CN107625960A - 一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法，属于动物细菌基因工程技术领域。所述疫苗，含有如下抗原：由周质伴侣蛋白Skp、MltA‑相关蛋白MipA和长链脂肪酸外膜转运蛋白Lomt形成的融合蛋白、不耐热肠毒素的B亚基和志贺毒素2e的B亚基，所述抗原的序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。本发明通用型猪大肠杆菌病疫苗免疫后，可以使动物产生较高的IgG和IgA抗体水平，抗体持续期超过120天。本发明疫苗免疫后，能够同时保护ETEC F4、F5、F6、F41和O139的攻击，保护率均为100%，且无腹泻现象发生，与现有疫苗相比，保护范围显著扩大。

Description

一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法。

背景技术

产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia Coli，ETEC)系人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻中最常见的病原性大肠杆菌，其致病力主要由菌毛和肠毒素两种毒力因子构成，二者密切相关且缺一不可。初生幼畜被ETEC感染后因剧烈水样腹泻和迅速脱水死亡，发病率、死亡率高。据统计，国内幼畜ETEC性腹泻病在幼畜腹泻病中所占比例为：猪35％，牛26％，羊17％，尤其是一周以内的新生幼畜。

ETEC血清型众多，导致新生仔猪黄痢、白痢主要致病菌毛型包括k88(F4)、k99(F5)、987P(F6)和F41等。ETEC除具有粘附功能的菌毛外，不耐热肠毒素(heat-labileenterotoxin，LT)和耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin，ST)也具有很强的致病力，在ETEC不同血清型中LT的携带率高于ST。LT由一个A亚基和五个B亚基组装成AB₅型的外毒素，其中LTB负责与宿主肠上皮细胞的神经节苷脂(GM1)受体结合，进而发挥致病作用。

导致仔猪水肿病的ETEC主要包括O138、O139、O141等血清型，危害断奶后1-2周的仔猪，尤其是发育良好的仔猪群，导致腹泻、皮下组织水肿和神经系统病，造成很大的经济损失。志贺毒素2e(Shiga toxin 2e,Stx2e)，又称为水肿毒素，是仔猪水肿病的直接致病因子。Stx2e也是AB₅型的外毒素，Stx2eB同样负责与宿主细胞的糖苷脂(Gb4)发生结合，发挥受体的功能。

目前缺少能够防控多种血清型的通用型猪大肠杆菌病疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够同时防控5种血清型ETEC的通用型猪大肠杆菌病疫苗，显著提高了免疫接种效率、降低生产成本。

本发明的再一目的是提供上述通用型猪大肠杆菌病疫苗的制备方法，该方法操作简单，成本低，安全性高。

一种通用型猪大肠杆菌病疫苗，该疫苗含有如下抗原：由周质伴侣蛋白Skp、MltA-相关蛋白MipA和长链脂肪酸外膜转运蛋白Lomt形成的融合蛋白、不耐热肠毒素的B亚基和志贺毒素2e的B亚基，所述抗原的序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

在本发明中，所述融合蛋白的浓度为90μg/mL-1mg/mL，不耐热肠毒素B亚基的浓度为5μg/mL-1mg/mL，志贺毒素2e的B亚基的浓度为5μg/mL-1mg/mL。

优选的技术方案中，所述融合蛋白的浓度为90μg/mL-110μg/mL，不耐热肠毒素B亚基的浓度为5μg/mL-110μg/mL，志贺毒素2e的B亚基的浓度为5μg/mL-110μg/mL。

优选的技术方案中，所述融合蛋白是通过诱导表达携带融合蛋白编码基因的重组菌后得到；所述周质伴侣蛋白Skp和长链脂肪酸外膜转运蛋白Lomt分别是通过诱导表达携带相应蛋白编码基因的重组菌后得到。

优选的技术方案中，所述融合蛋白、不耐热肠毒素的B亚基和志贺毒素2e的B亚基的编码基因序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

在本发明中，所述重组菌是通过将相应蛋白编码基因插入载体pCold I中，然后导入大肠杆菌后获得。

在本发明中，所述疫苗还含有佐剂。

优选的技术方案中，所述佐剂为水佐剂。更优选的技术方案中，水佐剂为氢氧化铝、MONTANIDE^TMGel佐剂。

本发明还提供所述通用型猪大肠杆菌病疫苗的制备方法，将含有所述融合蛋白、不耐热肠毒素的B亚基和志贺毒素2e B亚基的水溶液与佐剂混合、乳化后得到。

有益效果：本发明通用型猪大肠杆菌病疫苗免疫后，可以使动物产生较高的IgG和IgA抗体水平，抗体持续期超过120天。本发明通用型猪大肠杆菌病疫苗免疫后，能够同时保护ETEC F4、F5、F6、F41和O139的攻击，保护率均为100％，且无腹泻现象发生，与现有疫苗相比，保护范围显著扩大。本发明通用型猪大肠杆菌病疫苗中的LTB和Stx2eB，同时作为主要致病因子免疫原和免疫佐剂，能够刺激动物产生较高水平的针对Skp-linker-MA-linker-Lomt的抗体，是疫苗中不可或缺的成份。本发明通用型猪大肠杆菌病疫苗中的三种重组蛋白在原核表达系统中实现了可溶性表达，更好的保留了免疫原性，且易于纯化，成本低，因此显著降低了本发明疫苗的生产成本。

