CN102772797B

CN102772797B - O型口蹄疫病毒中4个亚型基因工程多肽疫苗及其用途

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Publication number: CN102772797B
Application number: CN 201110123390
Authority: CN
Inventors: 吴晓琰; 赵泓; 龚铁军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2031-05-13
Also published as: CN102772797A

Abstract

O型口蹄疫病毒4个亚型的基因工程多肽疫苗及其用途，选择O型口蹄疫病毒常见的4个亚型(Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1；India 2004，GenBank：AY593828.1；China/1/99 Tibet，GenBank：AF506822.2；Akesu 2007，GenBank：AF511039.1)，取VP4的T-细胞helper15个氨基酸的片段的DNA序列及4种亚型VP1 B细胞决定簇的DNA序列串联【VP4T helper-VPI(Wuhan2006)-VP1(India 2004)-VP1(China/1/99Tibet)-VP1(Akesu 2007)】，克隆，不含有载体蛋白，构建1个基因工程菌。经过高密度发酵，细胞破碎、包涵体复性，融合蛋白的分离纯化，冻干后即可获得抗原蛋白产品，与佐剂匀浆形成多肽疫苗。该疫苗含有SEQ ID所示的核酸序列所编码的多肽，安全性好，免疫效价高，一次免疫可涵盖O型口蹄疫病毒常见的4个亚型，适于大规模生产。

Description

O型口蹄疫病毒中4个亚型基因工程多肽疫苗及其用途

技术领域

本发明涉及一种新型的口蹄疫疫苗，特别是一种由基因工程方法生产的O型口蹄疫病毒中4个亚型(Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1；India 2004，GenBank：AY593828.1；China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2；Akesu 2007，GenBank：AF511039.1)的基因工程多肽疫苗及其制备方法和用途。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是畜牧业中偶蹄类动物(猪、牛、羊及骆驼)的一种急性、热性、高度接触性传染病，造成疫情发生的国家和地区的巨大的经济损失。

口蹄疫是一个全球性的问题，这种疾病的流行曾对德国(1937-1938)、土耳其(1964-1965)、英国(1967-1968、2007、2009)、奥地利(1973)、法国(1974)、韩国(2000、2002、2010、2011)、日本(2000、2010)、朝鲜(2011)等国家造成巨大的经济损失。目前，世界上大多数的国家属于“口蹄疫疫区”，非口蹄疫的国家或地区仅占少数。我国是口蹄疫疫区，每年都有数次至十数次疫情报道至世界动物卫生组织(Office international des épizooties，OIE)。

口蹄疫的临床诊断特点为口腔粘膜、蹄部和乳房的皮肤发生水疱和溃烂，由口蹄疫病毒引起，对于畜牧业，猪、牛及羊的饲养及畜产品的贸易危害极大。口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)属于细小RNA病毒，对猪、牛及羊传染途径多，毒力强，一头病牛的排毒量可感染100万头牛，1克病猪蹄部水疱皮可使10万头猪感染发病。易于传播，传播迅速，流行面广，生产性能下降，防治费用高，发病率100％，成年畜死亡率一般1-2％，但幼畜高达50％，甚至100％。

口蹄疫病毒颗粒中含有一条正链极性的、由8500个核苷酸组成的单链RNA。病毒颗粒的囊膜包括包绕单链RNA的四种结构蛋白VP1(分子量34000)、VP2(分子量30000)、VP3(分子量26000)、VP4(分子量13500)。四种结构蛋白每种60个分子构成一个二十面体病毒粒子。二十面体的顶点由结构蛋白VP1的免疫决定簇区域为141-160区域和200-213区域。

口蹄疫病毒具有显著的抗原多样性，目前发现的FMDV有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。每种血清型还可以继续分成多种亚型。中国原为O型FMD流行区，从2009年7月份开始至2010年6月，我国总共向世界动物卫生组织报告了36起口蹄疫疫情，其中2010年1-6月份，向世界卫生组织上报猪口蹄疫疫情12次，均为涉及不同亚型的O型口蹄疫。

