CN1737144A

CN1737144A - 口蹄疫复合多表位二价核酸疫苗的构建

Info

Publication number: CN1737144A
Application number: CN 200410011046
Authority: CN
Inventors: 金宁一; 尹革芬; 郑敏; 秦晓冰; 葛淑敏; 李昌; 金扩世; 夏志平; 金洪涛
Original assignee: 金宁一
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2006-02-22

Abstract

一种口蹄疫复合多表位二价核酸疫苗的构建，属于生物技术领域。本发明的目的在于，以O型流行株NYOO和A型FMDV主要结构蛋白VP1基因为基础，以非结构蛋白3ABC及结构蛋白VP4上的Th2细胞表位为辅助基因，以真核表达质粒pVAX1为载体分子，构建针对FMDV O、A两血清型的二价复合多表位核酸疫苗，通过HeLa细胞转染实验及BALB/c小鼠免疫实验，表达所需的目的蛋白并进行免疫学指标的检测，以期获得针对不同血清型和不同流行株的安全高效复合多表位DNA疫苗，从而为有效预防FMD提供理论基础和疫苗储备。

Description

口蹄疫复合多表位二价核酸疫苗的构建

技术领域：

本发明属于生物技术领域。

背景技术：

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的一种急性、高度接触性人畜共患传染病。本病传播速度快、感染率高，是危害养殖业的烈性传染病之一，世界各国都十分重视。虽然FMD在世界许多个国家已经被消灭或很好地被控制了，然而在近几年内，FMD再度给养殖业带来巨大的经济损失。FMD在台湾消失了近二十年后又再度暴发流行，1997年，FMD疫情涉及澎湖以外的整个台湾岛，至6月，发病猪场达6134个，其中6050个全部销毁，受害猪达465.7万头，捕杀销毁384.8万头，经济损失巨大。1998年以来，我国周边的国家包括缅甸、马来西亚、蒙古、韩国、日本等均相继暴发FMD。2001年英国暴发FMD，扑杀动物超过400万头，疫情波及到欧洲大陆。我国也是一个FMD长期流行的国家，自建国以来曾发生5次大流行，尤其是1999年发生的牛猪FMD是该病在国内最严重的一次大流行。据不完全统计，全国扑杀患病动物在60万头以上，直接经济损失高达15亿元。鉴于FMD对养殖业乃至人类的严重威胁，本病一直被国际兽医卫生组织(OIE)和世界联合国粮农组织(FAO)列为A类烈性传染病之首。

FMDV血清型共分7型，65个亚型，型与型之间及同型的亚型与亚型之间没有或仅有部分交叉免疫力，因而使本病的防制变得十分困难。

FMDV的基因组为单股RNA，由大约8500个核苷酸(nt)组成，其分子量约为2.6×10⁶，可分为5’端非编码区、P1区、P2区、P3区以及3端非编码区。其中P1区编码主要的结构蛋白，P2区和P3区编码与病毒复制、翻译，以及完整病毒粒子装配有关的非结构蛋白。

结构蛋白P1区核苷酸序列全长为2154nt，由1A、1B、1C和1D 4个基因编码序列组成，长度依次为167、648、660和639nt，分别编码85、218、220和213个氨基酸的结构多肽。1B、1C和1D位于衣壳表面，为外衣壳蛋白。其中1D蛋白编码多肽VP1，其大部分暴露在病毒表面，是决定病毒抗原性的主要成分。但其他三种结构多肽也都参与免疫原性的构成。不同血清型病毒的抗原位点有所不同，O型病毒有5个位点：抗原位点1由1D GH环(1133-1157)和200-213个氨基酸的线性表位组成。此位点是FMDV最主要的抗原位点，也是FMDV抗原位点的关键所在；抗原位点2位于病毒表面的1B的βB-αβ上，由4个表位组成；抗原位点3位于病毒粒子表面五重轴周围1D的βB-C环上；抗原位点4位于五重轴周围1C的βB球节上；抗原位点5位于1D G-H环内，此位点较为保守。此外，C型和A型FMDV均有4个抗原位点。FMDV主要抗原位点存在于衣壳蛋白VP1第134-158残基中，能与高滴度中和抗体产生强阳性反应的A型病毒多肽在第145-147残基无RGD三联体。O型高滴度抗血清在ELISA中能与第141-150多肽(含有RGD基序)和第135-144(位于RGD上游)反应，表明RGD三联体不是一刺激产生中和抗体的必须成分。FMDV VP1的G-H环具有识别和与中和抗体相互作用的双重功能，某些氨基酸残基在这两个功能中发挥着重要作用。

