CN102335421A

CN102335421A - 一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统及其应用

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Publication number: CN102335421A
Application number: CN2011102206768A
Authority: CN
Inventors: 华子春; 陈果
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2011-08-03
Filing date: 2011-08-03
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2031-08-03
Also published as: CN102335421B

Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，该口服疫苗递呈系统含有受抗原递呈细胞胞内微环境诱导的启动子控制的、细菌分泌信号引导分泌的抗原表达载体，以减毒沙门氏菌作为该抗原表达载体的宿主，含有该抗原表达载体的减毒沙门氏菌可以通过口服途径递送达到疫苗递呈的目的和免疫保护的效果。本发明还涉及利用该减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统进行异质免疫加强策略。利用该减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统可以制备口服疫苗，用于疾病的防治。

Description

一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统及其应用

技术领域

本发明属生物技术领域。具体涉及一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统及其应用。

背景技术

口服抗原递呈系统因其具有接种简单，价格便宜的优点，被广泛地应用于多种感染性疾病疫苗开发。目前已经过临床试验的口服疫苗包括：霍乱疫苗（Arakawa T等，1998，Nat Biotechnol 16: 292-297）、脊髓灰质炎疫苗（Huang QS等，2005，Lancet 366:394-396）、伤寒疫苗（Levine MM等，2007，Clin Infect Dis 45 Suppl 1: S24-28）等。目前，用于口服疫苗抗原的投递载体包括脂质体（Minato S等，2003，J Control Release 89: 189-197），细菌芽孢（Cutting SM等，2009，Int Rev Immunol 28: 487-505.）、可生物降解的大分子颗粒（Yeh MK等，2002，J Control Release 82: 237-247），减毒细菌（Huang JM等，2003，Vaccine 28: 7523-7528）等。其中，减毒沙门氏菌是应用的最为广泛的细菌口服疫苗载体，它是一种天然的粘膜免疫佐剂、抗原表达和投递工具，通过基因工程改造的重组疫苗株可以将外源抗原分子或DNA运送给巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞，并通过组织相容性复合体MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ途径递呈给T细胞,并激发机体产生针对抗原分子的细胞、体液以及粘膜免疫应答。

与其它口服疫苗载体相比，以减毒沙门氏菌做为疫苗抗原载体具有以下独特的优点：1）能够使抗原分子主要经过胞内途径递呈给MHC-Ⅰ分子，而使机体产生针对抗原的一型（Type-1）细胞免疫反应：这一特点很好地解决了直接接种重组蛋白而不能较好地激起细胞免疫反应，从而使疫苗保护性效果不佳的难题；2）无法比拟的低成本特性：细菌本身就是抗原分子的生产工厂与输送工具，而细菌的培养与扩增条件简单并易于控制。与其它方式的抗原疫苗形式相比，大大地减少了重组抗原的生产、修饰、加工、运输等成本；3）低风险性：口服减毒细菌，被抗原递呈细胞摄取后，在胞内完成抗原的表达与输送后，它们可以较快地被机体清楚，安全可靠，应用价值可观。

但是开发一种高效、应用性强的口服减毒沙门氏菌疫苗，需要面临以下技术难题：a）重组细菌的表型稳定性。利用减毒细菌作为外源抗原的表达工具，需要建立一种合适的表达策略，以优化抗原表达量与质粒兼容性，因为质粒表达往往存在质粒丢失而引起的表型不稳定的问题；b）抗原分子的分泌问题，因为细菌进入抗原递呈细胞后寄生在一种膜包裹的囊泡结构之中，这种结构在很大程度的限制了抗原分子的有效递呈（Zhang XL等，2008，Cell Mol Immunol. 5(2):91-97）。

学者们尝试不同的分泌信号与抗原分子偶联以实现抗原的分泌，其中最为有效的是Ⅲ型分泌系统。自Russmann H等1998年在Science上首次报道了利用沙门氏菌Ⅲ型分泌系统投递抗原分子可以打破囊泡膜结构对抗原递呈的限制，为减毒沙门氏菌载体的口服疫苗开发提供了一种新的有效的思路以来。学者们利用Ⅲ型分泌系统效应分子如SopE（沙门氏菌外膜蛋白E），YopE（耶尔森氏菌外膜蛋白E）或其分泌信号与抗原分子融合表达，实现了抗原分子的有效递呈，并在治疗性肿瘤疫苗开发中展示了一定的前景（Russmann H等，2003，Adv Exp Med Bio 529:407-413；Nishikawa H等，2006，J Clin Invest116:1946-1954；Zhu X等，2010，Cancer Sci 101:2621-2628）。在以Ⅲ型分泌系统为抗原投递策略的研究中，学者们都是利用组成性表达启动子（PsopE或Plac，）（Nishikawa H等，2006，J Clin Invest116:1946-54；Zhu X等，2010，Cancer Sci 101:2621-2628；Emeka等，2002，Infection and Immunity 7114–7119）来调控抗原分子的表达。然而最近的研究表明组成性表达启动子会造成质粒的丢失，使抗原在体内不能持续表达，而不能有效的激活机体针对抗原分子的免疫反应（Xu等，2010，Infect Immun 78(11) :4828-4838）。

