CN107298716A

CN107298716A - 一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107298716A
Application number: CN201710601630.8A
Authority: CN
Inventors: 刘开云
Original assignee: Chengdu Billion Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Billion Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2017-10-27

Abstract

本发明公开了一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法，所述疫苗的活性成分重组融合蛋白是由重组LTA₁‑UreA₁蛋白和LTB蛋白构成，所述重组LTA₁‑UreA₁蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，所述LTB蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。本发明将Hp尿素酶A亚单位富含抗原表位的基因片段插入编码LTA亚单位的基因的中，并替换其包含毒性部位的片段制成重组质粒，进行表达获取重组融合蛋白多聚体作为疫苗抗原，本发明融合抗原与LTB蛋白五聚体结合形成六聚体结构，既保留了LT的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性IgA抗体，提供了一种用于预防和治疗幽门螺杆菌感染的疫苗方式。

Description

一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种螺旋状、微需氧革兰阴性杆菌，主要定植于人胃粘膜，已造成全球50％以上人口感染(Lee A.Prevention of Helicobacterpylori infection.Scand-J-Gastroenterol.1996.Suppl 215:11-15.)。Hp感染是慢性胃炎、消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子，并与胃癌的发生密切相关，已被WHO列为Ⅰ类致癌因子。目前质子泵抑制剂加两种抗生素的三联疗法是全球推荐的Hp根除治疗一线方案，但是随着抗生素在Hp感染治疗中的广泛应用，Hp耐药株的发生率不断上升，以致Hp根除的难度加大。由于Hp在胃内栖居部位的特殊性，以及现在药物治疗的不足，单纯依靠药物根除Hp并不是一件易事，对Hp感染所致的胃、十二指肠疾病的防治难度仍很大，必须寻找新的有效方法进行防治。借鉴人类与传染病作斗争的经验，接种疫苗有望成为预防Hp感染、大幅度降低Hp相关性疾病发病率的最佳途径。

目前，Hp疫苗取得了极大的进展，我国已成功研制出一种Hp疫苗并获得新药证书，国外也有多种Hp疫苗已进入临床实验。所有的研究都表明，Hp疫苗需要添加粘膜免疫佐剂，才具有免疫保护效果。目前公认的最强的粘膜免疫佐剂是霍乱肠毒素(CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)，但是CT和LT对人具有较强的毒性，限制了它们的应用。在粘膜疫苗研究中，作为佐剂的LT无毒或减毒突变体研究较多[Park EJ,Chang0JH,Kim JS,et al.Themucosal adjuvanticity oftwo nontoxic mutants ofEscherichia coli heat-labileenterotoxin varies with immunization routes.Exp.Mol.Med.,2000,32(2):72-78]，其基本原理是对LT具有肠毒素毒性的A亚单位进行氨基酸点突变，使LT不具有毒性或降低毒性，但是仍保留其很强的粘膜佐剂活性。

发明内容

综上所述，本发明目的在于提供一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法，将Hp尿素酶A亚单位富含抗原表位的基因片段插入编码LT A亚单位的基因中，并替换其包含毒性部位的片段制成重组质粒，进行表达获取重组融合蛋白多聚体作为疫苗抗原，本发明融合抗原与LTB蛋白五聚体结合形成六聚体结构，既保留了LT的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性IgA抗体，提供了一种用于预防和治疗幽门螺杆菌感染的疫苗方式。

本发明通过下述技术方案实现：

一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白是由重组LTA₁-UreA₁蛋白和LTB蛋白构成，所述重组LTA₁-UreA₁蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，所述LTB蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

进一步地，所述重组融合蛋白是由重组LTA₁-UreA₁蛋白和LTB蛋白五聚体通过LTA₂亚单位连接构成的六聚体结构。

一种编码上述重组融合蛋白的基因，所述基因是由幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)的尿素酶A亚单位中富含抗原表位的基因片段插入大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)基因中并替换A亚单位毒性基因片段制成。