附图说明

图1是纯化后的重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt的SDS-PAGE电泳图，其中M：中分子量蛋白质标准Marker。

图2是纯化后的重组蛋白LTB和Stx2eB的SDS-PAGE电泳图，其中M：中分子量蛋白质标准Marker，泳道1为纯化后的重组蛋白Stx2eB，泳道2为纯化后的重组蛋白LTB。

图3是纯化后的重组蛋白Skp和MA的SDS-PAGE电泳图，其中M：中分子量蛋白质标准Marker，泳道1为纯化后的重组蛋白MA，泳道2为纯化后的重组蛋白Skp。

图4是纯化后的重组蛋白Lomt的SDS-PAGE电泳图，其中M：中分子量蛋白质标准Marker，泳道1为纯化后的重组蛋白Lomt。

图5中(1)和(2)显示了各组小鼠针对A、B、C抗原的血清IgG抗体滴度，其中免疫Ⅰ组-A、免疫Ⅰ组-B、免疫Ⅰ组-C分别是指免疫Ⅰ组分别针对A、B、C抗原的血清IgG抗体滴度，其他按照此方法类推。天数是指自第一次接种之日后的天数。

图6中(1)和(2)显示了各组小鼠针对A、B、C抗原的粪便IgA抗体滴度，其中免疫Ⅰ组-A、免疫Ⅰ组-B、免疫Ⅰ组-C分别是指免疫Ⅰ组分别针对A、B、C抗原的粪便IgA抗体滴度，其他按照此方法类推。天数是指自第一次接种之日后的天数。

图7显示了母猪自第一次免疫后针对A、B、C抗原的IgG抗体滴度，其中免疫组-A、免疫组-B、免疫组-C分别是指免疫组分别针对A、B、C抗原的血清IgG抗体滴度。其他按照此方法类推。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1重组质粒的构建及重组蛋白的表达

1.重组质粒的构建

(1)构建融合表达MltA-相关蛋白、周质伴侣蛋白和长链脂肪酸外膜转运蛋白的重组质粒

选取大肠杆菌的三个保守性蛋白，分别为MltA-相关蛋白MipA(缩写为MA)、周质伴侣蛋白Skp、长链脂肪酸外膜转运蛋白Lomt，将该三种蛋白融合表达，用于研制大肠杆菌通用型疫苗。根据GenBank登录序列(MA编码基因登录号：CP010816；Skp编码基因登录号：CP014268；Lomt编码基因登录号：CP010229)，利用计算机软件设计MA编码基因的PCR扩增引物MA-F和MA-R，Skp编码基因的PCR扩增引物Skp-F和Skp-R，Lomt编码基因的PCR扩增引物Lomt-F和Lomt-R。各引物的序列如下，其中大写字母为限制性酶切位点：

Skp-F：5-CTCGAGgctgacaaaattgcaatc-3；

Skp-R：5-acccgggccaacctgtttcagtac-3；

MA-F：5-ggcccgggtcccggcccgatgcgtcac-3；

MA-R：5-acccgggccgaatttgtaggt-3；

Lomt-F：5-ggcccgggtcccggcccgaacgaattt-3；

Lomt-R：5-GAATTCgaacgcgtagttaaagtt-3。

以ETEC C83914(O101:K30:K99)为模板采用上述引物分别PCR扩增Skp、MA和Lomt的编码基因。采用常规的SOE(Gene splicing by overlap extension)方法，首先将Skp编码基因和MA编码基因通过linker(接头序列)串联起来，获得Skp-linker-MA基因片段，再运用SOE方法将Skp-linker-MA基因片段与Lomt编码基因通过linker(接头序列)相连，得到Skp-linker-MA-linker-Lomt基因片段，其序列如SEQ ID NO:1所示。Skp-linker-MA-linker-Lomt基因片段编码的蛋白是Skp、MA、Lomt三种蛋白通过接头形成的融合蛋白，该融合蛋白记为Skp-linker-MA-linker-Lomt，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。将Skp-linker-MA-linker-Lomt基因片段克隆导入pCold I，获得阳性重组质粒pCold I-Skp-linker-MA-linker-Lomt。

(2)构建表达LTB、Stx2eB的重组质粒

通过生物学软件DNAStar分析并去除信号肽序列，得到不耐热肠毒素的B亚基(LTB)和志贺毒素2e的B亚基(Stx2eB)的编码基因，分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。LTB和Stx2eB的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。在LTB和Stx2eB编码基因的两端分别添加酶切位点，5’端均添加XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，3’端添加EcoRⅠ酶切位点(GAATTC)，然后送南京金斯瑞生物技术公司合成。将合成的基因片段分别克隆入pColdI载体(TaKaRa)，获得阳性重组质粒pCold I-LTB(插入了LTB编码基因)和pCold I-Stx2eB(插入了Stx2eB编码基因)。