P3区基因编码序列的长度为2721nt，由3A、3×3B、3C和3D组成，长度依次为459、213、639和1410nt(OlK)。3A编码序列中存在着GUAA保守基序，被认为可能与病毒复制有关。3B又称为VPg，可通过Tyr-OH以脂键共价连接到正负链RNA 5’端，可能作为包装信号存在。3D是一种病毒RNA依赖性聚合酶，用以催化、合成FMDV的RNA。3C蛋白酶由213个氨基酸组成，是聚合蛋白成熟过程中最为重要的蛋白酶之一。FMDV的3C能在P1-P2和P2-P3连接处裂解聚合蛋白。在感染细胞提取物和体外富含FMDV翻译的产物中几乎都无法检测到3C。它能催化裂解2C/3A位点和除1A/1B位点外的所有位点的二级裂解。在感染细胞中，P1被3C蛋白酶催化加工成VP0-VP1和VP3后，这三种蛋白互相作用，形成5S原体，成为病毒结构的基本组件。

目前所设计的和正在研究的诸多基因工程疫苗仍存在许多问题和不足。在许多疫苗设计的抗原成分中仍含有大量与特异性免疫诱导无关的成分，如免疫抑制、增强抗体和自身免疫等免疫病理成分，而这些成分正是引起局部或全身不良反应的重要因素；另外，有些疫苗在设计时为了达到纯度和安全性高的目的(如寡肽疫苗)，往往采用少数几个抗原决定簇，这样又造成了抗原单一，免疫原性弱等缺陷。

技术内容：

本发明的目的在于，以O型流行株NYOO和A型FMDV主要结构蛋白VP1基因为基础，以非结构蛋白3ABC及结构蛋白VP4上的Th2细胞表位为辅助基因，以真核表达质粒pVAX1为载体分子，构建针对FMDV O、A两血清型的二价复合多表位核酸疫苗，通过HeLa细胞转染实验及BALB/c小鼠免疫实验，表达所需的目的蛋白并进行免疫学指标的检测，以期获得针对不同血清型和不同流行株的安全高效复合多表位DNA疫苗，从而为有效预防FMD提供理论基础和疫苗储备。

本发明的构建过程是：

a、根据口蹄疫基因进化树分析，选择ME-EA型毒株作为基因来源，根据基因序列用DNAstar软件设计一对引物，以质粒pMD18-T-VP1为模板进行PCR扩增，获得O型FMDV免疫原基因VP1基因；

b、通过GeneBank获得多个A型FMDV毒株VP1序列，经BLAST比较，选取A22毒株VP1全序列，在序列5’端添加柔性肽序列及酶切位点，在3’端添加终止密码子TAA，设计并合成了A型FMDV VP1序列；

c、选择FMDV的3个Th表位基因，其中2个来自非结构蛋白3ABC，每个表位肽由15个氨基酸残基组成；1个来自高度保守的结构蛋白VP4，其长度20个氨基酸残基，三个表位拼接后合成150个碱基的多表位基因；

d、将以上三个基因进行组合及串联，插入到真核表达质粒pVAX1载体启动子下游，分别构建了含O型和A型FMDV主要结构蛋白VP1基因、非结构蛋白3ABC及结构蛋白VP4上的Th2细胞表位基因的核酸疫苗的pVAX1-OA、pVAX1-OAT。

本发明设计的引物是：

上游引物Y3(Forward primer)：5′-ATGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCT-3′

下游引物Y4(Reverse primer)：5′-GCGGCCGCCCAAAAGCTGTTTCACAGG-3′

本发明pVAX1-OA的基因序列是：

atg acc acc tcc aca ggt gag tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt 48

Met Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val

1 5 10 15

gag aac tac ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat 96

Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp

20 25 30

gtc tcg ttc ata tta gac aga ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa 144

Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln

35 40 45

att aat gcg ttg gac ctg atg caa acc cct gca cac act ttg gta ggc 192

Ile Asn Ala Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly

50 55 60

gcg ctc ctc cgt act gcc acc tac tac ttc gca gat cta gaa gtg gca 240

Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala

65 70 75 80

gtg aaa cac gag ggg aac ctt acc tgg gtc ccg aat ggg gcg ccc gag 288

Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu

85 90 95

gca gcg ttg gac aac acc acc aat cca acg gct tac cac aag gca ccg 336

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro

100 105 110

ctc acc cgg ctt gca ctg cct tac acg gca cca cac cgt gtc ttg gct 384

Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala

115 120 125

act gtt tac aac ggg aac tgc aag tat ggc gag agc ccc gtg acc aat 432

Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn

130 135 140

gtg aga ggt gac ctg caa gta ttg gcc cag aag gcg gca aga acg ctg 480

Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu

145 150 155 160

cct acc tcc ttc aat tac ggt gcc atc aaa gcc act cgg gtg act gaa 528

Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu

165 170 175

ctg ctt tac cgc atg aag agg gcc gaa aca tac tgc ccc tgg cct ctt 576

Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Trp Pro Leu

180 185 190

ttg gct att cac ccg agc gaa gct aga cac aaa caa aag att gtg gcg 624

Leu Ala Ile His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala

195 200 205

cct gtg aaa cag ctt ttg ggg acc tgg tct gca ggc ggc cgc acc acc 672

Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly Thr Trp Ser Ala Gly Gly Arg Thr Thr