进一步地，所述编码重组融合蛋白基因的核苷酸序列如Seq ID No.3所示；所述编码重组融合蛋白基因用于编码重组LTA₁-UreA₁蛋白和LTB蛋白。

一种重组质粒，所述重组质粒包括表达载体和外源基因，所述外源基因如Seq IDNo.3所示。所述表达载体可采用现有基因工程常用表达质粒作为表达载体。

进一步地，所述表达载体为pET-11c。

一种制备上述重组融合蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤A，将大肠杆菌不耐热肠毒素基因中A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp去除以形成基础基因，并将幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段插入所述基础基因获得了lt-ureA₁融合基因序列；

步骤B，将所述lt-ureA₁融合基因序列与质粒表达载体pET-11c连接，获得重组质粒pET-11c/lt-ureA₁；

步骤C，将所述组质粒pET-11c/lt-ureA₁转入宿主菌进行表达获取重组融合蛋白。

一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗，所述疫苗的活性成分包括上述重组融合蛋白。

D-半乳糖填料(Thermo，20372)仅能与LTB五聚体结合，不能与LTA₁-UreA₁蛋白结合。如果LTA₁-UreA₁蛋白与LTB蛋白五聚体解离，则纯化产物中就不含有LTA₁-UreA₁蛋白。而采用D-半乳糖填料纯化获得的产物，电泳可见LTA₁-UreA₁蛋白条带。这一结果，间接证实了LTA₁-UreA₁蛋白和LTB蛋白五聚体结合形成六聚体。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法，将候选抗原尿素酶A亚单位中富含抗原表位的片段插入LT的A亚单位片段中并替换其毒性部位作为疫苗抗原，通过LTA₂片段与LTB蛋白五聚体连接，既保留了LT的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性IgA抗体，无需添加佐剂即可获得较高的免疫效果，提供了一种用于预防和治疗治疗幽门螺杆菌感染的疫苗方式，具有重要的社会价值和经济价值。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明重组质粒pET-11c/lt-ureA₁的构建示意图；

图2为本发明重组质粒酶切鉴定结果；

图3为本发明SDS-PAGE观察目的蛋白表达鉴定结果；

图4为本发明蛋白纯化鉴定结果；

图5为对比例重组质粒pET-22b/ureA-1构建示意图；

图6为对比例UreA-1蛋白表达鉴定结果；

图7为对比例UreA-1蛋白纯化鉴定结果；

图8为唾液特异性IgA检测结果；

图9为血清特异性IgG检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

合成基因：

以GenBank公布的大肠杆菌不耐热肠毒素基因(GenBank:AB011677.1)核酸序列为模板进行改造，具体设计如下：

编码LT的基因全长1148bp，包括：LTA信号肽(18个氨基酸)基因、编码LTA(240个氨基酸)的基因、编码LTB信号肽(21个氨基酸)基因及编码LTB(103个氨基酸)的基因。在编码LTA的基因末尾与编码LTB信号肽基因开头处有一个移码阅读框，因而编码整个LT的基因是一个连续的DNA序列。其完整基因核苷酸序列如Seq ID No.4所示。

经生物信息学分析及结构分析，去除LT A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp，将幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段ureA₁插入其中以替换去除的LT A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp，并在5’端引入NdeI酶切位点，3’端引入BamHI酶切位点，形成编码重组融合蛋白的融合基因lt-ureA₁，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示。

所述幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段ureA₁核苷酸序列如Seq ID No.5所示。合成基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2

重组质粒pET-11c/lt-ureA₁的构建，如图1所示：

表达载体采用pET-11c，购于Novagen公司。该表达载体携带氨苄抗性基因，是化学物质IPTG诱导控制的模式，表达水平高。未诱导前IacIq编码阻遏蛋白，该蛋白可同操纵子中的操纵基因相结合，从而控制相邻结构基因的转录作用；当诱导物存在时，阻遏蛋白因受诱导物的作用，其构形发生变化，从而失去同操纵基因的亲和性而解脱下来，聚合酶便可对结构基因进行转录，进而进行表达。在该质粒NdeI位点后插入含有LTA信号肽的重组目的基因及含有LTB信号肽的ltB基因，pET-11c能在宿主菌中共表达重组目的蛋白LTA₁-UreA₁及LTB蛋白，利用LTA及LTB信号肽，分别将目的蛋白LTA₁-UreA₁蛋白和LTB蛋白分泌至胞周质组装成LTA₁-UreA₁+5LTB的六聚体而发挥相应的靶向和佐剂作用。编码蛋白LTA₁-UreA₁蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，编码LTB蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