对于口蹄疫FMD，注射疫苗是目前预防口蹄疫的最有效手段。但是，中国存在多个O型口蹄疫的亚型，主要的就有8种，为免疫工作带来难题。免疫疫苗有：免疫疫苗有：

1、减毒疫苗及灭活疫苗：

传统的减毒疫苗及灭活疫苗是利用大量培养动物细胞，然后感染口蹄疫病毒，经过培养、分离病毒，再用化学试剂使病毒灭活或减毒后制备而成。减毒疫苗及灭活疫苗只能针对O型口蹄疫的某一个亚型，不能覆盖多种亚型。由于病毒不断发生变异，目前我国O型口蹄疫各种亚型均有发生。减毒疫苗及灭活疫苗是我国目前主要使用的口蹄疫疫苗，但是，未能满意控制O型口蹄疫疫情，已不能满足畜牧业生产的需要。

2、核酸疫苗：

核酸疫苗，又称DNA疫苗。其机理是动物细胞摄取质粒DNA后，动物细胞可以使质粒DNA表达形成多肽抗原，引起动物的特异性免疫应答。口蹄疫核酸疫苗在国内外的研究中均显示其对口蹄疫具有一定的免疫保护效果，但是目前为止，其免疫保护效果与灭活疫苗相比未显示其理论上的优势。

就目前的技术而言，核酸疫苗的生产周期长，其技术大规模生产困难。其次，最为重要的是安全性问题，主要有以下几个方面：质粒DNA可能诱导自身免疫反应；肌肉注射质粒后，仅有很少部分被肌细胞摄取，质粒去向如何尚待进一步查明；影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素很多，效果不太确定；外源DNA注入体内后，可能整合到宿主基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞。

3、多肽疫苗：

多肽疫苗能克服常规疫苗的缺点，很早就被认为是动物传染病预防用的终极疫苗。1982年研发出人工合成的多肽苗。使用大肠杆菌作为寄主细胞发酵培养时间只需20个小时，周期比用动物细胞生产灭活疫苗短得多，基因工程疫苗对环境没有污染，没有泄露的危险，非常安全，且生产出的疫苗在贮藏、运输和使用过程中不需要冷藏，效价稳定。因此，制备出免疫效价增高而且可用于多个亚型及多价基因工程口蹄疫疫苗是我们不断追求的目标。

20多年来多肽疫苗的研究多集中在VP1外壳蛋白的B细胞单一免疫决定簇，进一步研究表明结构蛋白VP1的免疫决定簇为141-160区域和200-213区域，这两个区域的多肽片段与载体蛋白经化学联接后产生的抗体能中和病毒粒子(Nature，1982，298：30-33；J.Virology，2000，74：4902-4907；J.Virology，2001，75：3164-3174；J.Virology，2003，77：8633-8640；Vaccine，2002，20：2603-2610)。然而因机体中和抗体产生较少，合成多肽疫苗免疫动物后所起的免疫保护作用并没有人们当初设想的那么理想，利用价值甚至一度被否认。在诱导机体产生免疫的过程中，单一的中和抗原表位是远远不够的。

近年来的研究证明除了VP1的B细胞免疫决定簇之外，需要VP4的T细胞免疫簇协同作用，可获得很好的免疫中和抗体保护效果。

如：复旦大学等单位研制的Asia1基因工程疫苗含T-helper和VP1免疫决定簇疫苗具有保护效果，能够产生中和抗体。

再如：美国UBI公司合成的多肽疫苗具有T-细胞Helper多肽与VP1的B细胞免疫决定簇多肽，大大增强了中和抗体的作用(10倍左右)，具有明确的免疫保护效果。具有良好的安全性：无发热症状、无过敏反应发生、注射部位无吸收不良现象、对妊娠母猪的健康状况和妊娠没有影响，对产仔成绩也没有影响。但是，其缺点是只能针对O型口蹄疫的某一个亚型，在口蹄疫病毒迅速变异的今天，已不能满足需要。