因此，如何实现抗原分子在体内长期、有效的分泌表达？如何设计一套高效，稳定的疫苗载体构建策略，以解决启动子强度、抗原表达量与质粒在体内稳定性之间的矛盾，实现抗原分子在体内持续有效地表达，获得安全、高效的保护性效率？这是以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗开发的关键。发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题和不足，实现抗原分子在体内稳定持续的分泌表达，获得高效的保护性效率，建立一套稳定、安全、高效的以减毒沙门氏菌为载体的诱导型分泌表达口服疫苗抗原投递系统。本发明提供了一种利用抗原递呈细胞胞内环境诱导的减毒沙门氏菌Ⅲ型分泌抗原递呈系统，利用该系统可以递呈病毒抗原、寄生虫抗原、肿瘤抗原等抗原，保证质粒在体内不丢失，实现抗原分子在体内持续，稳定的表达，并获得高效的保护性效率，可以应用于病毒，寄生虫，肿瘤等疾病口服疫苗的开发。

为了达到上述目的，在分析巨噬细胞等抗原递呈细胞胞内微环境的基础上，利用生物信息的方法与分子克隆技术克隆巨噬细胞胞内微环境诱导的启动子，克隆细菌分泌信号；利用胞内诱导型启动子调控细菌分泌信号分泌表达的抗原，从而构建一种高效、稳定的胞内调控的减毒沙门氏菌分泌表达的口服抗原递呈系统。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是一种为抗原递呈细胞胞内乏氧微环境诱导的沙门氏菌Ⅲ型分泌抗原表达系统，包括乏氧启动子和Ⅲ型分泌信号序列，其特点是Ⅲ型分泌信号由乏氧启动子调控表达，分泌信号指导与其相连的抗原分泌。所述的乏氧启动子可以为大肠杆菌亚硝酸盐还原酶启动子（nirB）序列等原核细菌厌氧诱导基因启动子，所述的Ⅲ型分泌信号可以为沙门氏菌外膜蛋白E N端1-104氨基酸序列等原核细菌Ⅲ型分泌效应蛋白及其分泌信号序列。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是含有在抗原递呈细胞胞内表达的不同强度的启动子，包括在胞内低强度诱导型启动子和高强度表达启动子。所述的低强度启动子可以是大肠杆菌亚硝酸盐还原酶启动子；所述的高强度启动子可以是沙门氏菌phoP激活基因C启动子。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是含有细菌分泌表达系统，所述的细菌分泌信号可以是沙门氏菌Ⅲ型等原核细菌分泌效应蛋白及其分泌信号序列。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是含有沙门氏菌Ⅲ型分泌表达系统，所述的Ⅲ型分泌信号可以是沙门氏菌外膜蛋白E N端1-104氨基酸序列等原核细菌Ⅲ型分泌效应蛋白及其分泌信号序列。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统的构建方法，其特征是将不同强度的诱导型启动子和Ⅲ型分泌信号克隆在拷贝表达质粒上，载体上含有用于抗原基因的多克隆位点。所述的低拷贝质粒可以是pQE30。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是的采用相对安全的减毒细菌株作为疫苗载体，所述的减毒细菌株可以是减毒沙门氏菌VNP20009。已有研究报道口服减毒沙门氏菌VNP20009对机体毒性较小。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统的应用方法，其特征是采用异质免疫加强（heterologous prime-boost）接种策略，所述的异质免疫加强策略为：即开始采用口服细菌抗原投递系统，最后采用重组的蛋白抗原或DNA疫苗等进行冲击的接种方法。利用这种免疫策略，可以增加疫苗的抗原性，提高细菌口服疫苗的保护性效率。

进一步地，本发明提供了一种稳定和增强减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统免疫效果的方法，其特征是通过使用中、低水平启动子表达所递呈的抗原。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统在制备口服疫苗的应用，该口服抗原递呈系统可以用于制备病毒、寄生虫、肿瘤等口服疫苗。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统在制备口服血吸虫疫苗的应用。所述的口服疫苗可以是日本血吸虫抗原sj23、GST及其融合蛋白作为递呈抗原。

进一步地，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统在制备口服高效血吸虫疫苗的应用。所述的口服高效血吸虫疫苗可以是利用日本血吸虫抗原sj23与GST的融合蛋白作为递呈抗原。接种该疫苗可以获得51.35%以上的减虫率与62.59%以上的肝脏减卵率。

与现有的以减毒沙门氏菌为载体的疫苗技术相比，本发明的特色和创新之处在于：

（1）发明了一种利用抗原递呈细胞胞内微环境诱导的沙门氏菌三型抗原分泌系统，并以血吸虫抗原为例，在小鼠模型验证了该系统的免疫效果。利用该系统，可以获得以往其它疫苗技术和方法所不能达到的免疫效果：减虫率达到51.35%，肝脏减卵率为62.59%。