将合成基因序列，上游引入NdeI、下游引入BamH I酶切位点，双酶切后连接经同样酶双酶切的pET-11c，酶切反应体系配制如表1所示：

表1重组质粒构建酶切反应体系

将上述反应物混匀，酶切，经琼脂糖凝胶电泳观察，酶切鉴定结果如图2所示。

转化E.coli/DH5a感受态，氨苄抗性LB平板37℃培养，调取单菌落用氨苄抗性液体LB培养基培养，提取重组质粒测序鉴定，质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，融合基因序列与预计完全一致。

实施例3

目的蛋白表达、纯化及鉴定：

宿主菌采用E.coli/BL21(DE3)，购于天根生化科技(北京)有限公司。基因型：F-ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-)λ(DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。

(1)转化

取重组质粒pET-11c/lt-ureA₁转化E.coli/BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN，Code：CB105)，按操作说明书进行，氨苄抗性LB平板筛选阳性重组子。

(2)重组工程菌鉴定

挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落，接种10ml氨苄抗性LB液体培养基中培养，抽提质粒，用NdeI和BamHI做双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，见5.6kb表达载体片段和996bp lt-ureA₁基因片段，Lane1：pET-11c/lt-ureA₁经NdeI和BamHI双酶产物，Lane2：核酸Marker(TaKaRa，DL5000)。

(3)表达鉴定

(a)取鉴定正确的菌液，加入氨苄抗性LB培养基中，37℃，振荡培养；然后加入MIPTG，16℃诱导表达。

(b)细菌破碎：将诱导表达后的菌液取出，离心处理，弃上清，加入PBS重悬，冰水浴超声破菌。取样涂片革兰染色镜检，见破菌完全后，取上清离心处理，分离上清和沉淀。

(c)SDS-PAGE观察目的蛋白表达情况：

分别取破菌未离心样品(全菌)、离心后上清及沉淀样品，调整至适合的浓度，以LT及未诱导全菌样品作对照，用5×SDS-PAGE上样buffer处理后，各15μl上样，进行15％SDS-PAGE电泳观察结果，如图3所示。Lane 1：16诱导前全菌，Lane 2：16诱导后全菌，Lane 3：16诱导后超声上清，Lane 4：蛋白Marker(Thermo，26616)，Lane 5：16诱导后超声沉淀。见21.1kd重组LTA₁-UreA₁表达及11.7kdltB表达，如图中箭头所指。

(4)目的蛋白纯化鉴定

(a)取D-半乳糖填料(Thermo，20372)1ml，按说明书操作，用PBS洗涤，将诱导表达的菌体超声破菌上清10ml加入层析柱中，室温结合1h。

(b)用PBS洗涤，用含300mM D-半乳糖的PBS洗脱，分管收集。

(c)SDS-PAGE观察目的蛋白表达情况：取15μl样品上样，进行15％SDS-PAGE电泳观察结果，如图4所示，Lane 1：蛋白Marker(Thermo，26616)，Lane 2-5：纯化样品，见21.1kdLTA₁-UreA₁及11.7kd ltB条带。

对比例

UreA-1蛋白的制备，所述UreA-1蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.6所示：

1、pET-22b/ureA-1重组质粒获得

采用幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段ureA₁编码UreA1，所述幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段ureA₁核苷酸序列如Seq ID No.5所示，上游引入NdeI、下游引入Xho I酶切位点，插入pET-22b(+)中构建重组质粒，pET-22b(+)购自Novagen(69744-3)。重组质粒构建结构示意图如图5所示。