目前需要大量、廉价生产能覆盖多个O型口蹄疫亚型多肽类疫苗。但是，化学合成超过20个氨基酸的肽链非常昂贵。因此，需要发展生物技术通过基因工程大量生产多肽。然而，实际应用还距离很远。根据近20年对多肽的研究报告，除胰岛素外，基因工程并不比化学合成具有优势。根本原因是基因工程的理论发展与实际应用尚有待发展，况且，多肽在体内迅速降解不利于相应抗体的诱导产生。应利用基因工程技术制备FMDV多肽疫苗。与其他基因工程多肽产品一样，生产需解决一系列的上游设计与下游工艺问题。尽管有很多报道，离应用尚远。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的缺陷，提供一种新型的O型口蹄疫病毒中4个亚型的基因工程多肽疫苗及其制备方法和用途。本发明的O型口蹄疫病毒中4个亚型的基因工程多肽疫苗，由1个基因工程菌生产制备，口蹄疫病毒外壳蛋白有四种，即VP1、VP2、VP3、VP4，该基因工程菌是O型口蹄疫目前常见的4个亚型，分别是：Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1；India 2004，GenBank：AY593828.1；China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2；Akesu 2007，GenBank：AF511039.1，取VP4的T-细胞helper15个氨基酸的片段的DNA序列及4种亚型VP1 B细胞决定簇的DNA序列串联，克隆，多肽疫苗的核苷酸排列序列SEQ ID为：

GAATTCAGCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACAGCATGAACGGTAGCTGCCGTTACAGCGATAGCAACGTTAGCAAACTGCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGATCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTTACAAAAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGg

GATCTAACGGTAACTGCAAATACGCGGATGGTCCGGTTGCGAACGTTCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTGCGCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGTTAAACAGCTGCTGg

GATCTAACGGTAACTGCAAATACGATGAAAGCCCGGTTACCAACGTTCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTACCCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGTTAAACAGCTGCTGg

GATCTAACGGTAGCTGCCGTTACAGCAACAGCAACGTTAGCAACGTTAGCGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTGCGCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGTAGGTCGAC

本发明的又一目的是提供所述口蹄疫疫苗的构建方法。基因工程菌其中含有串联的基因以大肠杆菌(E.Coli.)中携带的Lac质粒进行表达，得到具有理想的免疫原性的O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗。与抗体进行免疫实验获得很好的效果。因为串联表达获得的是蛋白大分子，产生中和抗体的量明显增加，多肽在体内的半衰期也得到延长。

为提高生物利用率并增强免疫效果，本发明的疫苗还可以含有药学上可以接受的载体、辅料和或免疫佐剂等物质。免疫佐剂是一种可以增强免疫反应的物质，其能够和抗原混合使用，有助于注射物质的沉积或汇集，还能增强抗体反应。

本发明的又一目的是提供所述口蹄疫疫苗的构建方法。基因工程菌其中含有串联的基因以大肠杆菌(E.Coli)中携带的Lac质粒进行表达，得到具有理想的免疫原性的O型口蹄疫病毒中4个亚型的基因工程多肽疫苗。与抗体进行免疫实验获得很好的效果。因为串联表达获得的是蛋白大分子，产生中和抗体的量明显增加，疫苗在体内的半衰期也得到延长。

本发明的又一目的是提供能够表达所述口蹄疫多肽疫苗的一种基因工程菌株。以及提供所述口蹄疫多肽疫苗在防治O型口蹄疫疾病中的用途，用本发明的多肽制备成疫苗，可防治O型口蹄疫的4个亚型(Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1；India 2004，GenBank：AY593828.1；China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2；Akesu 2007，GenBank：AF511039.1)。

