CN109293753A - 一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原及其制备方法 - Google Patents

一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原及其制备方法，以原核表达载体pET24a为载体，将肠毒素型大肠杆菌四个纤毛抗原基因串联插入到pET24a原核表达载体的多克隆位点区，获得了肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原。本发明免疫原选用了四种仔猪常见的肠毒素型大肠杆菌K88、K99、987P和F18纤毛抗原，通过优势组合，能够引起蛋鸡更强的免疫作用，单位总抗体效价比单个免疫混合物高，从而可以减少抗原生产和蛋鸡免疫接种注射次数，提高抗体效价和降低生产成本，达到更好更经济地防治仔猪大肠杆菌病的目的。

Description

一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原及其制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和兽用生物制品技术领域中的免疫原的的制备方法，具体涉及一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原及其制备方法。
背景技术
仔猪大肠杆菌病是由产肠毒素型大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)引起的一种高度接触性、致死性腹泻的急性传染病。临床上主要表现为肠炎、肠毒症等多种症状。由于仔猪生长日龄以及病原菌血清型的差异，引起的疾病可分为仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪水肿病和断奶仔猪腹泻。
一、大肠杆菌致病过程
肠毒素型大肠杆菌主要纤毛血清型有F4、F5、F6和F18，病原菌通过菌毛粘附在小肠黏膜受体上，定植在肠壁上的病原菌大量繁殖，分泌释放肠毒素LT(热不稳定毒素)和ST(热稳定毒素)，肠毒素通过诱导肠道细胞分泌大量的液体，同时改变肠道毛细血管通透性，电解质转移进入肠腔，造成大量的液体在肠腔潴留，从而引起猪只腹泻。
二、目前所采用防治方法及存在的问题
1、大量使用抗生素，既造成畜禽产品残留又污染环境。
2、大肠杆菌已产生耐药性、抗生素防治效果不理想，猪大肠杆菌病的发生日益增多，特别是断奶后腹泻，是仔猪饲料重点关注指标，饲料中超范围超剂量使用抗生素主要是针对猪大肠杆菌腹泻。
3、长期使用抗生素破坏肠道微生态环境，影响消化吸收功能，造成生猪后期生长迟缓。
近年来，随着畜牧业的发展猪大肠杆菌病的发生日益增多，在各地呈上升趋势，新生仔猪大肠杆菌性腹泻的发病率和死亡率在不同地区各有差异，发病率为5.69％～86.5％，死亡率为17.0％～73.0％，给养猪业造成了重大的经济损失。特别是断奶应激、环境应激、饲料应激和免疫应激引起的大肠杆菌腹泻，成为仔猪的常见病和多发病。因此，采取针对性的有效的防治措施，对保证养猪业的发展具有非常重要的现实意义。
由于仔猪大肠杆菌病原复杂，常多重感染，因此制备多价蛋黄抗体能更好地应用于临床预防和治疗，同时比较单一抗体生产具有较明显的经济效益。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原及其制备方法，该方法可用以免疫蛋鸡生产四价蛋黄抗体，应用于仔猪大肠杆菌病的预防和治疗，对于仔猪大肠杆菌病的预防和治疗有明显效果，以解决上述技术背景中的缺陷。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原，以原核表达载体pET24a为载体，将肠毒性大肠杆菌四个纤毛抗原基因串联插入到pET24a原核表达载体的多克隆位点区，获得了大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原，其中，四个所述毛抗原基因为分别从大肠杆菌F4、大肠杆菌F5、大肠杆菌F6和大肠杆菌F18的纤毛抗原基因上截取的K88ac FaeG基因、K99 fanC基因、987p fasA基因和F18ac fedF基因。
其具体制备方法包括以下操作步骤：
1、根据大肠杆菌纤毛抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行PCR，TA克隆，分别从大肠杆菌F4，大肠杆菌F5，大肠杆菌F6和大肠杆菌F18上截取K88ac FaeG基因、K99fanC基因、987p fasA基因和F18ac fedF基因；
2、参照F4纤毛基因、F5纤毛基因、F6纤毛基因和F18纤毛基因序列开放性阅读框及原核表达载体pET24a物理图谱设计引物并引入酶切位点，将F4，F5，F6和F18的目的基因与T载体进行连接，克隆测序正确后，在对应基因节点上按F4，F5，F6和F18的顺序分别进行NheI和BamHI；BamHI和EcoRI；EcoRI和HindIII；HindIII和XhoI的双酶切反应；