2.重组菌的构建及鉴定

将获得的重组质粒pCold I-Skp-linker-MA-linker-Lomt、pCold I-LTB和pColdI-Stx2eB分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养。挑取平板上的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，经XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。阳性重组质粒pCold I-Skp-linker-MA-linker-Lomt、pCold I-LTB和pCold I-Stx2eB酶切后，可见预期大小约为2154bp、309bp和261bp的条带，分别为Skp-linker-MA-linker-Lomt基因片段、LTB基因片段和Stx2eB基因片段。

将成功导入了阳性重组质粒pCold I-Skp-linker-MA-linker-Lomt的大肠杆菌BL21，命名为重组菌pCold I-Skp-linker-MA-linker-Lomt/BL21，成功导入了pCold I-LTB的大肠杆菌BL21命名为重组菌pCold I-LTB/BL21，成功导入了pCold I-Stx2eB的大肠杆菌BL21命名为重组菌pCold I-Stx2eB/BL21。将pCold I的空质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到对照菌株pCold I/BL21。

为了研究重组蛋白混合物与单个重组蛋白免疫效果差异，分别PCR扩增Skp、MA和Lomt编码基因，各蛋白编码基因序列与SEQ ID NO:1中相应片段相同。将各蛋白编码基因片段分别插入pCold I中，构建单独表达Skp、MA和Lomt的重组质粒pCold I-Skp、pCold I-MA和pCold I-Lomt。经酶切鉴定后，重组质粒pCold I-Skp、pCold I-MA和pCold I-Lomt被成功转化入大肠杆菌BL21(DE3)，依次命名为重组菌pCold I-Skp/BL21、pCold I-MA/BL21和pCold I-Lomt/BL21。

3、重组蛋白的诱导表达

分别诱导重组菌pCold I-Skp-linker-MA-linker-Lomt/BL21、pCold I-LTB/BL21和pCold I-Stx2eB/BL21表达重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB，阴性对照为对照菌株pCold I/BL21。具体方法如下：

(1)挑取重组菌的单菌落，接种于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基(含有10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/LNaCl)中，37℃过夜培养。

(2)取步骤(1)得到的重组菌培养液100μl，接种于新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃培养2-3h，使OD₆₀₀达到0.6。

(3)向OD₆₀₀达到0.6的菌液中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，16℃继续培养20h。

(4)将步骤(3)诱导表达后的重组菌和对照菌株培养物在4℃、12000rpm条件下离心10min，收集菌体；将菌体用PBS缓冲液洗涤2次后进行重悬。

(5)将菌体悬液置于冰浴中，用超声波裂解菌体，功率为50％，超声裂解5s，停顿5s，直至菌液澄清，得到各重组菌的裂解液。

(6)将各重组菌的裂解液，在4℃、12000rpm条件下离心15min，分别收集各重组菌的裂解液上清。采用His Trap^TM HP柱(GE公司)纯化重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB。采用SDS-PAGE电泳检测三种重组蛋白的纯化效果，并测定蛋白浓度。

从图1可以看到，在纯化后的重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt泳道上出现了大小约为78.93kDa的条带，纯度达到85％以上。从图2可以看出，在纯化后的重组蛋白LTB和Stx2eB泳道上分别出现了大小约为11.79kDa和9.65kDa的条带，纯度达到80％以上。重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt表达量占菌体总蛋白的35％左右，经His Trap^TM HP柱纯化后，重组蛋白的产率达到6-7mg/200mL重组菌发酵液。重组蛋白LTB和Stx2eB表达量占菌体总蛋白比例分别为22％和30％左右，经纯化后，重组蛋白的产率分别为3-4mg/200mL重组菌发酵液和4-5mg/200mL重组菌发酵液。

另外，采用上述相同方法分别诱导重组菌pCold I-Skp/BL21、pCold I-MA/BL21和pCold I-Lomt/BL21表达重组蛋白Skp、MA、Lomt。诱导表达后的重组菌取裂解液上清采用His Trap^TM HP柱(GE公司)纯化各重组蛋白。采用SDS-PAGE电泳分别检测重组蛋白Skp、MA、Lomt的纯化效果，并测定蛋白浓度。纯化后的重组蛋白Skp(图3)、MA(图3)、和Lomt(图4)泳道上出现了大小约为15.56kDa、17.09kDa和45.39kDa的条带，纯度达到85％以上。

实施例2以Balb/c小鼠为动物模型分析ETEC五价疫苗的免疫效力

1.疫苗制备及攻毒毒株

(1)疫苗制备

分别制备疫苗1-7和对照疫苗8。其中，疫苗1、2均为ETEC五价疫苗。

PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)：是含有0.2g/L氯化钾、0.2g/L磷酸二氢钾、8.0g/L氯化钠、1.56g/L二水合磷酸氢二钠的水溶液。

疫苗1(Skp-linker-MA-linker-Lomt:LTB:Stx2eB＝1:1:1)具体制备方法：以PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)为溶剂，配制含有重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB的疫苗水相，其中三种物质的质量体积浓度相等；将疫苗水相与MONTANIDE^TMGel01(Seppic公司)按照体积比为80:20混合，乳化，制备得到疫苗1。疫苗1中Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB的质量体积浓度均为100μg/mL。