本发明还提供了O型口蹄疫病毒中4个亚型的基因工程多肽疫苗制备方法，包括将基因工程菌的SEQ ID所示的核酸序列克隆入载体并在表达系统中进行表达的步骤，经高密度发酵，细胞破碎、包涵体复性，融合蛋白的分离纯化，冻干后即可获得抗原蛋白产品，与佐剂匀浆形成多肽疫苗。

使用本发明的疫苗具有以下优点：

1)安全性好，本发明是基因工程产品，不是灭活疫苗，不存在因痕量活病毒泄露而引起疾病爆发的危险。在实验动物中，以较高剂量的疫苗对小鼠进行皮下注射，在较长的观测期内，实验动物健康存活。

2)本发明的疫苗适用于基因工程的方法大规模生产，降低了成本。

3)本发明的疫苗生产制备的安全性高，污染少，没有泄露的危险。

4)本发明的疫苗含有O型口蹄疫病毒4种亚型VP1免疫决定簇，可以在我国广大地区适用。

5)本发明的疫苗含有VP4的T-Helper多肽，大大增强了中和抗体的作用，多肽的分子量大，在体内的半衰期延长，其产生中和抗体的时间也大大延长，免疫后抗病毒效果好。

6)贮藏运输保存无需冷链，降低成本。

附图说明

图1O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗基因工程菌的表达载体中的单链DNA结构SEQ ID；

图2是质粒的构建过程示意图，图示如何将基因片段插入质粒的过程；

图3是4个基因片段的DNA序列；

图4是O型口蹄疫病4个亚型的多肽疫苗基因工程菌(E.Coli)在发酵过程中的生长图谱(12hr，发酵罐：瑞士比欧，100L)。

4个DNA片段分别是片段1：VP4T helper-VPI(Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1)；片段2：VP1(India 2004，GenBank：AY593828.1)；片段3：VP1(China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2)；片段4：VP1(Akesu 2007，GenBank：AF511039.1)。

具体实施方式

实施例一：

本发明一方面提供了新型的O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗，含有SEQ ID所示的核酸序列所编码的多肽。SEQ ID含有VP4的T-细胞helper15个氨基酸片段的DNA序列及4种亚型VP1蛋白中有免疫原性的免疫决定簇区域的DNA序列串联【VP4T helper-VPI(Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1)-VP1(India 2004，GenBank：AY593828.1)-VP1(China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2)-VP1(Akesu 2007，GenBank：AF511039.1)】，克隆，其表达产物可以刺激产生抗O型口蹄疫病毒4个亚型的抗体。参见图1、图2和图3。

可作为免疫佐剂的物质有：1)微生物及其产物，如分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖，自分枝杆菌的提取物胞壁酰二肽等。2)多聚核苷酸，如多聚肌苷酸、多聚腺苷酸、多聚左旋谷氨酸等。3)福氏佐剂(Freund′s adiuvant)，包括不完全福氏佐剂(将抗原水溶液与油剂(石蜡油或植物油)等量混合，再加乳化剂(羊毛脂或吐温80)制成的油包水抗原乳剂)和完全福氏佐剂(在不完全佐剂中加入分枝杆菌如卡介苗)。4)Seppic MONTANIDE ISA 50V2。5)无机物，如明矾及氢氧化铝等。

近年来，发现以下物质也可作为免疫佐剂，包括：1)细菌毒素，如霍乱毒素(CT)和大肠杆菌热不稳定毒素(LT)。2)CT和LT的减毒衍生物或变异体。3)人内生性免疫调节因子，如IL-2、IL-12、GM-GSF。4)激素。5)脂肽。6)皂角苷，皂角苷衍生物QS-21。7)含有CpG motif的合成的寡核苷酸片段(CpG ODN)。8)类脂A的衍生物，如脂多糖衍生物单磷酰脂A(MPL)。9)胞壁酰二肽(MDP)的衍生物。10)γ-多聚谷氨酸ploy-γ-glutamic acid。