2、UreA-1的蛋白表达

(1)表达

取pET-22b/ureA-1质粒转化E.coli/BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN，Code：CB105)，按操作说明书进行，氨苄抗性LB平板筛选阳性重组子。挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落，接种10ml氨苄抗性LB液体培养基中培养，抽提质粒，用NdeI和BamHI做双酶切鉴定。取鉴定正确的菌液，接种氨苄抗性的LB培养基中，振荡培养。加入IPTG，37℃诱导表达。

3、UreA-1的蛋白鉴定

(1)细菌破碎

将诱导表达后的菌液取出，离心处理，弃上清，加入A液重悬(A液：50mM PB(pH7.4)+300mM NaCl+50mM imidazole)，冰水浴超声破菌。取样涂片革兰染色镜检，见破菌完全后，离心处理，分离上清和沉淀。

(2)纯化

用镍离子亲和柱纯化破菌上清(HisTrapTM FF，GE)，A液：50mM PB(pH7.4)+300mMNaCl+50mM imidazole，B液：50mM PB(pH7.4)+300mM NaCl+200m M imidazole。分管收集纯化样品。

(3)SDS-PAGE观察目的蛋白表达情况

分别取破菌未离心样品(全菌)、离心后上清及沉淀样品，调整至适合的浓度，以LT及未诱导全菌样品作对照，用5×SDS-PAGE上样buffer处理后，各15μl上样，进行15％SDS-PAGE电泳观察结果，UreA-1表达如图6所示，Lane 1：诱导前全菌，Lane 2：诱导后超声沉淀，Lane 3：诱导后超声上清，Lane 4：诱导后全菌，见蛋白表达(箭头所示)。UreA-1纯化和如图7所示，Lane 1-4：UreA-1纯化样品，Lane 5：蛋白Marker(Thermo，26616)，纯化获得12.6kd蛋白。

免疫性能测试：

(一)、免疫原性检测

以纯化实施例1制备的重组蛋为免疫原，分别通过注射(50μg)和灌胃(200μg)方式免疫小鼠，检测血清、唾液特异性抗体，以鉴定重组蛋白的免疫原性。

1、实验动物：BALB/c小鼠，6～8周龄，雌性，SPF级，60只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

2、动物分组，如表1所示：

表1实施例制备的重组融合蛋白A1和对比例制备的UreA-1蛋白免疫原性检测动物分组

分组	动物数(只)	抗原及免疫剂量	免疫方式
				1组	10	A1 50μg/只	注射
2组	10	A1 200μg/只	灌胃
				3组	10	UreA-1 50μg/只	注射
4组	10	UreA-1 200μg/只	灌胃
				5组	10	PBS	注射
6组	10	PBS	灌胃

注：本发明制备的重组融合蛋白命名为A1。

3、免疫方案

动物分别于0、7、14天免疫，共3次。

4、特异性抗体检测

免疫后21天，采集血液和唾液标本，ELISA检测抗原特异性血清IgG及唾液sIgA。每个样品做双重复。

(1)酶标板包被

取UreA-1蛋白，用包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释为4μg/ml，100μl/孔包被酶标板，封闭后4℃保存备用。

