肌肉注射、腹腔内注射或静脉注射。有效量是指足以诱导被免疫动物产生抗FMDV的特异性免疫应答的疫苗成分的量，其可以通过例如常规的动物实验而容易地确定。本发明疫苗中的蛋白质组分可以100-2000微克、优选地200-1000微克的总量施用。例如，以实施例中制备的疫苗组合物A中的重组蛋白质为例，单次施用200-1000微克的所述重组蛋白质均可在动物中产生有效的抗O型FMDV保护性免疫应答，

用于检验和评价抗FMDV的疫苗组合物的效果的方法和技术是本领域人员已知的。这些方法和技术包括FMDV体外培养及滴定技术(包括仓鼠细胞培养、病毒体外繁殖及病毒蛋白质的制备)、动物实验(包括免疫动物血清的收集、血清中和试验、乳鼠保护试验、ID₅₀、LD₅₀测定、猪攻毒试验)以及动物免疫应答测试(如血清中和抗体应答、T细胞应答分析)。

实施例

以下实施例用于举例说明本发明，其无意于以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：构建重组基因和表达载体

1.1.合成编码串联重复排列的VP1蛋白抗原性表位的DNA

用DNA合成法合成编码串联重复排列3次的两种VP1蛋白抗原性表位的DNA序列，其中抗原性表位序列使用了最新流行的O型FMDV中的表位序列，即O型FMDV VP1蛋白的第141-160位氨基酸序列(SEQ ID NO：9)和第200-213位氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。编码各串联重复排列的VP1蛋白抗原性表位的核苷酸序列之间引入了编码肽接头(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列，并在5’端引入编码甲硫氨酸的密码子，在3’端额外引入一个编码肽接头(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(该接头用于将串联重复排列的抗原性表位与免疫球蛋白重链恒定区片段连接在一起)。由此得到的产物以“3R”片段表示，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

1.2.获得编码猪免疫球蛋白重链恒定区的核苷酸序列

用RT-PCR方法从动物脾脏细胞中扩增出免疫球蛋白重链恒定区的编码核酸，具体如下。采用FastPrep Kit(Gibco)从猪的脾脏样品中提取和纯化含有猪免疫球蛋白IgG单链重链恒定区(scIgG)mRNA的总mRNA。利用RT-PCR方法扩增猪的编码scIgG的cDNA片段，所用引物(Kacskovics，I.，Sun，J.，Butler，J.E.Five putative subclasses of swine IgG identified from the cDNAsequences of a single animal.J Immunol1994；153：3565-73)如下：

scIgG5’引物：5’-GCCCCCAAGACGGCCCCA-3’SEQ ID NO：15

scIgG3’引物：5’-TCATCATTTACCCTGAGT-3’SEQ ID NO：16

逆转录使用M-MLV逆转录酶(Promega)，反应条件为：M-MLV5X反应缓冲液(250mM Tris-HCl(pH8.3)，375mM KCl，15mM MgCl₂，50mM DTT)5μl；dNTP，10mM，各1.25μl；重组RNasinRNA酶抑制剂25单位；M-MLV逆转录酶200单位；2μgmRNA；0.5μg引物；加无RNA酶的水至终体积25μl。在37℃反应60分钟后，70℃，灭活15分钟。

所得产物作为模板用于随后的PCR扩增。PCR扩增反应体系共25μl，其中含有：2.5μl的10x PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.4，500mM KCL，1mg/ml明胶)，0.5μl的10mM dNTP，0.5μl50mM的MgCl₂，1μl的scIgG5’引物(SEQ ID NO：15)(10mM)，1μl的scIgG3’引物(SEQ ID NO：16)(10mM)，0.2μl的Taq聚合酶(Promega)，1μl模板，18.3μl的ddH₂O。PCR的条件为：95℃，5分钟；95℃30秒，52℃30秒，72℃2分钟，共34个循环；最后72℃，5分钟。由此制备得到的扩增产物以“IGC”片段表示，经过测序分析其具有SEQID NO：3所示的序列。

