CN105483149A - 广谱型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种广谱型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法，利用禽流感NP和M1的抗原保守性以及乳杆菌作为抗原递呈载体的安全性，应用重组DNA技术构建了表达禽流感<i>NP</i>和<i>M1</i>基因的重组表达载体pW425et-<i>NP-M1</i>，转染至乳酸杆菌中，该重组乳酸菌可稳定表达NP-M1融合蛋白，通过口服的方式进入消化道定植后，能有效地诱导机体产生特异性细胞免疫反应和分泌特异性sIgA抗体。使用相同亚型禽流感病毒mH9N2和不同亚型流感病毒H1N1进行攻毒保护实验，与禽流感灭活疫苗相比，重组乳酸杆菌可显著提高小鼠脾脏和淋巴结中分泌IFN-γ的T细胞数量、肠内容物中sIgA含量。本发明的制备方法和生产工艺简便、安全，利于规模化生产，具有广阔的应用前景和有望产生良好的经济社会效益。

Description

广谱型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及融合基因NP-M1，一种广谱型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法。
背景技术
禽流感是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种非常重要的传染病。它不仅能对养禽业造成严重的经济损失，而且也严重威胁着人类的健康。目前为止，疫苗是控制抗禽流感最为有效的手段。
禽流感主要通过黏膜途径感染机体，所以黏膜免疫系统在控制禽流感感染方面起着关键性作用。另外，由于系统性疫苗在黏膜处不能诱导良好的保护性免疫反应，与胃肠道外接种疫苗相比，黏膜疫苗能够产生有效的黏膜免疫和系统免疫反应，为避免反复暴露于特定的病原体而提供保护，防止机体造成组织损伤或过度的炎症反应。但最近主要集中于发挥体液免疫疫苗的研究，而病毒发生变异时，体液免疫不能产生交叉保护反应。所以靶向保守的内部抗原蛋白是构建疫苗的候选抗原。原因如下，与病毒的表面蛋白相比，其保守的内部抗原蛋白更加不会产生变异，例如表面蛋白血凝素和神经氨酸酶很容易发生变异，造成疫苗株必须不断更新以匹配流行株；其次，在不同的流感病毒亚型之间内部蛋白高度保守。 禽流感病毒的核蛋白（nucleo-protein，NP）和基质蛋白（matrix protein，M1）是最具典型和吸引力的内部保守蛋白。Berthoud 等的研究表明MVA表达AIV的保守内部抗原（NP和M1）能产生交叉T细胞反应对抗异源流感的感染。另外，临床研究已经证明，利用腺病毒载体表达的AIVs NP能够诱导NP特异性T细胞免疫反应，且能抵抗异源AIVs感染。
乳酸菌(Lactobacillus)是可发酵碳水化合物生成大量乳酸的一类细菌的总称。由于在人或动物体内长期定植，并且对机体产生益生作用，在国际上将他们认为是食品级安全微生物。因具有容易培养、操作方便、安全无毒等诸多优势，在基因工程疫苗领域乳酸菌是一种表达异源蛋白或作为活载体递呈抗原的重要工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合基因NP-M1和一种重组乳酸菌。
一种融合基因NP-M1，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
一种融合基因NP-M1质粒，是在表达载体pW425et上插入了融合基因NP-M1，命名为pW425et- NP-M1。
一种重组乳酸菌，是转化了一种融合基因NP-M1质粒pW425et-NP-M1的乳酸杆菌。
所述的乳酸杆菌为植物乳酸杆菌。
所述的乳酸菌为Lb.plantarum NC8。
广谱型抗禽流感的重组乳酸菌的制备方法，它主要包括：
（1）人工合成其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示的融合基因NP-M1；
（2）将融合基因NP-M1插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pW425et中，构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达重组质粒pW425et-NP-M1；
（3）将重组质粒pW425et- NP-M1转化至乳酸杆菌中。
本发明另一目的是一种重组乳酸菌在制备抗禽流感药物的应用。
一种重组乳酸菌在制备抗禽流感药物的应用。
所述的禽流感为H9N2亚型和\或H1N1亚型。