疫苗2(Skp-linker-MA-linker-Lomt:LTB:Stx2eB＝10:1:1)具体制备方法：以PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)为溶剂，配制含有重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB的疫苗水相，其中重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB的质量体积浓度比10:1:1；将疫苗水相与MONTANIDE^TMGel01(Seppic公司)按照体积比80:20混合，乳化，制备得到疫苗2。疫苗2中Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB的质量体积浓度分别为100μg/mL、10μg/mL和10μg/mL。

疫苗3(抗原为Skp)制备方法:以PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)为溶剂，配制重组蛋白Skp溶液；将重组蛋白Skp溶液与MONTANIDE^TMGel 01(Seppic公司)按照体积比为80:20混合，乳化，制备得到疫苗3。疫苗3中Skp重组蛋白的质量体积浓度为19.71μg/mL。

疫苗4(抗原为MA)制备方法：以PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)为溶剂，配制重组蛋白MA溶液；将重组蛋白MA溶液与MONTANIDE^TMGel 01(Seppic公司)按照体积比80:20混合，乳化，制备得到疫苗4。疫苗4中重组蛋白MA的质量体积浓度为21.65μg/mL。

疫苗5(抗原为Lomt)制备方法：以PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)为溶剂，配制重组蛋白Lomt溶液；将重组蛋白Lomt溶液与MONTANIDE^TMGel 01(Seppic公司)按照体积比80:20混合，乳化，制备得到疫苗5。疫苗5中Lomt重组蛋白的质量体积浓度为57.51μg/mL。

疫苗6(抗原为LTB)制备方法：以PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)为溶剂，配制重组蛋白LTB溶液；将重组蛋白LTB溶液与MONTANIDE^TMGel 01(Seppic公司)按照体积比80:20混合，乳化，制备得到疫苗6。疫苗6中重组蛋白LTB的质量体积浓度为100μg/mL。

疫苗7(抗原为Stx2eB)制备方法：以PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)为溶剂，配制重组蛋白Stx2eB溶液；将重组蛋白Stx2eB溶液与MONTANIDE^TMGel 01(Seppic公司)按照体积比80:20混合，乳化，制备得到疫苗7。疫苗7中Stx2eB重组蛋白的质量体积浓度为100μg/mL。

对照疫苗8(仅含有佐剂和PBS)制备方法：将PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)与MONTANIDE^TMGel 01(Seppic公司)按照体积比80:20混合，乳化，制备得到对照疫苗8。

(2)攻毒毒株

本发明使用的攻毒毒株如下：ETEC菌株C83903(O141:K85:F4ab)、C83914(O101:K30:F5)、C83917(O9:K103:F6)、C83921(O101:K27:F41)和CGMCC No.5484(O139)，为描述方面起见，分别缩写为ETEC F4、ETEC F5、ETEC F6、ETEC F41和ETEC O139。所有菌株均购买于中国兽药监察所和中国微生物菌种保藏中心。

2.各疫苗的免疫攻毒试验及结果

400只Balb/c小鼠(购自扬州大学医学院)随机分成8组，50只/组，分别采用本实施例标题1中8种疫苗免疫，具体见表1。各组采用对应疫苗免疫两次，一免后21天进行二免，每次免疫剂量为200μL/只，免疫方式为背部和腹部皮下多点注射。二免后14天，各组均采用如下方法进行攻毒：分别取10只小鼠采用ETEC F4、ETEC F5、ETEC F6、ETEC F41、ETEC O139腹腔注射攻毒，攻毒剂量均为5*10⁸CFU/只。

攻毒后，观察各组小鼠免疫保护情况。

表1小鼠分组及接种的疫苗

表2各组小鼠采用不同血清型菌株的攻毒结果

从表2可以看到，以单个重组蛋白Skp、MA、Lomt、LTB、Stx2eB为抗原的疫苗3-7免疫小鼠后，对ETEC F4、F5、F6、F41和O139的攻击，均只能达到部分保护。以重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB混合物为抗原的ETEC五价疫苗(疫苗1、2)免疫小鼠后，能够同时保护ETEC F4、F5、F6、F41和O139的攻击，保护率均为100％。

3.疫苗1、疫苗2免疫后的抗体水平检测

120只Balb/c小鼠(购自扬州大学医学院)随机分成2组(免疫Ⅰ组、对照Ⅰ组)，60只/组，分别采用本实施例标题1中疫苗1、对照疫苗8进行免疫，具体分组见表3。各组采用对应疫苗免疫两次，一免后21天进行二免，每次免疫剂量为200μL/只，免疫方式均为背部和腹部皮下多点注射。二免后14天，各组均采用如下方法进行攻毒：分别取10只小鼠采用ETEC F4、ETEC F5、ETEC F6、ETEC F41、ETEC O139腹腔注射攻毒，攻毒剂量分别如下：ETEC F4，5*10⁸CFU/只；ETEC F5，5*10⁸CFU/只；ETEC F6，5*10⁸CFU/只；ETEC F41，5*10⁸CFU/只；ETECO139，5*10⁸CFU/只。