1.3.连接编码串联重复区和猪免疫球蛋白重链恒定区的核酸

连接编码串联重复的VP1蛋白抗原性表位的核酸(3R片段)和猪免疫球蛋白重链恒定区的cDNA(IGC片段)。连接反应体系为：300mM Tris-HCl(pH7.7)，100mM MgCl₂，50mM DTT和1mM ATP。编码串联重复排列的VP1蛋白抗原性表位的核酸和重链恒定区的cDNA片段的摩尔比为1∶1。用2u T4DNA连接酶和0.2u T4RNA连接酶(Promega)来提高平头连接的效率。连接产物以“3R-IGC”片段表示，其具有SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。

1.4.获得编码FMDV的3D蛋白的核酸

采用以下引物从感染O型FMDV的病猪的水泡样品中克隆编码FMDV的3D蛋白的核酸：

3D5’引物：5’-CCATCTCCAAGACTCAGGGTAAAGGGTTGATCSEQ ID NO：17GTCGACACC-3’

3D3’引物：5’-GTATGCGTCACCGCAC-3’SEQ ID NO：18

RT-PCR反应条件与扩增IGC中所用条件相同。从FMDV中扩增出的产物以“D”片段表示，其编码FMDV的3D蛋白，具有如SEQ ID NO:5所示的序列。

1.5.获得编码完整重组蛋白质的核酸

将如上制备的“3R-IGC”片段与从FMDV中扩增出的编码3D蛋白的“D”片段用重叠PCR连接，得到编码完整重组蛋白质的核酸分子“3R-IGCD”。具体步骤如下。

(1)设计用于扩增“3R-IGC”片段的引物：

3R-IGCD5’引物：5’-AGCTGAATTCATGGTACCAAACCTG-3’SEQ ID NO：19

3R-IGC3’引物1：5’-GGTAGAGGTTCTGAGTCCCATTTCCCAACTSEQ ID NO：20AGCAGCTGTGG-3’

其中3R-IGCD5’引物与“3R-IGC”片段的5’端互补，而3R-IGC3’引物1部分与“3R-IGC”片段的3’端互补，部分与“D”片段的5’端互补。经PCR扩增后得到3R-IGCD的3R-IGC部分，其3’端的部分序列与“D”片段的5’端相同。

(2)设计用于扩增“D”片段的引物：

D5’引物：5’-CCATCTCCAAGACTCAGGGTAAAGGGTTGASEQ ID NO：21TCGTCGACACC-3’

3R-IGCD3’引物：5’-AGCTTCTAGAAATTTATGCGTCACCGCAC-3’SEQ ID NO：22

其中D5’引物部分与“D”片段的5’端互补，部分与“3R-IGC”片段的3’端互补，而3R-IGCD3’引物与“D”片段的3’端互补。经PCR扩增后得到3R-IGCD的D部分，其5’端的部分序列与“3R-IGC”片段的3’端相同。

(3)各取5μg的3R-IGC部分和D部分互为PCR的引物和模板，95℃变性1分钟，65℃延伸2分钟，共6个循环。然后在该反应体系中再加入3R-IGCD5’引物和3R-IGCD3’引物，95℃变性1分钟，55℃30秒，72℃延伸2分钟，共20个循环。得到的扩增产物即为3R-IGCD(SEQ ID NO：7)，编码实施例2中制备的疫苗组合物A中的重组蛋白质。