210 215 220

tcc aca ggt gag tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt gag aac tac 720

Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr

225 230 235 240

ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat gtc tcg ttc 768

Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe

245 250 255

ata tta gac aga ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa att aat gcg 816

Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Ala

260 265 270

ttg gac ctg atg caa acc cct gca cac act ttg gta ggc gcg ctc ctc 864

Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu

275 280 285

cgt act gcc acc tac tac ttc gca gat cta gaa gtg gca gtg aaa cac 912

Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His

290 295 300

gag ggg aac ctt acc tgg gtc ccg aat ggg gcg ccc gag gca gcg ttg 960

Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu

305 310 315 320

gac aac acc acc aat cca acg gct tac cac aag gca ccg crc acc cgg 1008

Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg

325 330 335

ctt gca ctg cct tac acg gca cca cac cgt gtc ttg gct act gtt tac 1056

Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr

340 345 350

aac ggg aac tgc aag tat tcc gca ggt ggt atg ggc aga cgg ggc gac 1104

Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser Ala Gly Gly Met Gly Arg Arg Gly Asp

355 360 365

cta gag cct ctc gcg gcg agg gtc gcc gct cag ctt cct act tct ttc 1152

Leu Glu Pro Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Thr Ser Phe

370 375 380

aac ttt ggt gca att caa gcc acg acc atc cac gag ctc ctc gtg cgc 1200

Asn Phe Gly Ala Ile Gln Ala Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg

385 390 395 400

atg aag cgt gcc gaa ctc tac tgc ccc aga cca ctg ttg gca gtg gtg 1248

Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Val

405 410 415

gtg tcg tct caa gac aga cac aaa cag aag atc att gca cct gca aaa 1296

Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys

420 425 430

caa ctt ttg taa ctc gag 1314

Gln Leu Leu Leu Glu

435

本发明pVAXl-OAT的基因序列是：

atg gca gca att gag ttc ttt gag ggc atg gtc cac gac tcc atc aaa 48

Met Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys

1 5 10 15

gcc gtt ctt gcc aaa gac gga gct gac act ttc atc gtc ggc act ggc 96

Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr Gly

20 25 30

aat act ggc agc ata ata aac aac tac tac atg cag cag tat caa aac 144

Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn

35 40 45

tct atg gac ggg atc cag atc tcc agt ctt acc acc tcc aca ggt gag 192

Ser Met Asp Gly Ile Gln Ile Ser Ser Leu Thr Thr Ser Thr Gly Glu

50 55 60

tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt gag aac tac ggt ggt gag aca 240

Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr

65 70 75 80

cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat gtc tcg ttc ata tta gac aga 288

Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg

85 90 95

ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa att aat gcg ttg gac ctg atg 336

Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Ala Leu Asp Leu Met

100 105 110

caa acc cct gca cac act ttg gta ggc gcg ctc ctc cgt act gcc acc 384

Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr

115 120 125

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Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu

130 135 140

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145 150 155 160

aat cca acg gct tac cac aag gca ccg ctc aec cgg ctt gca ctg cct 528

Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro

165 170 175

tac acg gca cca cac cgt gtc ttg gct act gtt tac aac ggg aac tgc 576

Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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325 330 335

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Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe

340 345 350

gca gat cta gaa gtg gca gtg aaa cac gag ggg aac ctt acc tgg gtc 1104

Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val

355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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Ala Gly Gly Met Gly Arg Arg Gly Asp Leu Glu Pro Leu Ala Ala Arg

420 425 430

gtc gcc gct cag ctt cct act tct ttc aac ttt ggt gca att caa gcc 1344

Val Ala Ala Gln Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Gln Ala

435 440 445

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450 455 460

tgc ccc aga cca ctg ttg gca gtg gtg gtg tcg tct caa gac aga cac 1440

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465 470 475 480

aaa cag aag atc att gca cct gca aaa caa ctt ttg taa ctc gag 1485

Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Leu Glu

485 490

所构建的两个核酸疫苗pVAX1-OA和pVAX1-OAT可作为预防口蹄疫的新型多价基因工程疫苗。

本发明的优点及积极效果：

1、本发明获得的重组核酸疫苗pVAX1-OA可表达完整的O、A型FMDV结构蛋白VP1基因；重组核酸疫苗pVAX1-OAT可同时表达完整的O、A型FMDV结构蛋白VP1基因及非结构蛋白3ABC、结构蛋白VP4上的Th2细胞表位基因。两种核酸疫苗表达的蛋白均可与相应的抗体发生特异性反应。