另取120只Balb/c小鼠(购自扬州大学医学院)随机分成2组(免疫Ⅱ组、对照Ⅱ组)，60只/组，分别采用本实施例标题1中疫苗2、对照疫苗8进行免疫，具体分组见表3。免疫及攻毒方法同本实施例标题3中第一段。

表3：小鼠分组情况

表4：各组不同菌株攻毒保护存活率(存活数/总数)

攻毒菌株	F4	F5	F6	F41	O139
						免疫Ⅰ组	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
对照Ⅰ组	1/10	2/10	1/10	3/10	2/10
						免疫Ⅱ组	10/10	10/10	10/10	10/10	10/10
对照Ⅱ组	0/10	2/10	2/10	1/10	3/10

检测免疫后不同时间各组小鼠针对各抗原的血清IgG抗体水平和粪便中IgA抗体水平。粪便样品采用如下方法进行前处理：取0.2g(4-5粒)小鼠粪便于无菌PBS缓冲液中，4℃放置0.5-1h以软化粪便，再用振荡器剧烈震荡15min后，8000r/min离心10min，收集上清用于检测粪便中IgA滴度。

小鼠免疫后针对各抗原的血清IgG抗体水平检测方法如下：将重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt(缩写为A抗原)、LTB(缩写为B抗原)和Stx2eB(缩写为C抗原)分别包被于ELISA板上，A抗原包被浓度为30ng/孔，B抗原包被浓度为60ng/孔，C抗原包被浓度为10ng/孔。各包被原4℃包被过夜，PBST液(含0.05％Tween-20的PBS缓冲液，PBS缓冲液浓度为0.01mM，pH7.4)洗板3次；用含5％脱脂乳的PBST液于37℃封闭1h，PBST液洗板3次；采用PBST按一定的倍数稀释待检样品，然后以100μL/孔的量加入包被板中，37℃反应1h，PBST液洗3次；加入1:15,000稀释的HRP-羊抗小鼠IgG二抗(购自南京助研生物科技有限公司)，37℃反应1h，PBST液洗5次。加TMB底物显色液(南京助研生物科技有限公司)，37℃避光显色10min，加终止液(2M的硫酸水溶液)，酶标测定仪在波长450nm处测定每孔的光吸收值OD₄₅₀。另设阴性对照，以阴血清(未免疫的小鼠血清)替代样品。计算样品OD₄₅₀与阴血清OD₄₅₀的比值。当样品OD₄₅₀与阴血清OD₄₅₀的比值大于2.1时，样品的最高稀释倍数的倒数即为待检血清的抗体滴度。

小鼠免疫后针对各抗原的IgA抗体水平检测方法同上一段，不同之处在于检测抗体为HRP-羊抗小鼠IgA二抗(购自于南京助研生物科技有限公司)，稀释度为1:10,000。IgA抗体滴度的计算方法同IgG抗体滴度。

结果：以Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB为抗原的疫苗能够保护ETECF4、F5、F6、F41和O139的攻击，免疫组的保护率均为100％(表4)。各组小鼠针对各抗原的IgG和IgA抗体水平见图5和6。从图5和图6可以看出，Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB三种重组蛋白不同配比，均能够诱导高滴度IgG和IgA抗体。虽然疫苗2中重组蛋白LTB和stx2eB浓度较低，但是均能产生针对各抗原的较高水平的IgG抗体，说明LTB可以作为免疫佐剂促进Skp-linker-MA-linker-Lomt和Stx2eB的IgG抗体，stx2eB可以作为免疫佐剂促进Skp-linker-MA-linker-Lomt和LTB的IgG抗体；从IgA抗体水平，也可以看出重组蛋白LTB和stx2eB能够发挥较好的佐剂效力，促进Skp-linker-MA-linker-Lomt的IgA产生，而针对LTB和stx2eB的IgA略有减少。

另外，从图5和6还可以看出本发明通用型猪大肠杆菌病疫苗免疫后，可以使动物产生较高的IgG和IgA抗体水平，抗体持续期超过120天。

实施例3免疫母猪分析ETEC五价疫苗的免疫效力

10头怀孕母猪(江苏盛农猪场)，ETEC F4、F5、F6、F41和O139抗原阴性，针对Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB的IgG和IgA抗体滴度均≤200时，用于本实验。随机分成2组，5头/组，分别为免疫组和对照组，见表5。免疫组接种疫苗1，对照组免疫对照疫苗8，分别于产前40天和25天进行两次免疫，免疫方式为颈部肌肉注射，免疫剂量均为3mL/头/次。免疫组母猪所产25头新生仔猪吃初乳12h后，连同对照组母猪所产未吃初乳仔猪25头，分别口服接种ETEC F4(2*10⁹CFU/只)、F5(2*10⁹CFU/只)、F6(2*10⁹CFU/只)、F41(2*10⁹CFU/只)和O139(5*10⁹CFU/只)，每种血清型ETEC攻击5头仔猪。