1.6.构建表达载体

将如上所述制备得到的扩增产物“3R-IGCD”经EcoRI和XbaI酶切后插入细菌表达载体pET22b(Novagen Inc.)，得到质粒p3R-IGCD。

使用如下引物对前面1.3节中制备得到的“3R-IGC”进行PCR扩增：

3R-IGC5’引物：5’-AGCTGAATTCATGGTACCAAAC-3’SEQ ID NO：23

3R-IGC3’引物2：5’-AGCTTCTAGATCATCATTTACCCTGAGT-3’SEQ ID NO：24

扩增产物经EcoRI和XbaI酶切后插入细菌表达载体pET22b(NovagenInc.)，得到质粒p3R-IGC。

实施例2：疫苗制备

2.1.制各本发明的疫苗组合物A

2.1.1.表达3R-IGCD编码的重组蛋白质：将感受态细胞(E.Coli，BL21)置于冰上融解后，于冰上预冷的管中每管加300μl感受态细胞。每管加20μl在实施例1中制备得到的质粒p3R-IGCD，混匀，冰上放置40分钟。于42℃水浴热休克45秒。每管加1ml L-培养基(无抗生素)，于37℃摇床震荡温育45分钟，使质粒表达蛋白。将转化好的细菌铺于含氨苄青霉素的培养板上，37℃过夜。挑选氨苄青霉素抗性的细菌克隆，提取质粒后进行DNA测序，挑选含有具有正确序列的质粒的菌株。将菌株置于LB培养基中，在37℃培养生长至OD＝0.5，加入0.4mM IPTG诱导重组蛋白质表达，4小时后收集菌体。细菌细胞的悬液经超声破碎后，于4℃，10,000xg离心10分钟，除去残留的细菌碎片。上清液直接用于免疫印迹分析。30,000xg离心收集不溶性蛋白(包涵体)，用LB培养基洗一次，随后按25ml/g沉淀的量与溶解缓冲液1(SB1：100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，20mM咪唑，pH8.0，1mM DTT，8M尿素，1.5M NaCl)混匀并不时摇动，在室温温育20-30分钟。玻璃状的不溶性细胞壁经65,000xg离心30分钟去除。上清液经0.2μm滤膜过滤，得到含有重组蛋白质的蛋白样品。用His-Trap柱纯化以获得表达的重组蛋白(Porath，J.，Carlsson，J.，Olsson，I.，Belfrage，G.Metal chelateaffinity chromatography，a new approach to protein fraction.Nature1975；258：598-99)。将5-10mg/ml的上述蛋白样品置于1x5cm用SB1预平衡的His-Trap柱上。在p3R-IGCD质粒中表达的重组蛋白带有HIS尾。结合的蛋白用50ml SB1洗后，用洗脱缓冲液2(EB2：SB1+0.5M NaCl+480mM咪唑，pH8.0)洗脱结合的蛋白。洗脱的蛋白用SB1稀释10倍后，在同样条件下进行二次层析。合并洗脱蛋白，蛋白的浓度采用Bio-Rad蛋白分析试剂盒，按照厂家的说明书进行。调节蛋白浓度在0.3-0.4mg/ml，用5L50mM Tris，pH7.5，1.0M NaCl多次换液透析72小时。另以类似的方法，但将8M尿素换做6M尿素来溶解蛋白，纯化蛋白质。纯化的蛋白储存于4℃。

2.1.2.SDS-PAGE和免疫印迹分析3R-IGCD编码的重组蛋白：重组蛋白的表达由SDS-PAGE凝胶电泳显示。SDS-PAGE验证表明获得的重组蛋白质的分子量与预期的一致(图2)。目的蛋白的表达由免疫印迹(AmershamECL免疫印迹试剂盒)确定(Gel electrophoresis of proteins(Hammes，B.D.，Rickwood，D.，eds.)，IRL Press，Oxford，1981)。在免疫印迹分析中，使用了来源于被O型FMDV感染的猪的抗FMDV的抗血清(图3)，证实重组蛋白具有抗原性，能与上述抗血清发生反应。

2.1.3.获得疫苗组合物A：在重组蛋白质中加入乳化剂206(SEPPIC公司，法国)混匀，即得到本发明的疫苗组合物A(含有由3R-IGCD编码的重组蛋白质(SEQ ID NO：8)作为活性组分)。