本发明提供了一种广谱型抗禽流感重组乳酸菌，它是利用禽流感病毒核蛋白NP和基质蛋白M1的高度保守性以及乳酸菌作为抗原递呈载体的安全性，利用重组DNA技术构建了表达NP基因和M1基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭重组质粒pW425et-NP-M1，将重组质粒转化至乳酸杆菌中，获得了抗多种亚型禽流感病毒的重组乳酸杆菌，经过大量增菌培养后，该重组乳酸菌通过口服的方式进入消化道定植后，表达的NP-M1融合蛋白在小鼠肠道被抗原递呈细胞识别，有效地诱导机体产生特异性IFN-γ和sIgA，有效预防不同亚型流感病毒的感染。首次免疫连续灌胃小鼠3次，间隔2周后，加强免疫，连续灌服小鼠3次，间隔2周后，分别感染不同亚型流感病毒1次，观察保护效果。结果显示，与禽流感灭活疫苗相比，重组乳酸杆菌可显著提高小鼠脾脏和淋巴结中分泌IFN-γ的T细胞数量、肠内容物中sIgA含量。本发明制备了广谱型抗禽流感的重组乳酸杆菌，制备方法和生产工艺相对简单，使用方式为饮水口服，便于规模化生产和应用，具有广阔的应用前景和良好的经济社会效益。
附图说明
图1 pMD18-T-NP-M1酶切鉴定电泳结果；
图2 pW425et-NP-M1酶切鉴定电泳结果；
图3重组乳酸杆菌表达NP-M1融合蛋白检测结果：Western-blot结果；
图4 ELISPOT检测MLN中T细胞产生的IFN-γ；
图5 ELISPOT检测脾脏中T细胞产生的IFN-γ；
图6 小鼠肠内容物中特异性sIgA含量变化；
图7 小鼠感染H9N2亚型禽流感病毒的存活率；
图8 小鼠肺内H9N2亚型禽流感病毒滴度；
图9 小鼠感染H1N1亚型流感病毒的存活率；
图10 小鼠肺内H1N1亚型禽流感病毒滴度。
具体实施方式
实施例 1 融合基因 NP-M1 的获得
以Genbank 公布的NP和M1基因序列（GI:DQ681212.1和JF906209.1）为模板，根据密码子的简并性和乳酸菌表达蛋白对密码子的偏爱性，优化密码子后送往上海捷瑞生物工程有限公司合成，且上下游加入NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位点。人工合成后的融合基因NP-M1连接在pMD18-T 载体上，即pMD18-T-NP-M1，采用常规酶切技术，应用限制性内切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD18-T-NP-M1，获得了大小为2253 bp 目的融合基因NP-M1，酶切体系如下所述。其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
反应条件：37℃水浴1 h。结束后，经1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测显示，成功获得了融合基因NP-M1，如图1所示。
实施例 2 重组质粒 pW425et-NP-M1 的构建
采用NdeⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶分别对pMD18-T-NP-M1和pW425et进行双酶切，以获得融合基因NP-M1和pW425et表达载体片段；双酶切体系和反应条件同实施例1中所述。试剂盒回收目的基因后，采用T4 DNA连接酶进行连接。
连接体系如下：
反应条件：16℃连接2h，4℃过夜；次日常规CaCl2法转化E.coli DH5α感受态，并筛选重组阳性菌。
质粒小量提取方法按照质粒小提试剂盒说明书操作提取，对质粒进行酶切鉴定，结果表明成功构建了重组质粒pW425et-NP-M1，如图2所示。
实施例 3 广谱型抗禽流感的重组乳酸菌的制备及表达产物检测
（1）乳酸杆菌感受态细胞制备及转化
活化Lb.plantarum NC8菌种，将其单个菌落接种到含1 %甘氨酸的MRS液体培养基（不含葡萄糖）中，30 ℃条件下厌氧培养至OD600值为约0.6时，以2%的接种量接种到MRS液体培养基中（含有1%甘氨酸），当厌氧培养到OD600值约为0.3时，4 ℃条件下4500 r/min离心5 min收集菌体（除了离心步骤以外，制备感受态过程中Lb.plantarum NC8一直放在冰水混合物中）。使用预冷的电转化缓冲液悬浮洗涤2次后，将Lb.plantarum NC8悬浮于适量电击缓冲液中，冰浴10 min，分装。Lb.plantarum NC8的感受态即可用于电转化。
分别取1-2 μg的重组质粒pW425et-NP-M1（体积约10 μL）与已经制备的150 μL冰冷的Lb.plantarum NC8受体菌细胞悬液混合，转入已经预冷的间距0.2 cm是电击杯中，冰浴10 min后用电转仪电击，条件为2000 V，400 Ω，25 µF。电击结束后，将电击杯静止冰浴5 min。将电转化后的混合液转移到离心管中，随后加入600 μL MRS液体培养基，在30 ℃条件下厌氧培养2 h。取120 μL电转化后的菌液，涂在MRS琼脂平板（含10 μg/mL红霉素）上，在30 ℃条件下厌氧培养18 h以上，直到能观察到单菌落为止，筛选阳性克隆子。