此外，某些具有内在的免疫刺激活性的递送系统也可作为免疫佐剂用于疫苗构建，这些递送系统包括但不限于：脂质体、乳剂、螺状体(cochleate)、病毒颗粒、微粒子和免疫刺激复合物(ISCOMs)。

上述各种类型的免疫佐剂均可用于本发明。佐剂可以以合适的剂量与本发明具有免疫原性的多肽配合使用，形成本发明的疫苗。

优选的，本发明的疫苗含有Seppic MONTANIDE ISA 50V2或不完全福氏佐剂，不完全福氏佐剂中羊毛脂和石蜡油的比率随季节的变化略有不同，如，春、夏、秋季羊毛脂和石蜡油的比率约为3∶7，冬季二者的比率约为1.5∶8.5。更优选的，本发明的疫苗含有Seppic MONTANIDE ISA 50V2作为免疫增强剂。

本发明又一方面提供了一种制备所述的基因工程疫苗的方法，包括将SEQ ID所示的核苷酸序列，可以直接合成，也可先合成若干个DNA片段，退火连接后产生如SEQ ID所示的DNA序列。为了后续操作的方便，在设计DNA片段时，可以将合适的酶切位点引入序列两端，以便将靶序列克隆入合适的载体。

在本发明的一个优选实施方案中，为合成基因工程菌的载体，设计合成口蹄疫病毒毒株合成编码VP4的T-细胞helper15个氨基酸的片段的DNA序列及4种亚型VP1蛋白中有免疫原性的免疫决定簇区域的DNA序列串联【VP4T helper-VPI(Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1)-VP1(India 2004，GenBank：AY593828.1)-VP1(China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2)-VP1(Akesu 2007，GenBank：AF511039.1)】，由4个DNA片段(片段1：VP4T helper-VPI(Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1)；片段2：VP1(India 2004，GenBank：AY593828.1)；片段3：VP1(China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2)；片段4：VP1(Akesu 2007，GenBank：AF511039.1)4个基因片段DNA序列参见图3)，退火后连接产生含有SEQ ID所示的核酸序列和合适的限制性内切酶切点。利用基因工程的方法将SEQ ID克隆到载体，在合适的表达系统中进行表达后，得到多肽。

在本发明的制备方法中，用于多肽表达的表达系统可以是原核表达系统，还可以是真核表达系统。表达系统包括合适的宿主细胞，以及能够在宿主细胞中复制并稳定存在的质粒或载体。

可以作为宿主细胞的例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链球菌、鼠伤寒沙门氏菌等；真核细胞，如酵母等。更优选的是原核表达系统的大肠杆菌(E.Coli.)作为基因工程菌。

可以使用的载体可以包括染色体来源的、非染色体来源的及合成的DNA序列。如：噬菌体DNA、杆状病毒、细菌质粒、酵母质粒以及由质粒、噬菌体和病毒DNA组合衍生的载体。

优选的，在原核表达系统中表达本发明的多肽。更优选的，可以将本发明的多肽克隆入高效率的表达载体(如市售的表达载体)与载体蛋白进行融合表达。

本发明还涉及一种基因工程菌株，其携带的质粒含有SEQ ID所示的核酸序列。含Lac载体的O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗基因工程菌(E.Coli.)在发酵过程中的生长图谱(12hr，发酵罐：瑞士比欧，100L)参见图4。

本发明还提供了所述的O型4个亚型的多肽疫苗在预防和治疗口蹄疫中的用途。可以将本发明的疫苗注射给动物，刺激动物体内产生特异性的抗O型口蹄疫病毒4个亚型的抗体。

经实验，表1是动物体抗原抗体反应的测定结果，抗体为O型及A型口蹄疫标准血清及O型口蹄疫治疗后牛血清均由上海市农科院畜牧兽医研究所提供，抗原为制备的O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗。