2.2.制各本发明的疫苗组合物B

按照与前面2.1节类似的方式使用质粒p3R-IGC表达并纯化由3R-IGC编码的重组蛋白质(具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列)。该重组蛋白质的SDS-PAGE考马斯蓝染色和免疫印迹检测(使用来自猪的抗FMDV血清)的鉴定结果见图4。

将实施例1中1.4节所获得的编码FMDV的3D蛋白的核酸克隆入表达载体pET100-D-TOPO(Invitrogen)，得到质粒pET100-P3D。载体pET100-D-TOPO已经由生产商进行线性化，可直接与目的片段连接用于在细菌中表达重组蛋白质。采用前面2.1.1节所述的类似方式，使用质粒pET100-P3D转化大肠杆菌菌株BL21codon plus。培养的细菌经0.4M的IPTG进行诱导4小时，以表达3D蛋白。使用SDS-PAGE和抗-his抗体对表达并纯化的3D蛋白进行考马斯蓝染色和免疫印迹检测，鉴定结果见图5。

将由3R-IGC编码的重组蛋白质和3D蛋白按照等摩尔比混合，加入乳化剂206(SEPPIC公司，法国)混匀，即得到本发明的疫苗组合物B(含有由3R-IGC编码的重组蛋白质(SEQ ID NO：13)和3D蛋白(SEQ ID NO：6)作为活性组分)。

实施例3：抗FMDV疫苗的效力

3.1.细胞培养

仓鼠肾脏细胞株(BHK21)(购自ATCC，ATCC CCL-10)在加入了10％热灭活胎牛血清(FBS)(Gibco)、青霉素(100U ml^-1)、链霉素(100μg ml^-1)、并配有Earle盐的基础培养基(EMEM)(Gibco)中培养。培养环境为37℃及5％CO2(Barnett，P.V.，L Pullen，R.F.Staple，L J.Lee，R.Butcher，D.Parkinson，and T.R.Doel.1996.A protective anti-peptide antibody against theimmunodominant site of the A₂₄Cruzeiro strain of foot-and-mouth disease virusand its reactivity with other subtype viruses containing the same minimumbinding sequence.J.Gen.Virol.77：1011-1018)。

3.2.FMDV繁殖及制各病毒蛋白

FMDV来自疾病流行时被FMDV感染的猪的水泡的上皮组织。当BHK21单层细胞生长至80％满时，均匀地在细胞层表面加入一毫升FMDV液以繁殖FMDV。细胞先在37℃中培养45分钟，当BHK21细胞表现出75％的细胞病变效果时，把它们收集并加入20毫升不含胎牛血清及配有Earle盐的基础培养基(EMEM)。培养后加入0.01M的二乙烯亚胺(Binaryethylenimine)(Sigma)并放在37℃中1小时以灭活FMDV，然后再加入7％的聚乙二醇(PEG6000)(Sigma)并放于4℃中过夜以沉淀灭活后的FMDV。病毒总蛋白经40,000rpm、2小时超离心法取得。在259nm处测定光密度，确定纯化病毒蛋白的浓度，1OD＝132μg(Barnett，P.V.，L.Pullen，R.F.Staple，L J.Lee，R.Butcher，D.Parkinson，and T.R.Doel.1996.A protectiveanti-peptide antibody against the immunodominant site of the A₂₄Cruzeiro strainof foot-and-mouth disease virus and its reactivity with other subtype virusescontaining the same minimum binding sequence.J.Gen.Virol.77：1011-1018)。病毒蛋白用于T细胞增殖试验。