3、将对应的基因回收片段与经过相同双酶切反应的原核表达载体pET-24a依次进行连接，构建重组载体，即为成品大肠杆菌四价重组蛋白免疫原。
有益效果：本发明一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原及其制备方法，采用四个纤毛抗原基因串联进行了四价纤毛蛋白免疫原的研制，用于免疫蛋鸡生产大肠杆菌抗体，以增强临床仔猪大肠杆菌病的预防和治疗效果。大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原能引起鸡体较强的免疫反应，且本研究引入的四个纤毛基因又均是优势菌体粘附抗原基因，能产生强烈的免疫应答反应，从而可以达到更好的预防仔猪大肠杆菌病的目的。
附图说明
图1为pET24-F45618载体构建示意图。
图2为重组蛋白的SDS-PAGE鉴定图。
图3为重组蛋白的Western blotting鉴定图。
图4为蛋黄抗体效价ELISA测定结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
在实施例中，首先制备大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原，制备大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原时以大肠杆菌纤毛抗原蛋白基因FaeG基因、fanC基因、fasA基因和fedF基因为例，进行重组原核表达载体的构建。
大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原的制备步骤：
参照F4纤毛基因、F5纤毛基因、F6纤毛基因和F18纤毛基因序列开放性阅读框及原核表达载体pET24a物理图谱设计引物并引入酶切位点。
F4上游引物：F4F：5’-atgGctagcgcctggatgactggtg-3’；其中5′端含有NheI位点；下游引物F4R：5’-gac ggatcc gtaata agtaattgct acg-3’；5′端含有BamHI位点。
F5上游引物：F5F：5’-gct ggatcc aatacaggtactattaactt-3’其中5′端含有BamHI位点；下游引物F5R：5’-taa gtcgac taagaaggatgctgaag-3’；5′端含有SalI位点。
F6上游引物：F6F：5’-tcggtcgacgcgcccgctgaaaac-3；5′端含有SalI位点；下游引物：F6R：5’-atc aagctt cggtgtacct gctgaa-3’；5′端含有HindIII位点。
F18上游引物：F18F：5’-atg aagctt c aagtagacaagtctgtt-3’其中5′端含有HindIII位点；下游引物F18R：5’-gc gcggccgc ctgtatctcgaaaacaatg-3’；5′端含有NotI位点。
利用上述引物序列进行PCR反应(通用参数为：94℃，4min；94℃，45s，55℃，50s，72℃，60s，30个循环后于72℃延伸10min)，将各个PCR纯化产物克隆分别PMD18-T载体，经PCR及相对应的酶切鉴定后，送去生物公司测序鉴定。凝胶回收各个目的片段然后与用相对应的内切酶进行双酶切的原核表达载体pET24a连接，连接产物转化E.coli DH5 a感受态细胞后筛选重组质粒，用NheI和NotI进行双酶切反应鉴定，将鉴定正确的质粒转化BL21(DE3)感受态，将重组质粒命名为pET24-F45618如附图1所示。将构建好的重组质粒用IPTG诱导表达，产物进行SDS-PAGE电泳、Westernblot分析表达产物如附图2、图3所示，并将所表达出的目的蛋白通过亲和层析的方法进行纯化。
大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原的用途：
将40只20周龄蛋鸡，分成二组，每组各20只，共免疫三次，每次间隔2周，试验组每只鸡第一次免疫用0.25ml抗原溶液(含100μg重组蛋白)与等体积弗氏完全佐剂乳化后胸肌注射；第二次和第三次免疫用0.25ml抗原溶液(含50μg重组蛋白)与等体积弗氏不完全佐剂乳化后胸肌注射。佐剂对照组胸肌注射与试验组等量的弗氏佐剂，第一次注射弗氏完全佐剂，第二次和第三次注射弗氏不完全佐剂。六周后ELISA测定每组蛋黄抗体效价如附图4所示。
大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原所生产的蛋黄抗体的用途：
1.临床治疗仔猪大肠杆菌病：
用法用量：每天2次，每次1～2克，连用2～3天，用冷开水溶解调成糊状灌服。
2.预防断奶仔猪大肠杆菌病：
用法用量：按每吨饲料添加蛋黄抗体300～800克，连用14～42天。
大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原的攻毒保护实验及实验效果：