表1：抗原抗体反应

实施例二：

1：构建表达质粒

基因工程菌是含O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗的基因的大肠杆菌。

为合成基因工程菌的载体，本实施例根据O型口蹄疫病毒毒株合成编码VP4的T-细胞helper15个氨基酸的片段的DNA序列及4种亚型VP1蛋白中有免疫原性的免疫决定簇区域的DNA序列串联【VP4T helper-VPI(Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1)-VP1(India 2004，GenBank：AY593828.1)-VP1(China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2)-VP1(Akesu 2007，GenBank：AF511039.1)】，由4个DNA片段退火后连接产生，4个DNA片段分别是(片段1：VP4T helper-VPI(Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1)；片段2：VP1(India 2004，GenBank：AY593828.1)；片段3：VP1(China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2)；片段4：VP1(Akesu 2007，GenBank：AF511039.1)。每个片段含有图1所示的核酸序列和合适的限制性内切酶切点。利用基因工程的方法将4个片段克隆到Lac启动子表达质粒，克隆的方法见图2。4个片段见图3，克隆后DNA单链全序列见图1。

2：基因工程菌的目的基因在表达载质粒体pkk223-3中的克隆

质粒pkk223-3经过限制性内切酶EcoR I/Bgl II/BamH I/Sal I酶切之后，将基因按图3方法分别克隆到pkk223-3质粒中，得到表达质粒。将表达质粒转入大肠杆菌E.Coli.，在37℃培养，以终浓度为0.2-0.5mmol/L的IPTG进行诱导。

3：发酵

250ml种子培养液(1000ml种子培养液含有蛋白胨10g，酵母抽提物5g，0.02mol/L的磷酸缓冲液20ml，pH7.0)置于1000ml三角烧瓶中，120℃灭菌20分钟，冷却后加入20％的葡萄糖溶液5ml。将1ml低温保存于甘油中的菌株加入上述溶液，加氨苄西林(Ampicillin)使其最后浓度为50μg/ml，37℃，摇床培养12-14小时(150rpm)作为扩大培养的种子菌。

1000ml种子培养液含有蛋白胨20g，酵母抽提物10g，0.2mol/L的磷酸缓冲液20ml，pH7.0，120℃灭菌20分钟，冷却至37℃后加氨苄西林(Ampicillin)使其最后浓度为50μg/ml。加入种子培养液20ml，再加入20％的葡萄糖溶液5ml，及微量元素CaCl₂、NiNO₃、CoCl₃、MgSO₄、FeCl₃各1mg，维持所列条件进行发酵(发酵罐：100L；温度：37℃；搅拌速度：700rpm；通气量：80L/min；pH7.0-7.5)。间隔一定时间各取1ml发酵液置于2个塑料离心管中，8000rpm离心10min，除去上清液，称取菌体重量为湿重(g/L)。如图3所示，在发酵8-12个小时后，细菌浓度达到峰值。

发酵后，4000rpm离心30min收集菌体。

菌体以1000g/3L的比例悬浮于含1％的氯化钠、1mmol/L的EDTA、20mmol/L的磷酸钾pH7.0的溶液中，在悬浮液中加入1g溶菌酶，室温搅拌1小时，以破碎细胞，菌体悬浮液于10000rpm离心30min，弃上清。

将上述沉淀以250g/L的比例加入8mol/L的尿素溶液。搅拌、抽提过夜，20000rpm离心30min，取上清，复性后有沉淀产生，以10000rpm离心30min，取沉淀，融合蛋白的分离纯化，冻干即可获得产品，用无菌水溶解多肽，制成2M尿素溶液，与Seppic MONTANIDE ISA 50V2匀浆后，形成多肽疫苗。