2、本发明获得的两种重组核酸疫苗均可刺激小鼠产生特异的体液免疫和细胞免疫。

3、本发明获得的重组核酸疫苗对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。

4、本发明所使用的目的基因为O型和A型FMDV基因，从而构建的重组核酸疫苗可作为我国预防O型和A型FMD的DNA疫苗。

5、本发明中核酸疫苗表达的非结构蛋白3ABC辅助性Th2表位发挥了类似免疫佐剂的作用。

附图说明：

图1是本发明重组核酸疫苗质粒pVAX1-OA构建流程图；

图2是本发明重组核酸疫苗质粒pVAX1-OAT构建流程图。

具体实施方式：

1.分子生物学常规的实验操作

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等均参照《分子克隆实验指南》(金冬雁、黎孟枫等译，第二版，科学出版社，1992)相关章节进行。

2.目的基因的获得

2.1 O型FMDV主要免疫原基因VP1的克隆

选择近年来在国内外呈主要流行趋势的ME-EA型毒株JL-3-1999作为基因来源。根据基因序列设计一对引物Y3/Y4，以质粒pMD18-T-VP1(O)为模板进行PCR扩增。同时在上游引物Y3的5′端加了起始密码子ATG，在下游引物的5′端添加了核酸内切酶NotI的序列。

上游引物Y3(Forward primer)：5′-ATGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCT-3′

下游引物Y4(Reverse primer)：5′-GCGGCCGCCCAAAAGCTGTTTCACAGG-3′

PCR反应条件如下：

pMD18-T-VP1(O)质粒 2u1(约100ng)

F-引物(10pmol/ul) 2ul

R-引物(10pmol/ul) 2ul

PCR buffer 5ul

dNTPs(2.5mM each) 5ul

ddH₂O 34ul

50ul

95℃预变性5min，95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，共30循环，72℃延伸5min。

2.2 A型FMDV主要免疫原VP1基因的获得

通过GeneBank获得多个在东南亚国家流行的A型FMDV毒株VP1序列，经BLAST比较，选取了与其它毒株同源性较高且流行较为广泛的A22毒株，从GeneBank取得它的VP1全序列共639bp。考虑到与其它基因连接后表位间的相互干扰，在序列的5′端添加了柔性肽序列，同时为了便于基因的拼接，在5′端还插入了NotI酶切位点序列，在3′添加了终止密码子TAA。设计完成后送TaKaRa公司进行基因合成。

2.3 辅助性Th2表位基因的设计及合成

在FMDV结构蛋白和非结构蛋白中存在多个受MHC限制的Th2细胞表位，但不同Th2表位辅助B淋巴细胞产生抗体的能力不一，为提高二价苗的免疫效果，我们选择了其中效果最佳的三个Th表位基因，其中两个来自非结构蛋白3ABC，每个表位肽由15个氨基酸残基组成；另一个来自高度保守的结构蛋白VP4，其长度为20个氨基酸残基。三个表位拼接后所组成的基因全长150个碱基，在基因序列的5′端添加了起始密码子ATG。通过基因合成方式获得基因。

3 重组质粒的构建

3.1含FMDV O、A型VP1基因和Th2细胞表位中间载体的构建

将O型VP1基因用BamHI/EcoRI从pUCM-T-VP1(O)载体切下，定向连入质粒pMD18-T-3ABC的3ABC基因下游，构建成pMD18-T-3ABC-VP1(O)质粒；再用Not I/SalI从pMD18-T-VP1(A)载体上将A型VP1基因切下后，定向插入到pMD18-T-3ABC-VP1(O)质粒的O型VP1基因下游，从而完成基因的拼接和中间载体pMD18-T-OAT的构建，三个片段拼接后即为预期的FMDV复合多表位基因，基因全长为1494bp。取适量纯化的pMD18-T-OAT质粒，送TaKaRa公司作测序鉴定，其余部分于20℃保存备用。

3.2 含FMDV O、A型结构蛋白VP1基因的真核表达质粒的构建

用限制性内切酶HindIII和NotI消化质粒pUCm-T-VP1(O)获得O型VP1基因片段，定向插入到pMD18-T-VP1(A)载体，并使其处于VP1(A)基因的上游，获得pMD18-T-OA质粒；再用HincII和XbaI双酶切后获得OA基因片段，插入到经EcoRV和XbaI消化的线性载体pVAX1中，构建二价表达质粒pVAX1-OA。