（2）发明了一种实现抗原在体内稳定分泌表达的减毒沙门氏菌口服疫苗系统，利用该系统质粒不会丢失，疫苗表型稳定。

（3）以在临床证实安全性的沙门氏菌减毒株做为疫苗载体，发明了一种安全性的口服沙门氏菌重组疫苗株。

（4）发明了一种减毒沙门氏菌口服疫苗的异质免疫加强策略，利用这种异质的免疫策略，可以在很大程度上提高免疫原性，增加效率。

综上所述，本发明建立了一种全新的、以抗原递呈细胞胞内环境来调控抗原表达，同时实现抗原有效分泌，并在体内长时间稳定持续表达的减毒沙门氏菌口服疫苗系统及其应用。

四、附图说明

图1、胞内调控减毒沙门氏菌Ⅲ型分泌表达的抗原递呈系统的构建

（1A）胞内诱导抗原Ⅲ型分泌表达载体的构建示意图。构建了两种系统：1、nirB-胞内乏氧环境诱导的抗原分泌表达系统；2、pagC-一种受镁离子抑制的抗原分泌表达系统。pnirB和ppagC分别为乏氧环境诱导的亚硝酸盐还原酶启动子和低镁离子环境下高表达的强启动子phoP激活的基因C启动子；sopE1-104为沙门氏菌Ⅲ型分泌系统分泌信号；sj23LHDGST为血吸虫双价疫苗抗原。

（1B）Western bolting 验证重组沙门氏菌抗原分子sj23LHDGST（sj23分子的大亲水区与GST融合蛋白）的表达与分泌。培养液上清和细菌裂解分别代表sj23LHDGST的分泌形式和表达总量：1、空载细菌正常培养；2、nirB重组菌正常培养；3、nirB重组菌厌氧培养；4、pagC重组菌在25 mM镁离子条件下培养；5、pagC重组菌正常培养。nirB相对pagC抗原表达强度较弱。

（1C）重组沙门氏菌感染在抗原递呈细胞（小鼠巨噬细胞系RAW264.7）后，将模拟抗原EGFP递呈给巨噬细胞的表达情况，DAPI为细胞核。1、空载菌；2、pagC重组菌；3、nirB重组菌。

图2、重组减毒沙门氏菌疫苗株在体内滴度与持续时间

（2A）BALB/C小鼠口服109菌落形成单位（cfu）重组沙门氏菌和野生菌后3-20天中，重组菌在外周免疫器官脾脏中的滴度。1、野生菌（非转化沙门氏菌），代表总菌数；2、nirB重组菌；3、pagC重组菌。nirB系统持续存在，疫苗质粒没有丢失。

（2B）BALB/C小鼠口服109cfu重组沙门氏菌和野生菌后3-20天中，重组菌在外周免疫器官淋巴结中的滴度。1、野生菌（非转化沙门氏菌），代表总菌数；2、nirB重组菌；3、pagC重组菌。nirB系统持续存在，疫苗质粒没有丢失。

图3、BALB/C小鼠口服接种重组疫苗菌后机体产生的针对抗原分子的免疫反应

（3A）小鼠口服免疫PBS、空载菌和重组疫苗菌（109cfu）三次，间隔两周一次，末次免疫后一周取血清，分子血清中抗sj23LHDGST抗原的IgG抗体效价。1、空载菌；2、nirB重组菌；3、pagC重组菌。

（3B）小鼠口服免疫PBS、空载菌和重组疫苗菌（109cfu）三次，间隔两周一次，末次免疫后一周取脾脏，经过红细胞裂解后，制备脾细胞悬液，然后分别用重组抗原sj23LHD、GST，以及阳性对照ConA刺激72小时，分析脾细胞分泌IFN-γ量。1、PBS；2、空载细菌；3、nirB重组菌；4、pagC重组菌。

（3C）小鼠口服免疫PBS、空载菌和重组疫苗菌（109cfu）三次，间隔两周一次，末次免疫后一周取脾脏，裂解红细胞，分子脾细胞中记忆性淋巴细胞标记物CD44水平。1、PBS；2、空载细菌；3、pagC重组菌；4、nirB重组菌。

图4、小鼠口服免疫重组血吸虫疫苗菌后腹部皮下感染日本血吸虫42天后保护性效率分析

（4A）BALB/C小鼠口服免疫PBS、空载细菌和重组疫苗菌三次，间隔两周一次，末次免疫后一周，腹部皮下感染日本血吸虫尾蚴40只，感染后42天计算小鼠体内成虫数。1、PBS；2、空载细菌；3、pagC重组菌；4、nirB重组菌。