(2)标本稀释：以抗体稀释液按1：1000稀释血清；1：5稀释唾液。

(3)加样：按100μl/孔向酶标板加入稀释后的待检测样品，37℃放置60min，PBST洗涤4次，拍干。

(4)抗体稀释：以抗体稀释液按1：10000分别稀释辣根酶标记羊抗小鼠IgG及辣根酶标记羊抗小鼠IgA。

(5)加二抗：按100μl/孔向酶标板加入抗体，37℃放置40min，PBST洗涤4次，拍干；

(6)显色：向各孔加入100μl显色液，37℃显色10min，50μl/孔加入2M H₂SO₄终止反应。

(7)结果记录：测定450nm各孔吸光度值，保存数据。

测定结果如图8和图9所示，经统计学分析(t检验)，A1蛋白免疫组与UreA1蛋白免疫组及PBS组比较，A1蛋白免疫组唾液抗原特异性sIgA水平显著升高(P<0.01)，血清抗原特异性IgG水平也显著升高(P<0.01)。UreA1蛋白免疫组与PBS组比较，唾液抗原特异性sIgA及血清抗原特异性IgG水平均无显著性差异(P>0.05)。口服免疫A1蛋白有利于唾液抗原特异性sIgA水平升高(2组与1组比较，P<0.01)，注射免疫A1蛋白有利于血清抗原特异性IgG水平升高(1组与2组比较，P<0.01)。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都亿妙生物科技有限公司

<120> 一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗及其制备方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 203

<212> PRT

<213> 重组LTA1-UreA1蛋白的氨基酸序列

<400> 1

Met Lys Asn Ile Thr Phe Ile Phe Phe Ile Leu Leu Ala Ser Pro Leu

1 5 10 15

Tyr Ala Asn Gly Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp

20 25 30

Glu Pro Trp Lys Leu Thr Pro Lys Glu Leu Asp Lys Leu Met Leu His

35 40 45

Tyr Ala Gly Glu Leu Ala Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gly Ile Lys Leu

50 55 60

Asn Tyr Val Glu Ala Val Ala Leu Ile Ser Ala His Ile Met Glu Glu

65 70 75 80

Ala Arg Ala Gly Lys Lys Thr Ala Ala Glu Leu Met Gln Glu Gly Arg

85 90 95

Thr Leu Leu Lys Pro Asp Asp Val Met Asp Gly Val Ala Ser Met Ile

100 105 110

His Glu Val Gly Ile Glu Ala Met Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu Val

115 120 125

Thr Val His Thr Pro Ile Glu Ala Asn Gly Leu Glu Pro Trp Ile His

130 135 140

His Ala Pro Gln Gly Cys Gly Asn Ser Ser Arg Thr Ile Thr Asp Asp

145 150 155 160

Thr Cys Asn Glu Glu Thr Gln Asn Leu Ser Thr Ile Tyr Leu Arg Lys

165 170 175

Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser Asp Tyr Gln Ser Asp

180 185 190

Ile Asp Lys His Asn Arg Ile Arg Asp Glu Leu

195 200

<210> 2

<211> 124

<212> PRT

<213> LTB蛋白的氨基酸序列

<400> 2

Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser

1 5 10 15

Leu Cys Ala Tyr Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu

20 25 30

Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

35 40 45

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

50 55 60

Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

65 70 75 80

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

85 90 95

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105 110

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn

115 120

<210> 3

<211> 987

<212> DNA

<213> 编码重组融合蛋白基因的核苷酸序列

<400> 3

catatgaaaa atataacttt catttttttt attttattag catcgccatt atatgcaaat 60

ggcgacaaat tataccgtgc tgactctaga cccccagatg aaccatggaa actcacccca 120

aaagagttag ataagttgat gctccactac gctggagaat tagctaggaa acgcaaagaa 180

aaaggcatta agcttaacta tgtggaagcg gtagctttga ttagtgccca tattatggaa 240

gaagcgagag ctggtaaaaa gactgcggct gaattgatgc aagaagggcg cactctttta 300

aaaccggatg atgtgatgga tggtgtggca agcatgatcc atgaagtggg tattgaagcg 360

atgtttcctg atgggaccaa actcgtaacc gtgcataccc ctattgaggc taatggtctc 420

gagccctgga ttcatcatgc accacaaggt tgtggaaatt catcaagaac aattacagat 480

gatacttgta atgaggagac ccagaatctg agcacaatat atctcaggaa atatcaatca 540

aaagttaaga ggcagatatt ttcagactat cagtcagata ttgacaaaca taacagaatt 600

cgggatgaat tataaagtaa aatgttatgt tttatttacg gcgttactat cctctctatg 660

tgcatacgga gctccccagt ctattacaga actatgttcg gaatatcgca acacacaaat 720

atatacgata aatgacaaga tactatcata tacggaatcg atggcaggta aaagagaaat 780

ggttatcatt acatttaaga gcggcgcaac atttcaggtc gaagtcccgg gcagtcaaca 840

tatagactcc caaaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac acattaagaa tcacatatct 900