3.3 含复合多表位基因OAT的重组表达质粒的构建

将3.1构建的克隆质粒pMD18-T-OAT用HindIII和EcoRI双酶切后回收OAT基因，定向插入到核酸疫苗质粒pVAX1相同酶切位点中，构建含OAT基因的真核表达质粒pVAX1-OAT。

4.重组质粒转染HeLa细胞

质粒转染细胞采用脂质体法：在6×30mm细胞培养板中接种传代HeLa细胞1×10⁵～3×10⁵个/ml，当细胞长至60～80％单层，将培养液弃掉，用无Ca²⁺、Mg²⁺PBS洗涤细胞两遍，备用。接种转染试剂，即在100l 1640培养液中加入适量脂质体，轻轻混匀，另用5个Eppendorf管，先在每个管中分别加入100l 1640培养液，然后取纯化的重组质粒DNA pVAX1-OA、pVAX1-OAT和对照质粒pVAX1各10g滴加于前者液体中并轻轻混匀，室温下作用15～30min，加入细胞板内，补加液体至700l。置于37℃ 5％CO₂培养箱内作用8～10h，补加新鲜配制的含10％FCS的1640培养液，继续培养48～72h，收取细胞。

5. 重组质粒表达产物的检测

5.1 SDS-PAGE凝胶电泳

转染后72h，弃培养液，用1ml 37℃预热的TEN(40mmol/LTris·Cl pH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脱细胞，收集于Eppendorf管中，3000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗一次，加60l细胞裂解液(10mmol/L Tris·Cl pH7.4，1mmol/LMgCl₂，0.5％NP40，20g/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000rpm离心5min，取上清液，加入等量2倍上样缓冲液混匀，于12％SDS-PAGE进行电泳。

以转染空白真核表达载体质粒的细胞、空白细胞和低分子量标准蛋白质(97kDa、66kDa、43kDa、31kDa、20kDa、14kDa)作对照，分别取适量样品加等量2倍上样缓冲液，用微量移液器加入加样槽，以8V/cm电压电泳。当溴酚蓝前沿进入分离胶后，换以12v/cm电压电泳，溴酚蓝至分离胶底部后，取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色或蛋白印迹。

5.2 Western blot检测

SDS-PAGE电泳结束后，切出含待转移蛋白的凝胶，剪6张同样大小的Whatman 3mm滤纸和1张硝酸纤维素膜(Millipore HAWP)，用软铅笔在纤维膜一角做好标记。将它们漂浮于ddH₂O水平面上，润湿后浸于水中5min，驱除膜上的气泡，再浸泡于转移缓冲液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris，0.037％SDS，20％甲醇)中。在塑料支架上依次叠放浸湿的海绵、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，使滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜对齐，且各层之间无气泡存在；将塑料支架夹紧插入电转移槽中；硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，加转移液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris·C1，0.037％SDS，20％甲醇)稍超过凝胶，以30V～35V电压，4℃转移14～16h。转移完毕，将硝酸纤维素膜浸于封闭液(5％脱脂奶粉或3％BSA，150mmol/L NaCl，0.02％Tween-20)中约室温2h，以封闭无关蛋白结合位点，同时对凝胶进行染色，检查蛋白转移是否完全。封闭后，用洗涤液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5，0.15mol/L NaCl，0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min；将一抗(豚鼠抗FMDV多克隆血清)用抗体稀释液(0.01mol/L TBS，1％BSA，0.05％Tween-20)适当稀释，滴在保鲜膜上，然后将硝酸纤维素膜正面(吸附抗原面)向下覆盖在加抗体的保鲜膜上，室温反应2h；用洗涤液洗膜3次，每次5min；同样方法加酶标二抗(碱性磷酸酶标记的山羊抗豚鼠IgG)，室温反应2h；用洗涤液洗膜3次，每次5min；膜稍干，加酶底物反应液进行反应。

酶底物反应液配制：

(1)NBT(氮兰四唑)在10ml 70％的二甲基酰胺中溶解0.5g NBT；

(2)BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)在10ml 100％二甲基酰胺中溶解0.5g BCIP；

(3)碱性磷酸酶缓冲液：100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl₂，100mmol/L Tris·Cl pH9.5。取66 l NBT与10ml碱性磷酸酶缓冲液混匀，加入33l BCIP，该溶液在30min内使用；

将洗涤过的膜移入浅托盘中，按0.1ml/cm²加入底物反应液，于室温平缓摇动进行温育显色。显色5～20min后将硝酸纤维素膜移至蒸馏水中，终止显色，观察结果。

5.3 间接免疫荧光实验(IFA)