（4B）减虫率=（对照组平均每鼠的成虫数-实验组平均每鼠成虫数）/对照组平均每鼠的成虫数×100%。1、空载细菌；2、nirB重组菌；3、pagC重组菌。

（4C）利用5%KOH消化肝脏过夜的方法，计算肝脏虫卵数。1、PBS；2、空载细菌；3、pagC重组菌；4、nirB重组菌。

（4D）减卵率=（对照组平均每鼠肝脏虫卵数-实验组平均每鼠肝脏虫卵数）/对照组平均每鼠肝脏虫卵数×100%。1、空载细菌；2、nirB重组菌；3、pagC重组菌。

图5、小鼠口服重组血吸虫疫苗菌加重组蛋白抗原冲击免疫策略的保护效率分析

（5A）BALB/C小鼠口服免疫PBS、空载细菌，皮下免疫重组蛋白sj23LHDGST、口服nirB疫苗菌、口服nirB疫苗菌加皮下蛋白冲击一次、口服空载菌加皮下蛋白冲击一次后，进行腹部皮下攻击日本血吸虫尾蚴40只，感染42天计算小鼠体内成虫数。1、PBS；2、空载细菌；3、重组蛋白；4、nirB重组菌；5、nirB重组菌加蛋白冲击；6、空载菌加蛋白冲击；

（5B）利用5%KOH消化肝脏过夜的方法，计算肝脏虫卵数。减虫率=（对照组平均每鼠的成虫数-实验组平均每鼠成虫数）/对照组平均每鼠的成虫数×100%。1、空载细菌；2、重组蛋白；3、nirB重组菌；4、nirB重组菌加蛋白冲击；5、空载菌加蛋白冲击。

（5C）肝脏虫卵数：1、PBS；2、空载细菌；3、重组蛋白；4、nirB重组菌；5、nirB重组菌加蛋白冲击；6、空载菌加蛋白冲击。

（5D）肝脏减卵率=（对照组平均每鼠肝脏虫卵数-实验组平均每鼠肝脏虫卵数）/对照组平均每鼠肝脏虫卵数×100%。1、空载细菌；2、重组蛋白；3、nirB重组菌；4、nirB重组菌加蛋白冲击；5、空载菌加蛋白冲击；

五、具体实施方式：

以日本血吸虫双价抗原sj23LHDGST（sj23分子的大亲水区与GST融合蛋白）做为投递抗原，制备高效的抗血吸虫感染的口服疫苗为实施例：

1、疫苗载体的构建：

采用低拷贝表达质粒pQE30作为表达载体；sj23LHDGST与Ⅲ型分泌系统效应分子sopE N端1-104个氨基酸（sopE1-104）偶联，利用sopE1-104来实现抗原分子的分泌；采用大肠杆菌硝酸盐还原酶（nirB）启动子和沙门氏菌pagC基因（pagC）启动子分别对Ⅲ型分泌抗原进行表达。

nirB与pagC启动子利用PCR方法获得：nirB启动子引物序列为：P1：5’-cccctcgagggttaccggcccgatcg-3’；P2：5’-cccggatccaccgcctaccttaacgattc-3’；pagC启动子引物序列为：P1：5’-cccctcgaggttaaccactcttaataa-3’；P2：5’-cccggatccaacaactccttaatactactt-3’；扩增nirB和pagC分别以50 ng大肠杆菌基因组DNA和沙门氏菌基因组DNA为模板。这时所得到的启动子两端分别带有XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点，PCR程序都为94℃ 40 s,60℃ 40 s，72℃ 1 min，26个循环。

沙门氏菌三型分泌系统分泌信号即sopE蛋白1-104氨基酸序列基因的扩增：引物序列为：P1: 5’-cccggatccatgactaacataacactatc-3’；P2: 5’-aaaggtacccggatctttactcgcat-3’；所得到的sopE1-104基因两端分别带有BamHⅠ和KpnⅠ的酶切位点，PCR程序都为94℃ 40 s,60℃ 40 s，72℃ 1 min，26个循环。

双价疫苗基因sj23LHDGST的获得：采用重叠PCR方法扩增得到sj23LHDGST基因，引物序列为：P1: 5’-aaaggtaccatgtacaaggataaaatcgatg;3’；P2: 5’-taagttgcgttttaagaatgctagtataggggacat-3’；P3: 5’-ttcttaaaacgcaacttaatgtcccctatactaggt-3’；P4：5’-cccaagcttttattttggaggatggtcgc-3’；具有方法如下：先分别以P1和P2，P3和P4为引物以pcDNA3.1-sj23和pcDNA3.1-GST为模板，扩增出sj23LHD片段与GST片段；然后以P1和P4为引物，以扩展的sj23LHD片段与GST片段为模板得到sj23LHDGST双价疫苗基因，所扩增的sj23LHDGST基因两端分别带有KpnⅠ和HindⅢ酶切位点。PCR程序都为94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 1 min， 26个循环。