3.3.FMDV50％致感染剂量(ID ₅₀ )鉴定分析

为检测FMDV50％致感染剂量(ID₅₀)的浓度，25只对FMDV血清反应阴性的猪用作50％致感染剂量(ID₅₀)的分析。动物被分为五组，每组五只。口蹄疫病毒液被连续十倍稀释(如10^-4，10^-5，10^-6，10^-7及10^-8)，并分别注入猪中的颈部肌肉。于病毒攻毒的2-10日后，每日观察鼻、口、舌和足的水泡形成及量度体温。有口蹄疫症状和体温超过40℃的猪将被诊断为口蹄疫阳性，因感染FMDV而导致50％的猪出现阳性症状时所使用的稀释浓度为口蹄疫病毒液的ID₅₀，即1ID₅₀(Collen，T.，R.Dimarchi，and T.R.Doel.1991.A T Cell Epitope in VP1of Foot-and-Mouth Disease Virus is Immunodominantfor Vaccinated Cattle.J.Immunol.14G：749-755.Taboga，O.，C.Tami，E.Carrillo，J.I.Nunez，A.Rodriguez，J.C.Saiz，E.Blanco，M.L.Valero，X.Roig，J.A.Camarero，D.Andreu，M.G.Mateu，E.Giralt，E.Domingo，F.Sobrino，andE.L.Palma.1997.A Large-Scale Evaluation of Peptide Vaccines againstFoot-and-Mouth Disease：Lack of Solid Protection in Cattle and Isolation ofEscape Mutants.J.Virol.71：2604-2614)。

3.4.免疫接种的猪的血清收集和攻毒试验

FMDV攻毒试验是最终鉴定重组疫苗的效率的方法。总共25只对FMDV血清反应为阴性的猪(2.5月大，重约25千克)被用作病毒攻毒的分析。

猪被分成五组：(a)五只猪作阴性对照组(注射1ml PBS)；(b)五只猪作阳性对照组(注射口蹄疫商品疫苗(灭活全病毒)2ml，兰州，中农威特生物科技股份有限公司，剂量按厂商指示)；其余c、d、e组的猪注射如上所述的疫苗组合物A，即重组蛋白质(由“3R-IGCD”编码)：(c)五只猪每只注射0.2毫克(mg)重组蛋白质；(d)五只猪注射0.5毫克(mg)重组蛋白质；(e)五只猪每只注射1毫克(mg)重组蛋白质。在测试如上所述的疫苗组合物B时，分组情况同疫苗组合物A组，注射的总蛋白量与疫苗组合物A相同，其中重组蛋白质(由“3R-IGC”编码)与3D蛋白的摩尔比为1：1。

猪经由颈肌第一次注射疫苗，并于21日后再次接种同样剂量的疫苗。血清样本于第0及51日于每组的动物中收集并加以测试。一周后用1000倍ID₅₀的FMDV攻毒，而诊断口蹄疫的发病标志与上面ID₅₀鉴定部分分析所用的标志相同(Rodriguez，A.，J.C.Salz，I.S.Novella，D.Andreu，and F.Sobrino.1994.Antigenic Specificity of Porcine T Cell Response againstFoot-and-Mouth DiseaseVirus Structural Proteins：Identification of T HelperEpitopes in VP1.Virology205：24-33)。

3.5.血清抗体中和反应测试(SNT)

为鉴定五组分别接受重组蛋白质、口蹄疫商品疫苗及缓冲液注射的猪对FMDV的特异性抗体应答，依照口蹄疫世界参考实验室规定的程序进行血清中和试验(SNT)(Chapter2.1.1Foot and mouth disease.In：“OIE Manual”.Office International des Epizooties，Paris，1996；47-56.)。而抗体的浓渡则以log₁₀SN₅₀方式表示(Salt，J.S.，P.V.Barnett，P.Dani，and L.William.1998.Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease：protectionagainst disease and reduction in contact transmission.Vaccine16：746-754)。结果如表1和2所示。