4：FMDV疫苗的检测

(1)、试剂

O型及A型口蹄疫标准血清抗体均由上海市农科院畜牧兽医研究所提供。

(2)、样品

含pkk223-3/O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗的基因工程菌株经发酵后，离心收集菌体，破碎细胞，用8M尿素抽提，离心后收集沉淀各取1mg，上清各取1ml。沉淀1mg加1ml的2M尿素溶液备用，在溶液中各自加入O型及A型口蹄疫标准血清，摇匀，加入O型口蹄疫标准血清产生沉淀反应，溶液混浊；加入A型口蹄疫标准血清不产生沉淀反应，溶液清澈。在上清溶液各自加入O型及A型口蹄疫标准血清，摇匀，均无沉淀反应，溶液清澈。

结果：表达的融合蛋白与O型口蹄疫标准血清产生抗原抗体反应，而上清液中不含融合蛋白，故对O型口蹄疫标准血清不发生反应。

5：FMDV疫苗的抗原抗体反应

利用蛋白质在溶液中，抗原抗体可以反应产生沉淀进行本发明疫苗免疫源性的测定。

(1)抗原：测试品为本发明基因工程菌菌株表达纯化后得到的蛋白的2M尿素溶液。

(2)抗体：O型及A型口蹄疫标准血清抗体均由上海市农科院畜牧兽医研究所提供。

(3)抗原抗体反应：O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗中分别加入O型口蹄疫抗体及A型口蹄疫抗体，根据表1的结果，表明O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗与O型抗体有免疫沉淀反应，与A型抗体无免疫反应。

6：疫苗的安全性实验(小鼠实验)

雄性昆明/8W小鼠20只，每只体重20g左右，购自中科院上海动物中心。分为两组，一组为O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗，另一组为对照组。

治疗组取1mg纯化的O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗抗原蛋白用1ml无菌水悬浮，对照组注射1ml生理盐水。对小鼠进行腹腔注射进行观察1周。所有小鼠均存活，证明O型口蹄疫病毒4个亚型的多肽疫苗是一个安全的药物。存活率见下表。

表2：安全性实验

	存活率
		O型口蹄疫病毒4个亚型基因工程多肽疫苗	10/10
对照组	10/10

Claims

1.一种O型口蹄疫病毒中4个亚型的基因工程多肽疫苗，由1个基因工程菌生产制备，口蹄疫病毒外壳蛋白有四种，即VP1、VP2、VP3、VP4，该基因工程菌选择O型口蹄疫病毒常见的4个亚型，分别是：Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1；India 2004，GenBank：AY593828.1；China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2；Akesu 2007，GenBank：AF511039.1，取又VP4的T-细胞helper15个氨基酸的片段的DNA序列及4种亚型VP1 B细胞决定簇的DNA序列串联，克隆，多肽疫苗的核苷酸排列序列SEQ ID为：

GAATTCAGCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACAGCATGAACGGTAGCTGCCGTTACAGCGATAGCAACGTTAGCAAACTGCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGATCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTTACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGg

GATCTAACGGTAGCTGCCGTTACAGCAACAGCAACGTTAGCAACGTTAGCGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTGCGCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGTAGGTCGAC。

2.如权利要求1所述的4个亚型的基因工程多肽疫苗，其中：基因工程菌含有串联的基因以大肠杆菌中携带的Lac质粒进行表达。

3.如权利要求1所述的4个亚型的基因工程多肽疫苗，其中：所述的疫苗还包括药学上可接受的载体、辅料和/或免疫佐剂。

4.如权利要求3所述的4个亚型的基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐剂是福氏不完全佐剂。

5.如权利要求3所述的4个亚型的基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐剂是Seppic MONTANIDE ISA 50V2。

6.权利要求1所述的4个亚型的基因工程多肽疫苗，其用途为：预防和治疗O型口蹄疫的4个亚型：Wuhan 2006，GenBank：DQ478936.1；India 2004，GenBank：AY593828.1；China/1/99Tibet，GenBank：AF506822.2；Akesu 2007，GenBank：AF511039.1。