启动子-分泌信号-抗原基因的连接：表达载体选用pQE30，首先将nirB启动子和pagC启动子分别连入pQE30载体的XhoⅠ和BamHⅠ之间；其次将分泌信号sopE1-104插入BamHⅠ和KpnⅠ位点之间；然后将双价疫苗抗原基因sj23LHDGST基因插入KpnⅠ与HindⅢ位点之间。经过转化、鉴定、测序后得到了nirB-sopE1-104-sj23LHDGST和pagC-sopE1-104-sj23LHDGST两个重组DNA疫苗载体。其中的酶切程序为：20微升反应体系，37℃，3个小时；连接程序为：10微升反应体系，室温，5个小时。

2、重组减毒沙门氏菌的电穿孔转化：

沙门氏菌电转感受态的制备：接种新鲜减毒沙门氏菌到200 ml LB培养基中，37℃摇床培养至OD值在0.4-0.6之间，离心6000g×5 min收集菌体，用无菌双蒸水洗涤菌体一遍，离心6000 g×5 min，用10%甘油的洗涤菌体二遍，离心6000 g×5 min，用500微升10%甘油重悬，分装50微升/管，用于电转。

采用电穿孔方法将重组疫苗DNA载体转化到减毒沙门氏菌VNP20009内：在无菌条件下，将0.5-5 μg 构建好的重组载体（nirB-sopE1-104-sj23LHDGST或pagC-sopE1-104-sj23LHDGST）加入在电转感受态中，混匀后，转移到0.2 μM的电转杯中，用于电击，电转条件为1.8 KV，500 Ω，2 μF，电转后涂氨苄平板筛选，长出的菌落即为重组菌。

3、免疫程序及方法：

重组减毒沙门氏菌血吸虫口服疫苗株的免疫程序：6-8周龄雌性小鼠BALB/C按照每组20只进行分组，每只小鼠口服1×109 cfu细菌剂量接种空载细菌组、重组nirB组、重组pagC组，自然对照组口服0.2 ml PBS。口服免疫三次，间隔两周一次，第三次后一周进行血吸虫感染。

细菌载体-蛋白冲击（抗原异质免疫）策略免疫程序：6-8周龄雌性小鼠BALB/C按照每组20只进行分组，每只小鼠口服1×109 cfu细菌剂量接种空载细菌组、重组nirB组，空载细菌-蛋白冲击组，重组nirB-蛋白冲击组，蛋白免疫组每只皮下免疫50微克/只sj23LHDGST蛋白，免疫三次，间隔两周一次，空载细菌-蛋白冲击组，重组nirB-蛋白冲击组第三次免疫后一周采用皮下免疫50微克蛋白进行冲击，末次免疫后一周进行血吸虫感染。

4、免疫保护作用观察：

末次免疫后一周，每只小鼠经腹部皮肤感染40± 2 条日本血吸虫尾蚴，感染后 6 周剖杀, 用灌注法收集成虫计算虫荷均数；称取肝脏 0.5 g, 加 10 ml5% KOH, 37 ℃消化 5 h 后取 0.1 ml 涂片，在显微镜下计数, 即每克肝组织虫卵数( EPG)，以减虫率和每克肝减卵率评价各组质粒免疫保护力。计算公式如下：减虫率 (%) =[ (对照组虫荷均数- 实验组虫荷均数) /对照组虫荷均数]× 100%；减卵率 (%) =[ (对照组EPG-实验组 EPG) /对照组 EPG]× 100%。

5、免疫细胞激活即CD44分析：

末次免疫后一周取小鼠脾脏，制成单细胞悬液，经过红细胞裂解后，用含5%小牛血清的PBS封闭1小时，然后利用CD44-PE荧光抗体（1%BSA的PBS稀释1：100）在暗处反应1个小时，用1%BSA的PBS洗涤两次后，上机分析。

6、 sj23LHDGST抗体检测：

免疫血清的制备：BALB/C小鼠按照上述的免疫程序接种细菌疫苗，末次免疫后一周，尾静脉采血，室温静置2-4小时后，5000 rpm离心5分钟，收集血清；

sj23LHDGST抗原的包被：利用50 mM，pH9.6的碳酸盐缓冲液按照10 μg/ml稀释抗原，每孔滴加100 μl，4度包被过夜，PBST洗三次（5分钟一次）后用于检测。

ELISA测定抗体滴度：包被板每孔采用200 μl 3%的BSA在37度封闭3个小时，经PBST洗三次（5分钟一次），然后用100 μl PBS将血清梯度稀释（50-400倍）加入孔中，37℃反应1-2个小时，PBST洗三次（5分钟一次），加入HRP（辣根过氧化物酶）偶联的羊抗小鼠IgG二抗，37℃反应1个小时，PBST洗三次（5分钟一次），加入TMB底物显色，2 M浓硫酸终止，测定450 nM吸收光。