表1、抗体中和反应：接种200微克(μg)、500微克(μg)及1毫克(mg)的重组蛋白质(疫苗组合物A)和缓冲液及口蹄疫商品疫苗后51日的猪的抗体中和反应。

^a自五只猪的平均中和抗体滴度±SEM(平均值的标准差)；

^b口蹄疫商品疫苗和缓冲液分别作为阳性及阴性对照组。

表2、抗体中和反应：接种200微克(μg)、500微克(μg)及1毫克(mg)的重组蛋白质(疫苗组合物B，其中重组蛋白质与3D蛋白的摩尔比为1：1)和缓冲液及口蹄疫商品疫苗后51日的猪的抗体中和反应。

^a自五只猪的平均中和抗体滴度±SEM(平均值的标准差)；

^b口蹄疫商品疫苗和缓冲液分别作为阳性及阴性对照组。

血清中和测试显示出所有原对FMDV血清反应属阴性的猪经过接种疫苗组合物A或疫苗组合物B(200μg、500μg及1mg)后，都能引起抗FMDV的抗体中和反应(表1和2)。在阴性对照组中的猪没有接种重组蛋白或口蹄疫商品疫苗，则没有出现抗体反应。三个注射疫苗的组及注射口蹄疫商品疫苗的组，在抗体水平上并没有统计学上显著的差异。

3.6.乳鼠保护试验

乳鼠保护试验(MPT)是鉴定接种本发明的疫苗的猪是否产生抗FMDV抗体的第二种方法。小鼠保护试验如Mulcahy et al.描述加以修改(Mulcahy，G.，L.A.Pullen，C.Gale，R.D.DiMarchi，and T.R.Doel.1991.Mouseprotection test as a predictor of the protective capacity of syntheticfoot-and-mouth disease vaccines.Vaccine9：19-24)。FMDV材料的50％致死剂量(LD₅₀)：经连续五次十倍稀释的病毒(如10^-3、10^-4、10^-5、10^-6及10^-7)注射入五组乳鼠(每组四只)，能杀死50％数量的小鼠之稀释浓渡则为LD₅₀。于注射后第51日抽取实验猪(接种本发明的疫苗(疫苗组合物A或疫苗组合物B)、口蹄疫商品疫苗及缓冲液)的抗血清。所有抗血清都经过56℃30分钟的失活处理。每组四只3-4日龄的乳鼠都分别以腹腔注射(i.p.)100μl未稀释的猪抗血清。在20-23小时内，所有小鼠都分别接受10、100、1000倍50％致死剂量(LD₅₀)的FMDV的攻毒，然后观察四日并记录仍生存的小鼠数量。其结果见表3。

表3、乳鼠保护试验：接种200微克、500微克及1毫克的本发明的疫苗(疫苗组合物A或疫苗组合物B)和缓冲液及口蹄疫商品疫苗后51日的猪抗血清对乳鼠的保护试验。

^a每个数值代表各组乳鼠(每组四只)的平均保护程度；

^b“/”前面为疫苗组合物A产生的保护百分比，后面为疫苗组合物B产生的保护百分比。

表3清楚地显示：不论接种200μg，500μg及1mg的疫苗组合物A或疫苗组合物B的猪的抗血清都能100％保护乳鼠对抗1000倍FMDV50％致死剂量(LD₅₀)的攻击。没有接种重组蛋白的猪(阴性对照组)的抗血清完全不能保护乳鼠对抗FMDV感染，而接种口蹄疫商品疫苗的猪的抗血清能保护乳鼠对抗多至1000倍50％致死剂量(LD₅₀)FMDV的攻击(表3)。