观察对照组和免疫组仔猪免疫保护和死亡情况。采用实施例2中方法分别检测各组母猪针对重组蛋白Skp-linker-MA-linker-Lomt(A抗原)、LTB(B抗原)和Stx2eB(C抗原)的血清IgG抗体水平和粪便中IgA抗体水平。结果：以吃初乳方式免疫后的仔猪，疫苗1能够保护ETEC F4、F5、F6、F41和O139的攻击，保护率均为100％，无明显腹泻现象；而对照组仔猪发生不同程度的死亡和腹泻，具体见表6。疫苗1中Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB三种重组抗原均能够诱导母猪产生高滴度IgG抗体(图7)；而粪便中IgA抗体未有明显变化，相比对照组无显著差异。本实施例中试验结果说明，以Skp-linker-MA-linker-Lomt、LTB和Stx2eB为抗原的疫苗免疫后能够产生较高抗体水平，且该疫苗能够有效保护ETEC F4、F5、F6、F41和O139的攻击，免疫仔猪保护率均为100％。

表5：怀孕母猪分组

表6：仔猪攻毒保护情况(存活数/总数)

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种通用型猪大肠杆菌病疫苗及其制备方法

<130> 20170920

<141> 2017-09-21

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2154

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 1

gctgacaaaa ttgcaatcgt caacatgggc agcctgttcc agcaggtagc gcagaaaacc 60

ggtgtttcta acacgctgga aaatgagttc aaaggccgtg ccagcgaact gcagcgtatg 120

gaaaccgatc tgcaggctaa aatgaaaaag ctgcagtcca tgaaagcggg cagcgatcgc 180

actaagctgg aaaaagacgt gatggctcag cgccagactt ttgctcagaa agcgcaggct 240

tttgagcagg atcgcgcacg tcgttccaac gaagaacgcg gcaaactggt tactcgtatc 300

cagactgctg tgaaatccgt tgccaacagc caggatatcg atctggttgt tgatgcaaac 360

gccgttgctt acaacagcag cgatgtaaaa gacatcactg ccgacgtact gaaacaggtt 420

ggcccgggtc ccggcccgat gcgtcacctg gatgaccgta agagcaccat gatggctggt 480

ctgtcttatg ctcactttac ccagtacggt tacctgcgta ccaccctggc tggcgatacc 540

ctggataaca gcaacggcat cgtctgggat atggcctggt tgtatcgtta caccaacggt 600

ggcctgaccg tgactccggg tattggtgtg cagtggaaca gcgaaaacca gaacgaatac 660

tattatggcg tatcgcgcaa agagtccgct cgcagcggtc tgcgtggcta taacccgaac 720

gacagctgga gcccttacct ggagctgagc gccagctaca acttcctcgg cgactggagt 780

gtttacggta ccgcacgcta cacccgtctg tctgatgaag ttactgacag cccgatggtg 840

gataaatcct ggactggcct gatttctacc gggatcacct acaaattcgg cccgggtccc 900

ggcccgaacg aattttcttc ctctggcctg ggccgggctt attcagggga aggcgcaatt 960

gccgatgatg caggtaacgt cagccgtaac cccgcattga ttactatgtt tgaccgcccg 1020

acattttctg cgggtgcggt ttatattgac ccggatgtaa atatcagcgg aacgtctcca 1080

tctggtcgta gcctgaaagc cgataacatc gcgcctacgg catgggttcc gaacatgcac 1140

tttgttgcac cgattaacga ccaatttggt tggggcgctt ctattacctc taactatggt 1200

ctggctacag agtttaacga tacttatgca ggcggctctg tcgggggtac aaccgacctt 1260

gaaaccatga acctgaactt aagcggtgcg tatcgcttaa ataatgcatg gagctttggt 1320

cttggtttca acgccgtcta cgctcgcgcg aaaattgaac gtttcgcagg cgatctgggg 1380

cagttggttg ctggccaaat tatgcaatct cctgctggcc aaactcagca agggcaagca 1440

ttggcagcta ccgccaacgg tattgacagt aataccaaaa tcgctcatct gaacggtaac 1500

cagtggggct ttggctggaa cgccggaatc ctgtatgaac tggataaaaa taaccgctat 1560

gcactgacct accgttctga agtgaaaatt gacttcaaag gtaactacag cagcgatctt 1620

aatcgtgcgt ttaataacta cggtttgcca attcctaccg cgacaggtgg cgcaacgcaa 1680

tcgggttatc tgacgctgaa cctgcctgaa atgtgggaag tgtcaggtta taaccgtgtt 1740

gatccacagt gggcgattca ctatagcctg gcttacacca gctggagtca gttccagcag 1800

ctgaaagcga cctcaaccag tggcgacacg ctgttccaga aacatgaagg ctttaaagat 1860

gcttaccgca tcgcgttggg taccacttat tactacgatg ataactggac cttccgtacc 1920

ggtatcgcct ttgatgacag cccagttcct gcacagaatc gttctatctc cattccggac 1980

caggaccgtt tctggctgag tgcaggtacg acttacgcat ttaataaaga tgcttcagtc 2040

gacgttggtg tttcttatat gcacggtcag agcgtgaaaa ttaacgaagg cccataccag 2100

ttcgagtctg aaggtaaagc ctggctgttc ggtactaact ttaactacgc gttc 2154

<210> 2

<211> 309

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 2

gctccccaga ctattacaga actatgttcg gaatatcgca acacacaaat atatacgata 60

aatgacaaga tactatcata tacggaatcg atggcaggca aaagagaaat ggttatcatt 120

acatttaaga gcggcgaaac atttcaggtc gaagtcccgg gcagtcaaca tatagactcc 180

cagaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac acattaagaa tcacatatct gaccgagacc 240