7、 IFN-γ检测：

末次免疫一周后，每组取三只小鼠脾脏，无菌条件下制成单细胞悬液，红细胞裂解后用10%胎牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度为2×106/ml，按照每孔100微升加入到96孔板中，分别用10微克/毫升sj23LHD、10微克/毫升GST、10微克/毫升ConA进行刺激72小时，收集细胞培养上清，采用IFN-γ ELISA试剂盒，按照说明书，进行测量IFN-γ含量。

8、重组疫苗菌在体内的滴度检测：

BALB/C小鼠口服109cfu nirB-sopE-sj23LHDGST，pagC-sopE1-104-sj23LHDGST重组菌以及没有转化的野生减毒沙门氏菌，分别在3天、10天、20天取脾脏和肠系膜淋巴结，称重，按照5：1（PBS体积：脏器质量）的比例加入PBS进行匀浆，然后将匀浆液进行梯度稀释，涂于氨苄板，根据长出来的菌落数与脏器质量计算脏器中重组菌的滴度，非转化野生减毒沙门氏菌涂正常没有抗性的LB平板，以此计算总菌数。

本发明实施例采用两种在巨噬细胞胞内高活性启动子调控血吸虫sj23LHD-GST的分泌表达：一种是大肠杆菌硝酸盐还原酶（nirB）启动子（图1A：1），其只能在胞内厌氧的环境中才能被诱导表达；一种是沙门氏菌pagC基因（pagC）启动子（图1A：2），其在胞内低镁离子条件下具有高活性。分泌信号采用Ⅲ型分泌系统效应分子sopE N端1-104个氨基酸(sopE1-104) （图1A）。利用电转化的方法转化减毒沙门氏菌后，得到nirB重组菌、pagC重组菌以及转化空载质粒的空载菌，采用western bloting技术检测各重组菌在各自诱导环境中的表达与分泌情况，结果显示空载菌没有检测到sj23LHD-GST抗原的表达（图1B：1）；含nirB启动子的重组菌在有氧的条件下没有抗原表达（图1B：2），而在无氧条件下在细菌裂解和培养基上清中均能检测到抗原的表达（图1B：3）；pagC重组菌在含有25 mM镁离子条件下没有抗原表达（图1B：4），而在无镁离子条件下能检测到抗原表达（图1B：5）。为了更进一步地证明重组菌在抗原递呈细胞-巨噬细胞里的抗原输送情况，本发明采用EGFP（绿色荧光蛋白）做为模拟抗原，当携带EGFP的各重组菌在体外感染巨噬细胞系RAW264.7后，感染空载菌后，巨噬细胞胞内没有观察到荧光（图1C：1），感染pagC重组菌后可以观察到很强的绿色荧光（图1C：2），而感染nirB重组菌后可以观察到相对较弱的荧光（图1C：3）。以上说明，两种重组菌在巨噬细胞胞内能有效的表达和分泌抗原，其中nirB启动子的活性较pagC启动子弱。

为了评价各重组菌的质粒稳定性，各重组菌和减毒沙门氏空载菌按照1×109cfu/只的剂量口服接种5-7周龄的Balb/C小鼠。在接种后3、10、20天分离外周免疫器官脾脏和淋巴结，计算各重组菌在器官中的滴度。在脾脏中，相对于野生菌（图2A：1），nirB重组菌在各时间点均没有明显减少（图2A：2），但是pagC重组菌在第10天明显下降（图2A：3）；在淋巴结中，相对于野生菌（图2B：1），nirB重组菌在各时间点均没有明显减少（图2B：2），而在各个时间点均没有检测到pagC重组菌（图2B：3）。以上说明nirB重组菌是稳定的，质粒没有丢失，而pagC重组菌不稳定。

本发明进一步评价了各口服各重组疫苗菌后产生的针对抗原分子的免疫反应。小鼠口服免疫PBS、空载菌和重组疫苗菌三次，间隔两周一次，末次免疫后一周取取血清，评价血清中抗sj23LHD-GST的抗体产生。相对于空载菌（图3A：1），nirB重组菌能产生较弱的抗体（图3A：2），而pagC重组菌产生的抗体最强（图3A：3）。本发明还分别用重组sj23LHD，重组GST，以及阳性对照药物ConA刺激免疫小鼠脾细胞，分析脾细胞分泌细胞因子IFN-γ的产生，与PBS免疫（图3B：1）和空载菌（图3B：2）免疫相比，nirB重组菌能产生较高的IFN-γ水平（图3B：3），而pagC重组菌不能产生IFN-γ水平（图3B：4）。此外，为了评价免疫各重组菌对脾细胞中免疫细胞的影响，本发明检测了记忆性淋巴细胞标记物CD44的水平，与PBS免疫（图3C：1）和空载菌（图3C：2）免疫相比，免疫nirB重组菌后，CD44高表达的细胞增加到了24%左右（图3C：4）。