（2）重组乳酸杆菌中表达载体的鉴定
试剂盒提取阳性重组菌质粒，按照实施例2 中所述，对质粒进行酶切鉴定，结果表明成功制备了携带重组质粒pW425et-NP-M1的重组乳酸杆菌pW425et-NP-M1/NC8。
（3）重组乳酸杆菌pW425et-NP-M1 / NC8表达产物的鉴定
将重组乳酸菌pW425et-NP-M1/NC8接到含红霉素的MRS液体培养基中，30℃，厌氧条件下培养约12 h，按照1 %体积接于新鲜的含红霉素的MRS液体培养基中，30℃，厌氧条件下培养，厌氧条件下培养8 h停止，离心收集重组乳酸菌菌体，重组乳酸菌用PBS洗涤两次，最后悬在适量PBS中，取50 µL菌悬液加上50 µL 2×SDS上样缓冲液和5 µL DTT煮沸10 min，-20℃保存用于SDS-PAGE和Western blotting检测；Western-blot 中所用的一抗是鼠抗禽流感NP单克隆抗体（使用PBST按1：500稀释）、二抗是HRP 标记的羊抗鼠IgG（使用封闭液按1：1500稀释），结果表明重组乳酸杆菌可稳定表达大小为83 kD 的NP-M1融合肽，如图3所示。
实施例 4 重组乳酸菌抗禽流感功能检测
（1）动物分组及处理
将雌性C57BL/6小鼠随机分为四组，分别依次接种PBS溶液、重组乳酸菌空载体pW425et /NC8、pW425et-NP-M1/NC8和接种禽流感H9N2 AIV灭活苗，每组15只，标记为A组、B组、C组和D组（见表1）。将培养好的重组乳酸菌经PBS 洗涤3 次后，使用PBS 重悬菌体沉淀，调整每组小鼠灌胃的菌液浓度。C组每只小鼠每天胃内接种pW425et-NP-M1/NC8 5×108 cfu，连续接种3天（每天一次），间隔2周后，加强免疫，连续灌服小鼠3次；按照同样的方案灌胃A、B组；D组在第1 周肌肉注射免疫禽流感H9N2 AIV灭活苗。
加强免疫2周后，分别鼻内接种不同亚型流感病毒1次，对感染病毒后的小鼠每日监测体重和死亡情况。并于攻毒前处死小鼠，检测各项免疫指标。
表1动物分组及免疫剂量
（2）检测指标及主要方法
1）小鼠脾脏和肠系膜淋巴结（MLN）中分泌IFN-γ T细胞的检测
使用IFN-γ-ELISpot方法检测加强免疫后各组小鼠的脾脏和MLN中分泌IFN-γ T细胞的数量，方法按照试剂盒操作说明书操作。其中，用PBS（0.5%FCS）稀释检测抗体（R4-6A2-生物素）至1 μg/mL，添加100 μL/孔，常温孵育2 h；用PBS（0.5%FCS）稀释链霉亲和素-HRP（1:1000），添加100 μL/孔，常温抚育1 h（注：NaN3能够抑制HRP活性）；添加底物作用液100 μL/孔，直到有明显的斑点出现。结果表明，与PBS和空载体pW425et /NC8相比，口服pW425et-NP-M1/NC8的小鼠脾脏和MLN中产生了强烈的T反应，差异极显著（P＜0.001）；皮下注射灭活苗的小鼠脾脏和MLN对抗原肽反应与口服pW425et-NP-M1/NC8的结果显著不差异（P〉0.05），见图4和5所示。
2）小鼠肠内容物中特异性sIgA 的检测
攻毒前处死小鼠，打开小鼠腹腔，取各组小鼠小肠相对一致的位置，且长度相等。使用500μL 的PBS 反复冲洗截下来的小肠部分，并将液体置于离心管中，4000r/min，离心10min，取上清，采用常规间接ELISA 技术检测肠内容中NP和M1特异性sIgA水平。其中，包被抗原采用纯化NP和M1的等比例混合抗原（稀释度1:200），酶标二抗采用HRP 标记的羊抗小鼠IgG（稀释度1:2000），采用全自动酶标仪读数。结果表明，表达NP-M1的乳酸菌能显著增加小鼠肠内容物中抗原特异性的sIgA的表达，高于PBS 组、乳酸菌空载体pW425et/NC8组和灭活苗组，且差异显著(P<0.05)，而重组乳酸菌空载体pW425et/NC8不能显著的增加特异性sIgA的表达，见图6所示。
3）重组乳酸菌对不同型流感病毒的保护试验
加强免疫2周后，各组小鼠（70 mg/kg戊巴比妥钠麻醉）一半用于感染10×LD50同型禽流感病毒mH9N2，另一半小鼠麻醉后，用于感染0.5×LD50异源流感病毒A/Puerto Rico/8/1934（H1N1），对感染病毒后的小鼠每日监测体重和死亡情况。检测各组小鼠肺脏中的病毒滴度，肺脏匀浆上清与MDCK细胞共培养3-5d。TCID50测定方法按照常规方法进行。