aaaattgata aattatgtgt atggaataat aaaaccccca attcaattgc ggcaatcagt 300

atgaaaaac 309

<210> 3

<211> 261

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 3

atgaagaaga tgtttatagc ggttttattt gcattggttt ctgttaatgc aatggcggcg 60

gattgtgcta aaggtaaaat tgagttttcc aagtataatg aggataatac ctttactgtg 120

aaggtgtcag gaagagaata ctggacgaac agatggaatt tgcagccatt gttacaaagt 180

gctcagttga cagggatgac tgtaacaatc atatctaata cctgcagttc aggctcaggc 240

tttgcccagg tgaagtttaa c 261

<210> 4

<211> 718

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 4

Ala Asp Lys Ile Ala Ile Val Asn Met Gly Ser Leu Phe Gln Gln Val

1 5 10 15

Ala Gln Lys Thr Gly Val Ser Asn Thr Leu Glu Asn Glu Phe Lys Gly

20 25 30

Arg Ala Ser Glu Leu Gln Arg Met Glu Thr Asp Leu Gln Ala Lys Met

35 40 45

Lys Lys Leu Gln Ser Met Lys Ala Gly Ser Asp Arg Thr Lys Leu Glu

50 55 60

Lys Asp Val Met Ala Gln Arg Gln Thr Phe Ala Gln Lys Ala Gln Ala

65 70 75 80

Phe Glu Gln Asp Arg Ala Arg Arg Ser Asn Glu Glu Arg Gly Lys Leu

85 90 95

Val Thr Arg Ile Gln Thr Ala Val Lys Ser Val Ala Asn Ser Gln Asp

100 105 110

Ile Asp Leu Val Val Asp Ala Asn Ala Val Ala Tyr Asn Ser Ser Asp

115 120 125

Val Lys Asp Ile Thr Ala Asp Val Leu Lys Gln Val Gly Pro Gly Pro

130 135 140

Gly Pro Met Arg His Leu Asp Asp Arg Lys Ser Thr Met Met Ala Gly

145 150 155 160

Leu Ser Tyr Ala His Phe Thr Gln Tyr Gly Tyr Leu Arg Thr Thr Leu

165 170 175

Ala Gly Asp Thr Leu Asp Asn Ser Asn Gly Ile Val Trp Asp Met Ala

180 185 190

Trp Leu Tyr Arg Tyr Thr Asn Gly Gly Leu Thr Val Thr Pro Gly Ile

195 200 205

Gly Val Gln Trp Asn Ser Glu Asn Gln Asn Glu Tyr Tyr Tyr Gly Val

210 215 220

Ser Arg Lys Glu Ser Ala Arg Ser Gly Leu Arg Gly Tyr Asn Pro Asn

225 230 235 240

Asp Ser Trp Ser Pro Tyr Leu Glu Leu Ser Ala Ser Tyr Asn Phe Leu

245 250 255

Gly Asp Trp Ser Val Tyr Gly Thr Ala Arg Tyr Thr Arg Leu Ser Asp

260 265 270

Glu Val Thr Asp Ser Pro Met Val Asp Lys Ser Trp Thr Gly Leu Ile

275 280 285

Ser Thr Gly Ile Thr Tyr Lys Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Asn Glu

290 295 300

Phe Ser Ser Ser Gly Leu Gly Arg Ala Tyr Ser Gly Glu Gly Ala Ile

305 310 315 320

Ala Asp Asp Ala Gly Asn Val Ser Arg Asn Pro Ala Leu Ile Thr Met

325 330 335

Phe Asp Arg Pro Thr Phe Ser Ala Gly Ala Val Tyr Ile Asp Pro Asp

340 345 350

Val Asn Ile Ser Gly Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Leu Lys Ala Asp

355 360 365

Asn Ile Ala Pro Thr Ala Trp Val Pro Asn Met His Phe Val Ala Pro

370 375 380

Ile Asn Asp Gln Phe Gly Trp Gly Ala Ser Ile Thr Ser Asn Tyr Gly

385 390 395 400

Leu Ala Thr Glu Phe Asn Asp Thr Tyr Ala Gly Gly Ser Val Gly Gly

405 410 415

Thr Thr Asp Leu Glu Thr Met Asn Leu Asn Leu Ser Gly Ala Tyr Arg

420 425 430

Leu Asn Asn Ala Trp Ser Phe Gly Leu Gly Phe Asn Ala Val Tyr Ala

435 440 445

Arg Ala Lys Ile Glu Arg Phe Ala Gly Asp Leu Gly Gln Leu Val Ala

450 455 460

Gly Gln Ile Met Gln Ser Pro Ala Gly Gln Thr Gln Gln Gly Gln Ala

465 470 475 480

Leu Ala Ala Thr Ala Asn Gly Ile Asp Ser Asn Thr Lys Ile Ala His

485 490 495

Leu Asn Gly Asn Gln Trp Gly Phe Gly Trp Asn Ala Gly Ile Leu Tyr

500 505 510

Glu Leu Asp Lys Asn Asn Arg Tyr Ala Leu Thr Tyr Arg Ser Glu Val

515 520 525

Lys Ile Asp Phe Lys Gly Asn Tyr Ser Ser Asp Leu Asn Arg Ala Phe

530 535 540

Asn Asn Tyr Gly Leu Pro Ile Pro Thr Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gln