本发明进一步评价了口服各重组菌对血吸虫感染的保护力：小鼠口服免疫PBS、空载菌和重组疫苗菌三次，间隔两周一次，末次免疫后一周腹部皮下感染日本血吸虫尾蚴40只，感染后42天计算小鼠体内成虫数，减虫率，肝脏虫卵数，减卵率。免疫PBS小鼠成虫数为30±3只（图4A：1）和空载菌成虫数为26±3只（图4A：2），pagC重组菌成虫数为22±2只（图4A：3），nirB重组菌成虫数为17±3只（图4A：4）。相对于PBS免疫，空载菌的减虫率为14.98%（图4B：1），nirB重组菌减虫率为41.69%（图4B：2），pagC重组菌减虫率为26.89%（图4B：3）。免疫PBS小鼠肝脏虫卵数为122699±34214（图4C：1），空载菌肝脏虫卵数为100398±21669（图4C：2），pagC重组菌肝脏虫卵数为85805±25299（图4C：3），nirB重组菌肝脏虫卵数为51889±12888（图4C：4）。相对于PBS免疫，空载菌的减卵率为18.17%（图4D：1），pagC重组菌减卵率为30.07%（图4D：3），nirB重组菌减卵率为57.71%（图4D：2）。因此，pagC重组菌和nirB重组菌表现出较好的减虫率和减卵率，产生了明显的免疫保护效果，其中，nirB重组菌的效果更加显著。由此可以看见：尽管pagC启动子的活性强于nirB启动子，产生更高的抗原表达水平，但是pagC重组菌的免疫保护效果却不及nirB重组菌。这个现象与本领域技术人员通常都是追求抗原高表达的策略完全不同，这是本发明的一个显著创新。

为了进一步提高口服重组沙门氏菌疫苗菌的保护力，本发明还采取了细菌-蛋白冲击（抗原异质免疫）策略，小鼠口服1×109 cfu剂量接种空载细菌组、重组nirB组，空载细菌-蛋白冲击组，重组nirB-蛋白冲击组，蛋白免疫组每只皮下免疫50微克/只sj23LHDGST蛋白，免疫三次，间隔两周一次，空载细菌-蛋白冲击组，重组nirB-蛋白冲击组第三次免疫后一周采用皮下免疫50微克蛋白进行冲击，末次免疫后一周感染日本血吸虫尾蚴40只，感染后42天计算小鼠体内成虫数，减虫率，肝脏虫卵数，减卵率。免疫PBS小鼠成虫数为31±2只（图5A：1），免疫空载细菌小鼠成虫数为28±3（图5A：2），免疫重组蛋白小鼠成虫数为24±3只（图5A：3），免疫重组nirB组小鼠成虫数为19±4（图5A：4），免疫nirB-蛋白冲击小鼠成虫数为15±3（图5A：5），免疫空载细菌-蛋白冲击小鼠成虫数为26±3（图5A：6）；相对于PBS免疫，空载菌的减虫率为10.37%（图5B：1），重组蛋白免疫减虫率为21.62%（图5B：2），nirB重组菌减虫率为42.73%（图5B：3），nirB-蛋白冲击减虫率为51.35%（图5B：4），空载细菌-蛋白冲击减虫率为14.59%（图5B：5）；免疫PBS小鼠肝脏虫卵数为122533±22535（图5C：1），空载菌肝脏虫卵数为100797±9131（图5C：2），重组蛋白肝脏虫卵数为83402±11364（图5C：3），nirB重组菌肝脏虫卵数为62205±14557（图5C：4），nirB-蛋白冲击肝脏虫卵数为45842±8810（图5C：5），空载细菌-蛋白冲击肝脏虫卵数为92878±23881（图5C：6）；相对于PBS免疫，空载菌的减卵率为17.74%（图5D：1），重组蛋白免疫减卵率为31.93（图5D：2），nirB重组菌减卵率为53.23%（图5D：3），nirB-蛋白冲击减卵率为62.59%（图5D：4），空载细菌-蛋白冲击减卵率为24.20%（图5D：5）。由此可见，为了进一步提高口服重组沙门氏菌疫苗菌的保护力，本发明采取的细菌-蛋白冲击（抗原异质免疫）策略的免疫保护效果明显好于单独的重组蛋白免疫或者重组菌免疫策略。

综上所述，本发明提供了一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统及其应用，该疫苗递呈系统能在抗原递呈细胞中有效地表达和递呈抗原，并具有较好的体内稳定性。该疫苗递呈系统能激活机体产生针对抗原分子较强的免疫反应，获得良好的保护性效率。该系统可应用于包括病毒、寄生虫、肿瘤在内的多种疾病的口服疫苗的开发。以该系统递呈的血吸虫sj23LHD-GST抗原可以获得有效的抗血吸虫感染的保护力。本发明还提供了一种重组细菌-蛋白冲击（抗原异质免疫）策略，利用该策略可以提高重组菌保护性效率。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

110> OrganizationName : 南京大学

<120> Title : 一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统及其应用

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SequenceName : 1

SequenceDescription : nirB 启动子

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<213> OrganismName : Escherichia coli