3.7.T细胞增殖分析

T细胞增殖分析用于鉴定注射重组蛋白后引起的T细胞增殖。T细胞从接种疫苗组合物A或疫苗组合物B、口蹄疫商品疫苗及缓冲液组的猪中收集。血细胞经过1.077gml^-1的Percoll溶液纯化。每组4x10⁶T细胞/毫升，在96-孔板(Coming)中培养并加入10μgml^-1或50μg ml^-1的FMDV病毒蛋白。孔板在37℃中培养四日后再加入每25μl1微居理(μCi)的[氚]胸腺嘧啶核苷([^3H]thymidine)，培养18小时后收集细胞并用液体闪烁计数器(Beckman LS6500)测量(Measurement of proliferation Response of Culturedlymphocytes，Chapter7.10，Current Protocols in Immunology，Edited by J.E.Cologan(NIH)，2005，Johm Wiley and Sons，Inc.Lierop，M.J.C.V.，K.V.Maanen，R.H.Meloen，V.P.M.G.Rutten，M.A.C.Dejong，and E.J.Hensen.1992.Proliferative Lymphocyte responses to foot-and-mouth disease virus andthree FMDV peptides after vaccination or immunization with these peptides incattle.Immunol.75：406-413)。

表4、两次接种疫苗组合物A后猪T细胞对FMDV蛋白的反应

^a.猪分为五组进行试验，每组3只。不同组采用不同剂量的疫苗组合物A进行免疫。每只动物接受两次免疫注射，每次间隔四周。每次注射后10天采集血清。空白对照组注射1ml PBS。

^b.刺激指标(SI)：有FMDV蛋白刺激的T细胞培养每分钟平均读数(cpm)/无FMDV蛋白的刺激的T细胞培养之每分钟平均读数(cpm)。刺激指标(SI)大于1.5则被定为阳性反应。

表5、两次接种疫苗组合物B后猪T细胞对FMDV蛋白的反应

^a.猪分为五组进行试验，每组3只。不同组采用不同剂量的疫苗组合物B进行免疫。每只动物接受两次免疫注射，每次间隔四周。每次注射后10天采集血清。空白对照组注射1ml PBS。

表4和5说明了从分别接种疫苗组合物A或疫苗组合物B(200μg、500μg及1mg的蛋白质)、口蹄疫商品疫苗或缓冲液的猪中收集的T细胞的体外增殖反应。增殖反应通过10μgml^-1或50μgml^-1的FMDV蛋白体外刺激鉴定。当被50μgml^-1的病毒蛋白刺激，接种重组蛋白和口蹄疫商品疫苗的猪的T细胞显示出最好的反应，而被缓冲液刺激的组则没有增殖反应。

FMDV对猪的攻毒试验的结果见表6和7。

表6、FMDV攻毒分析：25只猪(五组)分别两次接种0.2或0.5或1mg的蛋白质(疫苗组合物A)、口蹄疫商品疫苗或缓冲液，然后接受1000倍50％致死剂量(LD₅₀)的FMDV的攻毒。

表7、FMDV攻毒分析：25只猪(五组)分别两次接种0.2或0.5或1mg的蛋白质(疫苗组合物B)、口蹄疫商品疫苗或缓冲液，然后接受1000倍50％致死剂量(LD₅₀)的FMDV的攻毒。

五组受FMDV攻毒的猪中，缓冲液对照组(n＝5)很快发病。根据规定时限(7-10日)内出现典型的口蹄疫症状，均被诊断为口蹄疫阳性。而在口蹄疫商品疫苗阳性对照组的动物(n＝5)则于规定时限内没有出现任何口蹄疫的症状。接种0.2毫克疫苗组合物A的猪(n＝5)受到对FMDV攻毒后，其中四只猪受保护，接种0.5毫克和1毫克疫苗组合物A的猪(n＝5)全部获得对FMDV攻毒的完全保护。接种0.2毫克、0.5毫克和1毫克疫苗组合物B的猪(n＝5)也受到对FMDV攻毒的完全保护，并没有出现任何口蹄疫的症状。

序列表

<110>王

<120>抗口蹄疫疫苗组合物及其制备和应用

<130>I200801770CB

<160>24

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>417

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>DNA sequence encoding tandem repeats of FMDV VP1epitopes with linkers

<400>1

<210>2

<211>139

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>amino acid sequence of tandem repeats of FMDV VP1epitopes with linkers