按步骤4的方法，将质粒转染到长有70％HeLa细胞单层的玻片上，5％CO₂、37℃培养三d后，取出玻片，用PBS液冲洗三次，100％冷丙酮固定10～30min，再用PBS液洗涤三次；用含有3％BSA的PBS封闭2h，冲洗三次，每次5min；加入一抗(兔抗FMDV血清)，37℃作用2h后，冲洗3次；加入二抗(异硫氰荧光素标记的羊抗兔IgG)，室温避光作用1h，冲洗3次；吸干，滴加50％甘油水溶液，倒置于载玻片上，荧光显微镜下观察(加入二抗后操作步骤均应避光进行；一般情况下，尽量在较短时间内完成拍照，以免荧光淬灭)。

6 核酸疫苗质粒免疫小鼠

用碱裂解法大量制备质粒DNA，PEG纯化后溶于无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)中，用紫外分光光度法进行DNA定量，终浓度调至1μg/μl 。

6.1 实验分组

6-8周龄雌性BALB/c小鼠，随机分成9组，每组12只，分别按100ug/只腿部肌肉注射重组质粒、空质粒pVAX1和PBS溶液。每间隔2周加强免疫一次，第三次免疫后10d杀鼠取血清和脾淋巴细胞检测抗体、T淋巴细胞亚群的数量及CTL活性。分组情况见表1。

6.2 脾T淋巴细胞的制备

小鼠免疫后断颈处死取脾，用载玻片毛面相对研磨脾脏，加入4mlPBS，通过滤膜过滤去除组织碎片；将细胞悬液吸入10ml离心管，2000rpm离心10min，弃上清；加入3ml红细胞裂解液悬浮细胞(Tris-NH4Cl缓冲液，取Tris 1.03g及NH4Cl 3.735g，加双馏水至500ml，过G-5漏斗，4℃储存备用)室温放置10min，2000rpm离心10min，弃上清；加入4ml Hank’s液洗涤并进行细胞计数，离心(同上)后加入适量10％1640培养液，调整细胞数达1×10⁷个/ml。

免疫用质粒	第一次免疫第二次免疫第三次免疫
免疫用质粒	第一次免疫第二次免疫第三次免疫	1 pVAX12 PVAX1-OA3 pVAX1-OAT4 pVRI-OA	①每组12只小鼠；②连续三次肌肉注射，每次间隔14d；

5 pVRI-OAT6 pVAX1-OAT+PVAX1-IL187 pVAX1-P18 灭活苗9 PBS

③每次注射质粒100μg/只；④每隔10d采血一次，分离血清。

6.3 脾T淋巴细胞亚群数量的检测

制备小鼠脾单细胞悬液1-2×10⁶/ml，用荧光洗液洗两遍(荧光洗液：100ml 0.15M PBS(pH7.4)，2％NBS)。加入PE标记的抗CD4+抗体和FITC标记的抗CD8+抗体各20μl，总体积为40ul混匀，或加入FITC标记的CD3抗体45μl，置4℃避光30min，取出后用荧光洗液洗两遍。加入0.5ml荧光保存液(荧光保存液：100ml 0.15M PBS(pH7.4)，2％葡萄糖，1％甲醛，0.1％N_aN₃)，4℃保存(一周以内)，用流式细胞仪分析T细胞亚群。FACS共检测10000个细胞，分别得到脾细胞中CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞的数量，所得数据用SPSS软件进行统计学分析。

6.4脾特异性CTL杀伤活性检测

6.4.1靶细胞：将FMDV O型VP1基因定向插入真核表达载体质粒pDisplay中，构建含FMDV嵌合基因的真核表达质粒pDisplay-VP1。将构建的重组质粒大量制备并纯化后转染BALB/c小鼠P815细胞(小鼠肥大细胞瘤细胞)，用G418(350μg/ml)进行加压筛选，当对照细胞大部分死亡后，换含G418(150μg/ml)细胞培养液培养约2周，用间接免疫荧光进行鉴定。该靶细胞可用于CTL检测。靶细胞的具体制备参见相关文献进行。

取培养24-48h的靶细胞，洗涤3次，用完全RPMI-1640培养液调整细胞数为1×10⁵个/ml。

6.4.2刺激细胞：应用丝裂霉素(80g/ml)对上述制备的靶细胞作用4h后，调整到1×10⁶个/ml，备用。

6.4.3淋巴细胞的制备：无菌条件下解剖小鼠，加少量Hank’s液，于200目铜网上碾磨分散脾细胞，制备淋巴细胞单细胞悬液。用含2μg/ml的ConA、20ng/ml IL-2的1640培养液，于37℃5％CO₂培养1-2d。按10∶1加入刺激细胞作用24～48h，在调整脾细胞数到1×10⁷个/ml。(注意：将刺激细胞和脾细胞充分混匀)，继续培养4-5d。