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gcataacacc ctgacctctc attaattgct catgccggac ggcactatcg tcgtccggcc 180

ttttcctctc ttcccccgct acgtgcatct atttctataa acccgctcat tttgtctatt 240

ttttgcacaa acatgaaata tcagacaatt ccgtgactta agaaaattta tacaaatcag 300

caatataccc attaaggagt atataaaggt gaatttgatt tacatcaata agcggggttg 360

ctgaatcgtt aaggtaggcg gt 382

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SequenceName : 2

SequenceDescription :pagC启动子

<212> Type : DNA

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ttatgttgga attgtggtgt tgattctatt cttataatat aacaagaaat gttgtaactg 180

atagatatat taaaagatta aatcggagcg ggaataaagc gtgctaagca tcatcgtgaa 240

tatgattaca gcgcctgcga tggcatataa ccgtattgcg gatggagcgt cacgtgagga 300

ctgtgaagca caatgcgata tgttctgatt atatggcgag tttgcttaat gacatgtttt 360

tagccgaacg gtgtcaagtt tcttaatgtg gttgtgagat tttctcttta aatatcaaaa 420

tgttgcatgg gtgatttgtt gttctatagt ggctaaacac tttatggttt ctgttaaata 480

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gagttgtt 728

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SequenceName : 3

SequenceDescription :sopE1-104

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agtaaagatc cg 312

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<213> OrganismName : Schistosoma japonicum

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gtttatgttc agggttgtct atctgtcttt agtgcattct taaaacgcaa cttaatgtcc 240

cctatactag gttattggaa aattaagggc cttgtgcaac ccactcgact tcttttggaa 300

tatcttgaag aaaaatatga agagcatttg tatgagcgcg atgaaggtga taaatggcga 360

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gttaaattaa cacagtctat ggccatcata cgttatatag ctgacaagca caacatgttg 480

ggtggttgtc caaaagagcg tgcagagatt tcaatgcttg aaggagcggt tttggatatt 540

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SequenceDescription : sopE1-104 P2

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SequenceName : 11

SequenceDescription : sj23LHDGST P1

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SequenceDescription : sj23LHDGST P2

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<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

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SequenceDescription : sj23LHDGST P4

<212> Type : DNA

<213> OrganismName : Artificial

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cccaagcttt tattttggag gatggtcgc

Claims

1.一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是由抗原递呈细胞胞内微环境诱导的启动子控制的、细菌分泌信号引导分泌的、通过口服途径递送的重组减毒沙门氏菌疫苗递呈系统。

2.根据权利要求1所述的一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是所表达和递呈的抗原在不同强度的启动子操纵下，包括低强度启动子和高强度表达启动子，所述的低强度启动子是大肠杆菌亚硝酸盐还原酶启动子；所述的高强度启动子之一是沙门氏菌phoP激活基因C启动子。

3.根据权利要求2所述的一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是所表达和递呈的抗原在抗原递呈细胞内乏氧微环境诱导的启动子操纵下，所述的乏氧启动子之一为大肠杆菌亚硝酸盐还原酶启动子。

4.根据权利要求1所述的一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是所表达和递呈的抗原在细菌分泌信号的引导下，所述的细菌分泌信号之一是沙门氏菌Ⅲ型分泌信号等原核细菌分泌效应蛋白及其分泌信号序列。

5.根据权利要求4所述的一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统，其特征是所表达和递呈的抗原在沙门氏菌Ⅲ型分泌信号的引导下，所述的沙门氏菌Ⅲ型分泌信号之一是沙门氏菌外膜蛋白E N端1-104氨基酸序列原核细菌Ⅲ型分泌效应蛋白及其分泌信号序列。

6.根据权利要求1所述的一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统的构建方法，其特征是将不同强度的诱导型启动子和分泌信号克隆在低拷贝表达质粒上，载体上含有用于抗原基因的多克隆位点，所述的低拷贝质粒是pQE30。

7.根据权利要求1所述的一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统的构建方法，其特征是采用相对安全的减毒细菌株作为递送载体，所述的减毒细菌株之一是减毒沙门氏菌VNP20009。

8.根据权利要求1所述的一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统的应用方法，其特征是采用重组疫苗递呈细菌口服方法进行抗原投递。

9.根据权利要求1所述的一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统的应用方法，其特征是采用异质免疫加强接种策略进行免疫，所述的异质免疫加强策略为：先采用口服疫苗递呈细菌进行抗原投递系统，最后再采用重组的蛋白抗原或DNA疫苗进行冲击的接种方法，利用这种免疫策略，增加疫苗的抗原性，提高细菌口服疫苗的保护性效率。

10.权利要求1所述的一种减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统在制备口服疫苗或制备血吸虫口服疫苗中的应用。

11.一种稳定和增强减毒沙门氏菌诱导型分泌表达口服疫苗递呈系统免疫效果的方法，其特征是通过使用中、低水平启动子表达所递呈的抗原。