545 550 555 560

Ser Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Leu Pro Glu Met Trp Glu Val Ser Gly

565 570 575

Tyr Asn Arg Val Asp Pro Gln Trp Ala Ile His Tyr Ser Leu Ala Tyr

580 585 590

Thr Ser Trp Ser Gln Phe Gln Gln Leu Lys Ala Thr Ser Thr Ser Gly

595 600 605

Asp Thr Leu Phe Gln Lys His Glu Gly Phe Lys Asp Ala Tyr Arg Ile

610 615 620

Ala Leu Gly Thr Thr Tyr Tyr Tyr Asp Asp Asn Trp Thr Phe Arg Thr

625 630 635 640

Gly Ile Ala Phe Asp Asp Ser Pro Val Pro Ala Gln Asn Arg Ser Ile

645 650 655

Ser Ile Pro Asp Gln Asp Arg Phe Trp Leu Ser Ala Gly Thr Thr Tyr

660 665 670

Ala Phe Asn Lys Asp Ala Ser Val Asp Val Gly Val Ser Tyr Met His

675 680 685

Gly Gln Ser Val Lys Ile Asn Glu Gly Pro Tyr Gln Phe Glu Ser Glu

690 695 700

Gly Lys Ala Trp Leu Phe Gly Thr Asn Phe Asn Tyr Ala Phe

705 710 715

<210> 5

<211> 103

<212> PRT

<213> 大肠杆菌()

<400> 5

Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln

1 5 10 15

Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala

20 25 30

Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe

35 40 45

Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala

50 55 60

Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr

65 70 75 80

Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile

85 90 95

Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn

100

<210> 6

<211> 87

<212> PRT

<213> 大肠杆菌()

<400> 6

Met Lys Lys Met Phe Ile Ala Val Leu Phe Ala Leu Val Ser Val Asn

1 5 10 15

Ala Met Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Asn Glu Asp Asn Thr Phe Thr Val Lys Val Ser Gly Arg Glu Tyr Trp

35 40 45

Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr

50 55 60

Gly Met Thr Val Thr Ile Ile Ser Asn Thr Cys Ser Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Phe Ala Gln Val Lys Phe Asn

85

Claims (10)

1.一种通用型猪大肠杆菌病疫苗，其特征在于该疫苗含有如下抗原：由周质伴侣蛋白Skp、MltA-相关蛋白MipA和长链脂肪酸外膜转运蛋白Lomt形成的融合蛋白、不耐热肠毒素的B亚基和志贺毒素2e的B亚基，所述抗原的序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述通用型猪大肠杆菌病疫苗，其特征在于所述融合蛋白的浓度为90µg/mL -1mg/mL，不耐热肠毒素B亚基的浓度为5µg/mL -1mg/mL，志贺毒素2e的B亚基的浓度为5µg/mL -1mg/mL。

3.根据权利要求2所述通用型猪大肠杆菌病疫苗，其特征在于所述融合蛋白的浓度为90µg/mL -110µg/mL，不耐热肠毒素B亚基的浓度为5µg/mL -110µg/mL，志贺毒素2e的B亚基的浓度为5µg/mL -110µg/mL。

4.根据权利要求1或2或3所述通用型猪大肠杆菌病疫苗，其特征在于所述融合蛋白是通过诱导表达携带融合蛋白编码基因的重组菌后得到；所述周质伴侣蛋白Skp和长链脂肪酸外膜转运蛋白Lomt分别是通过诱导表达携带相应蛋白编码基因的重组菌后得到。

5.根据权利要求4所述通用型猪大肠杆菌病疫苗，其特征在于所述融合蛋白、不耐热肠毒素的B亚基和志贺毒素2e的B亚基的编码基因序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求5所述通用型猪大肠杆菌病疫苗，其特征在于所述重组菌是通过将相应蛋白编码基因插入载体pCold I中，然后导入大肠杆菌后获得。

7.根据权利要求6所述通用型猪大肠杆菌病疫苗，其特征在于所述疫苗还含有佐剂。

8.根据权利要求7所述通用型猪大肠杆菌病疫苗，其特征在于所述佐剂为水佐剂。

9.根据权利要求8所述通用型猪大肠杆菌病疫苗，其特征在于水佐剂为氢氧化铝、MONTANIDE™ Gel 佐剂。

10.权利要求1所述通用型猪大肠杆菌病疫苗的制备方法，其特征在于将含有权利要求1所述融合蛋白、不耐热肠毒素的B亚基和志贺毒素2e B亚基的水溶液与佐剂混合、乳化后得到。