<400>2

<210>3

<211>984

<212>DNA

<213>swine

<400>3

<210>4

<211>328

<212>PRT

<213>swine

<400>4

<210>5

<211>1413

<212>DNA

<213>Foot-and-mouth disease virus

<400>5

<210>6

<211>470

<212>PRT

<213>Foot-and-mouth disease virus

<400>6

<210>7

<211>2814

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>DNA sequence encoding the recombinant protein

<400>7

<210>8

<211>899

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>amino acid sequence of the recombinant protein

<400>8

<210>9

<211>20

<212>PRT

<213>Foot-and-mouth disease virus

<400>9

<210>10

<211>14

<212>PRT

<213>Foot-and-mouth disease virus

<400>10

<210>11

<211>6

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>linker

<400>11

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>linker

<400>12

<210>13

<211>467

<212>PRT

<213>artificial

<223>amino acid sequenceof the recombinant protein

<400>13

<210>14

<211>1401

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>DNA sequence encoding the recombinant protein

<400>14

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>scIgG5’primer

<400>15

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>scIgG3’primer

<400>16

<210>17

<211>41

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>3D5’primer

<400>17

<210>18

<211>16

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>3D3’primer

<400>18

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>3R-IGCD5’primer

<400>19

<210>20

<211>41

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>3R-IGC3’primerl

<400>20

<210>21

<211>41

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>D5’primer

<400>21

<210>22

<211>29

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>3R-IGCD3’primer

<400>22

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>3R-IGC5’primer

<400>23

<210>24

<211>28

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>3R-IGC3’primer2

<400>24

Claims

1.一种用于诱导动物产生抗口蹄疫病毒的特异性免疫应答的疫苗组合物，其包含重组蛋白质，所述重组蛋白质从N端到C端包括：

-口蹄疫病毒外壳蛋白抗原性表位的串联重复；

-免疫球蛋白重链恒定区；和

-口蹄疫病毒的3D蛋白，

其中所述口蹄疫病毒是O型口蹄疫病毒，且所述抗原性表位是来自O型口蹄疫病毒外壳蛋白VP1蛋白的抗原性表位，

其中所述VP1蛋白抗原性表位是选自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列，

其中所述串联重复是两种VP1蛋白抗原性表位的串联重复，所述两种VP1蛋白抗原性表位分别是SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，

其中所述抗原性表位彼此通过肽接头相连接和/或所述抗原性表位的串联重复通过肽接头与所述免疫球蛋白重链恒定区序列相连接，

其中所述肽接头选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，

其中所述免疫球蛋白重链恒定区是SEQ ID NO:4的氨基酸序列，且

其中所述口蹄疫病毒的3D蛋白是SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

2.一种用于诱导动物产生抗口蹄疫病毒的特异性免疫应答的疫苗组合物，其包含：

(i)重组蛋白质，所述重组蛋白质从N端到C端包括：

-口蹄疫病毒外壳蛋白抗原性表位的串联重复；和

-免疫球蛋白重链恒定区；以及

(ii)口蹄疫病毒的3D蛋白，

其中所述肽接头选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，

其中所述口蹄疫病毒的3D蛋白是SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

3.权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述重组蛋白质包括所述抗原性表位的2至5次串联重复。

4.权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述重组蛋白质包括所述抗原性表位的3次串联重复。

5.权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述免疫球蛋白重链恒定区来自与所述动物相同的物种。

6.权利要求1的疫苗组合物，其中所述重组蛋白质是如SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列。

7.权利要求2的疫苗组合物，其中所述重组蛋白质是如SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列。

8.权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述动物是猪、牛、或羊。

9.权利要求1或2的疫苗组合物，还包含药用可接受的载体和/或佐剂。

10.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至9中任一项的疫苗组合物中的重组蛋白质。

11.权利要求10的多核苷酸，其是如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。