大肠杆菌培养与计数：
胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)培养基：胰酪胨(或胰蛋白胨)17g，植物蛋白胨(或大豆蛋白胨)3g，氯化钠100g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml。将上述成分混合，加热并轻轻搅拌溶解之后，121℃高压灭菌15min，pH7.3。
大肠杆菌在胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)中37℃生长18小时，2000g x15min离心收集细胞，用灭菌磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.2)重悬洗涤一次并重新用PBS悬浮。悬浮液浓缩至1012CFU ml-1，使用5ml进行攻毒试验。进行攻毒试验时计数器测定菌数，即用血细胞计数器进行计数。取单位体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(0.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
仔猪攻毒保护试验：
1.断奶前仔猪大肠杆菌K88、K99、987p攻毒保护试验：
选择新生健康5～7日龄仔猪120头，按随机分成六组，各20头，1～3组依次为K88、K99、987p试验组，4～6组依次为K88、K99、987p对照组；
2.断奶后仔猪大肠杆菌F18攻毒保护试验：
选择健康25～28日龄断奶仔猪40头，按随机分成两组，各20头，即第7组为F18试验组，第8组为F18对照组。
试验各组仔猪先于攻毒前8h和4h以及攻毒后4h和8h分别口服多价高免蛋黄抗体5ml/头(含2克蛋黄抗体粉)，共四次，同时对照组口服同等剂量的非高免蛋黄粉。攻毒时分别用K88、K99、987p、F18四种大肠杆菌悬液活菌对相应各试验组和对照组进行口服攻毒，每头5ml，含菌量为1×1012CFU/ml，观察48小时后试验组和对照组腹泻与死亡情况。
蛋黄抗体免疫保护性试验结果显示试验组免疫保护率明显优于阴性对照组，腹泻率和死亡率均明显减少(见表1)。
表1：仔猪大肠杆菌K88、K99、987p、F18攻毒保护试验结果表
对所得数据进行统计学分析，蛋黄抗体阳性组与蛋黄抗体阴性对照组差异均极显著(P＜0.01)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原，其特征在于，以原核表达载体pET24a为载体，将肠毒性大肠杆菌四个纤毛抗原基因串联插入到pET24a原核表达载体的多克隆位点区获得；其中，四个所述毛抗原基因分别为从大肠杆菌F4、大肠杆菌F5、大肠杆菌F6和大肠杆菌F18的纤毛抗原基因上截取的K88ac FaeG基因、K99fanC基因、987p fasA基因和F18ac fedF基因。
2.一种肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原的制备方法，其特征在于，具体制备方法包括以下操作步骤：
1)根据大肠杆菌纤毛抗原基因序列的开放性阅读框设计引物进行PCR，TA克隆，分别从大肠杆菌F4，大肠杆菌F5，大肠杆菌F6和大肠杆菌F18上截取K88ac FaeG基因、K99fanC基因、987p fasA基因和F18ac fedF基因；
2)参照F4纤毛基因、F5纤毛基因、F6纤毛基因和F18纤毛基因序列开放性阅读框及原核表达载体pET24a物理图谱设计引物并引入酶切位点，将F4，F5，F6和F18的目的基因与T载体进行连接，克隆测序正确后，在对应基因节点上按F4，F5，F6和F18的顺序分别进行NheI和BamHI；BamHI和EcoRI；EcoRI和HindIII；HindIII和XhoI的双酶切反应；
3)将对应的基因回收片段与经过相同双酶切反应的原核表达载体pET-24a依次进行连接，构建重组载体，将构建好重组载体的重组质粒用IPTG诱导表达，表达后即得成品。
3.一种高滴度四价蛋黄抗体，其特征在于，采用权利要求2～4制备的肠毒素型大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原通过免疫蛋鸡产生。
4.根据权利要求3所述的高滴度四价蛋黄抗体，其特征在于，利用大肠杆菌四价纤毛蛋白免疫原免疫蛋鸡时，共免疫三次，每次间隔2周，每只鸡第一次免疫用含100μg重组蛋白的0.25ml抗原溶液与等体积弗氏完全佐剂乳化后胸肌注射；第二次和第三次免疫用含50μg重组蛋白的0.25ml抗原溶液与等体积弗氏不完全佐剂乳化后胸肌注射。
5.一种治疗仔猪大肠杆菌病的生物抗体药剂，其特征在于，以权利要求3或4中任一一种方式制备的高滴度四价蛋黄抗体制成。
6.一种预防断奶仔猪大肠杆菌病的饲料添加剂，其特征在于，以权利要求3或4中任一一种方式制备的高滴度四价蛋黄抗体制成。
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