6.4.4特异性CTL活性检测

1)效应细胞的记数将每个样品板中的效应细胞进行记数，最后调整细胞数达到1×10⁶个/ml。

2)靶细胞的记数将经G418加压筛选的靶细胞进行记数，计算所需靶细胞数量。

3)脾细胞与靶细胞的处理将两种细胞均用Hank s液洗涤一次后，最后一次用5％胎牛血清的1640培养液重新悬浮细胞。

4)上板将经过上述处理的效应细胞(1×10⁶个/ml)和靶细胞分别加入96孔细胞培养板中，每个样品设8个孔，其中4个孔加靶细胞，按效应细胞∶靶细胞分别为50∶1和25∶1。另设实验测试孔及对照孔。

5)将上述37℃、5％CO₂培养箱中至少培养4h后，尽量使脾细胞和靶细胞充分接触。

6)待作用完全后(即4h后)，250g离心4min。

7)用移液器小心从96孔板每一孔中移出50l液体，分别加入另外一块ELISA板的相应孔内(注意样品顺序)，再加入预先用底物缓冲液配置的底物混合物50l作用30min(注意：底物及底物混合物用完后迅速置于-20℃冰箱内，不得长时间放置于37℃条件下；二者作用过程中，须用铂纸等遮光)。

8)作用30min后，加入硫酸终止液50l，充分混合后在酶标仪上进行检测。

9)根据测得数据计算每组脾细胞的杀伤活性

6.5免疫小鼠血清抗体效价检测

眼眶采血后分离血清，离心收集上清备用。用间接ELISA方法测定抗体效价，同时用非免疫鼠血清做阴性对照，主要参照《动物病毒学》第二版进行。具体操作如下：

ELISA试剂：

PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，溶于1000ml蒸馏水；

包被液(pH7.6)：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，溶于1000ml水中；或用pH9.6的PBS包被；

封闭液：用PBS缓冲液配3％BSA；

洗涤液：PBS缓冲液中加0.05％Tween-20；

底物溶液：pH5.0磷酸柠檬酸缓冲液：0.2M Na₂HPO₄(28.4g/L)25.7ml与0.1M柠檬酸24.3ml混合后，取出10ml，加入以下成分：邻苯二胺(OPD)4mg，30％H₂O₂ 10ul。混匀后立即使用。

步骤：

1)包被：用包被液等体积稀释抗原，在96孔酶标板每孔加入，100ul 37℃包被1.5h(也可4℃包被过夜)；

2)封闭：加入100ul/孔的封闭液，37℃封闭1.5h；

3)洗涤：用洗涤液洗板三次，每次3min；

4)结合一抗：用含0.3％BSA的PBS缓冲液倍比稀释抗血清，每孔加100ul，其中一列加倍比稀释的对照阳性血清，每孔100ul。37℃孵育1.5h；

5)洗涤：用洗涤液洗板3次，每次3min；

6)结合二抗：用含0.3％BSA的PBS缓冲液按适当比例(参照说明书)稀释，37℃孵育1.5h；

7)洗涤：用洗涤液洗板5次，每次3min；

8)显色：每孔加100ul底物溶液(现用现配)，暗处放置1～3min，待显色后每孔加入50ul 30％浓硫酸终止显色；

9)读板：使用酶标仪读490nm的OD值。

检测结果：

将获得的两种核酸疫苗pVAX1-OA和pVAX1-OAT转染HeLa细胞，用间接免疫荧光实验和Western-blot检测，结果均为阳性。说明构建的核酸疫苗在体外可分别表达O、A型FMDV结构蛋白VP1基因及Th2细胞表位基因。将此核酸疫苗免疫小鼠后，能刺激脾T淋巴细胞增殖，激发产生特异性CTL反应和抗O、A型FMDV抗体；含非结构蛋白3ABC辅助性Th2表位的重组质粒pVAX1-OAT诱导产生的特异性抗体水平明显高于不含该T表位的pVAX1-OA和pVRI-OA重组质粒。

Claims

1、一种口蹄疫复合多表位二价核酸疫苗的构建，其构建过程是：

2、根据权利1所述的口蹄疫复合多表位二价核酸疫苗的构建，其特征在于：所设计的引物是：

上游引物Y3(Forward primer)：5′-ATGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCT-3′

下游引物Y4(Reverse primer)：5′-GCGGCCGCCCAAAAGCTGTTTCACAGG-3′

3、根据权利1所述的口蹄疫复合多表位二价核酸疫苗的构建，其pVAX1-OA的基因序列是：

atg acc acc tcc aca ggt gag tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt 48

Met Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val

1 5 10 15

gag aac tac ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat 96

Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp

20 25 30

gtc tcg ttc ata tta gac aga ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa 144

Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln

35 40 45

att aat gcg ttg gac ctg atg caa acc cct gca cac act ttg gta ggc 192

Ile Asn Ala Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly

50 55 60

gcg ctc ctc cgt act gcc acc tac tac ttc gca gat cta gaa gtg gca 240

Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala

65 70 75 80

gtg aaa cac gag ggg aac ctt acc tgg gtc ccg aat ggg gcg ccc gag 288

Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu

85 90 95

gca gcg ttg gac aac acc acc aat cca acg gct tac cac aag gca ccg 336

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro

100 105 110

ctc acc cgg ctt gca ctg cct tac acg gca cca cac cgt gtc ttg gct 384

Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala

115 120 125

act gtt tac aac ggg aac tgc aag tat ggc gag agc ccc gtg acc aat 432

Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn

130 135 140

gtg aga ggt gac ctg caa gta ttg gcc cag aag gcg gca aga acg ctg 480

Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu

145 150 155 160

cct acc tcc ttc aat tac ggt gcc atc aaa gcc act cgg gtg act gaa 528

Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu

165 170 175

ctg ctt tac cgc atg aag agg gcc gaa aca tac tgc ccc tgg cct ctt 576

Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Trp Pro Leu

180 185 190

ttg gct att cac ccg agc gaa gct aga cac aaa caa aag att gtg gcg 624

Leu Ala Ile His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala

195 200 205

cct gtg aaa cag ctt ttg ggg acc tgg tct gca ggc ggc cgc acc acc 672

Pro Val Lys Gln Leu Leu Gly Thr Trp Ser Ala Gly Gly Arg Thr Thr

210 215 220

tcc aca ggt gag tcg gct gac ccc gtg act gcc act gtt gag aac tac 720

Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr

225 230 235 240

ggt ggt gag aca cag gtc cag aga cgc caa cac acg gat gtc tcg ttc 768

Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe

245 250 255

ata tta gac aga ttt gtg aaa gta aca cca aaa gac caa att aat gcg 816

Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Ala

260 265 270

ttg gac ctg atg caa acc cct gca cac act ttg gta ggc gcg ctc ctc 864

Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu

275 280 285

cgt act gcc acc tac tac ttc gca gat cta gaa gtg gca gtg aaa cac 912

Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His

290 295 300

gag ggg aac ctt acc tgg gtc ccg aat ggg gcg ccc gag gca gcg ttg 960

Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu

305 310 315 320

gac aac acc acc aat cca acg gct tac cac aag gca ccg ctc acc cgg 1008

Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg

325 330 335

ctt gca ctg cct tac acg gca cca cac cgt gtc ttg gct act gtt tac 1056

Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr

340 345 350

aac ggg aac tgc aag tat tcc gca ggt ggt atg ggc aga cgg ggc gac 1104

Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ser Ala Gly Gly Met Gly Arg Arg Gly Asp

355 360 365

cta gag cct ctc gcg gcg agg gtc gcc gct cag ctt cct act tct ttc 1152

Leu Glu Pro Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Thr Ser Phe

370 375 380

aac ttt ggt gca att caa gcc acg acc atc cac gag ctc ctc gtg cgc 1200

Asn Phe Gly Ala Ile Gln Ala Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg

385 390 395 400

atg aag cgt gcc gaa ctc tac tgc ccc aga cca ctg ttg gca gtg gtg 1248

Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Val

405 410 415

gtg tcg tct caa gac aga cac aaa cag aag atc att gca cct gca aaa 1296

Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys

420 425 430

caa ctt ttg taa ctc gag 1314

Gln Leu Leu Leu Glu

435

4、根据权利1所述的口蹄疫复合多表位二价核酸疫苗的构建，其pVAX1-OAT的基因序列是：

atg gca gca att gag ttc ttt gag ggc atg gtc cac gac tcc atc aaa 48

Met Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys

1 5 10 15

gcc gtt ctt gcc aaa gac gga gct gac act ttc atc gtc ggc act ggc 96

Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val Gly Thr Gly

20 25 30

aat act ggc agc ata ata aac aac tac tac atg cag cag tat caa aac 144

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg

85 90 95

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165 170 175

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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Ala Gly Gly Met Gly Arg Arg Gly Asp Leu Glu Pro Leu Ala Ala Arg

420 425 430

gtc gcc gct cag ctt cct act tct ttc aac ttt ggt gca att caa gcc 1344

Val Ala Ala Gln Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Gln Ala

435 440 445

acg acc atc cac gag ctc ctc gtg cgc atg aag cgt gcc gaa ctc tac 1392

Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr

450 455 460

tgc ccc aga cca ctg ttg gca gtg gtg gtg tcg tct caa gac aga cac 1440

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465 470 475 480

aaa cag aag atc att gca cct gca aaa caa ctt ttg taa ctc gag 1485

Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Leu Glu

485 490

5、所构建的两个核酸疫苗pVAX1-OA和pVAX1-OAT可作为预防口蹄疫的新型多价基因工程疫苗。