结果表明，在加强免疫2周后，给小鼠感染了10×LD 50的鼠适应性mH9N2 AIV，结果显示表达NP-M1的乳酸菌能产生近80%的保护率，而PBS和乳酸菌空载体对照组小鼠全部死亡，禽流感灭活苗可产生完全的保护，如图7所示。此外，表达NP-M1的乳酸菌还能有效降低小鼠肺内病毒滴度，与灭活苗的效果相近，其他各组不能明显降低小鼠肺内病毒滴度，如图8所示。
由于流感病毒A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）对小鼠的致病力较强，最终确定给免疫小鼠感染了0.5×LD50的鼠适应性H1N1流感病毒。结果显示，小鼠感染异源H1N1流感病毒后，口服重组乳酸菌pW425et-NP-M1/NC8的小鼠没有发生死亡，产生了完全保护；口服重组乳酸菌pW425et /NC8的小鼠免疫灭活苗的小鼠有80%的保护率，结果如图9 所示。在感染H1N1亚型流感病毒5天时，取各组小鼠肺脏比较肺内流感病毒滴度。结果表明，与其他各组小鼠相比，口服重组乳酸菌pW425et-NP-M1/NC8的小鼠肺脏流感病毒滴度最小，显著低于而给予灭活苗的小鼠肺内病毒滴度；重组乳酸菌pW425et /NC8和PBS组的小鼠肺内病毒滴度之间没有显著差异，见图10。
<110> 吉林农业大学
<120> 广谱型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法
<160> 1
<210> 1
<211> 2260
<212> DNA
<213> 人工
<400> 1
catatggctt cacaaggtac taagcgttca tacgaacaaa tggaaactgg tggtgaacgt 60
caaaatgcta ctgaaattcg tgcttcagtt ggtcgtatgg tttcaggtat tggtcgtttt 120
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ctcatggagt ggataaagac aagaccaatc ctgtcacctc tgactaaggg gattttaggg 1680
tttgtgttca cgctcaccgt gcccagtgag cgaggactgc agcgtagacg gtttgtccaa 1740
aacgccctaa atgggaatgg agacccaaac aacatggaca aggcagttaa attatacaag 1800
aaactgaaga gggaaatgac atttcatgga gcaaaggaag ttgcactcag ttactcaact 1860
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gccatggaag tcgcaagtca tgctaggcaa atggtgcaag ctatgagaac agtcgggact 2160
caccctaact ccagtacagg tctaaaagat gatcttattg aaaatttgca ggcttaccag 2220
aaccggatgg gagtgcaact gcagcggttc aagtaagctt 2260

Claims (8)

1.一种融合基因NP-M1，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.一种融合基因NP-M1质粒，是在表达载体pW425et上插入了权利要求1所述的一种融合基因NP-M1，命名为pW425et- NP-M1。
3.一种重组乳酸菌，它是转化了权利要求2所述的一种融合基因NP-M1质粒pW425et-NP-M1的乳酸杆菌。
4.根据权利要求3所述一种重组乳酸菌，其特征在于：所述的乳酸杆菌为植物乳酸杆菌。
5.根据权利要求4所述一种重组乳酸菌，其特征在于：所述的乳酸菌为Lb.plantarum NC8。
6.广谱型抗禽流感的重组乳酸菌的制备方法，它主要包括：
（1）人工合成其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示的融合基因NP-M1；
（2）将融合基因NP-M1插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pW425et中，构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达重组质粒pW425et-NP-M1；
（3）将重组质粒pW425et- NP-M1转化至乳酸杆菌中。
7.一种重组乳酸菌在制备抗禽流感药物的应用。
8.根据权利要求7所述的一种重组乳酸菌在制备抗禽流感药物的应用，其特征在于：所述的禽流感为H9N2亚型和\或H1N1亚型。
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