gaccgagacc aaaattgata aattatgtgt atggaataat aaaaccccca attcaattgc 960

ggcaatcagt atggaaaact aggatcc 987

<210> 4

<211> 1148

<212> DNA

<213> 大肠杆菌不耐热肠毒素完整基因序列

<400> 4

atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60

gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120

atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180

gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgtttccact 240

tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300

tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360

gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420

cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtaattg atgaacgatt acatcgtaac 480

agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac 540

agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat 600

gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag atgatacttg taatgaggag 660

acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata 720

ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcgggatga attatgaata 780

aagtaaaatg ttatgtttta tttacggcgt tactatcctc tctatgtgca tacggagctc 840

cccagtctat tacagaacta tgttcggaat atcgcaacac acaaatatat acgataaatg 900

acaagatact atcatatacg gaatcgatgg caggtaaaag agaaatggtt atcattacat 960

ttaagagcgg cgcaacattt caggtcgaag tcccgggcag tcaacatata gactcccaaa 1020

aaaaagccat tgaaaggatg aaggacacat taagaatcac atatctgacc gagaccaaaa 1080

ttgataaatt atgtgtatgg aataataaaa cccccaattc aattgcggca atcagtatgg 1140

aaaactag 1148

<210> 5

<211> 342

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌尿素酶A亚单位基因片段核苷酸序列

<400> 5

catatgaaac tcaccccaaa agagttagat aagttgatgc tccactacgc tggagaatta 60

gctaggaaac gcaaagaaaa aggcattaag cttaactatg tggaagcggt agctttgatt 120

agtgcccata ttatggaaga agcgagagct ggtaaaaaga ctgcggctga attgatgcaa 180

gaagggcgca ctcttttaaa accggatgat gtgatggatg gtgtggcaag catgatccat 240

gaagtgggta ttgaagcgat gtttcctgat gggaccaaac tcgtaaccgt gcatacccct 300

attgaggcta atggtctcga gcaccaccac caccaccact ga 342

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> UreA-1蛋白的氨基酸序列

<400> 6

Met Lys Leu Thr Pro Lys Glu Leu Asp Lys Leu Met Leu His Tyr Ala

1 5 10 15

Gly Glu Leu Ala Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gly Ile Lys Leu Asn Tyr

20 25 30

Val Glu Ala Val Ala Leu Ile Ser Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg

35 40 45

Ala Gly Lys Lys Thr Ala Ala Glu Leu Met Gln Glu Gly Arg Thr Leu

50 55 60

Leu Lys Pro Asp Asp Val Met Asp Gly Val Ala Ser Met Ile His Glu

65 70 75 80

Val Gly Ile Glu Ala Met Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu Val Thr Val

85 90 95

His Thr Pro Ile Glu Ala Asn Gly Leu Glu His His His His His His

100 105 110

Claims

1.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白是由重组LTA₁-UreA₁蛋白和LTB蛋白构成，所述重组LTA₁-UreA₁蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示，所述LTB蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白是由重组LTA₁-UreA₁蛋白和LTB蛋白五聚体通过LTA₂亚单位连接构成的六聚体结构。

3.一种编码权利要求1或2所述重组融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因是由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)的尿素酶A亚单位中富含抗原表位的基因片段插入大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)基因中并替换A亚单位毒性基因片段制成。

4.根据权利要求3所述的编码重组融合蛋白的基因，其特征在于，所述编码重组融合蛋白基因的核苷酸序列如Seq ID No.3所示；所述编码重组融合蛋白基因用于编码重组LTA₁-UreA₁蛋白和LTB蛋白。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括表达载体和外源基因，所述外源基因如Seq ID No.3所示。

6.根据权利要求5所述的一种重组质粒，其特征在于，所述表达载体为pET-11c。

7.一种制备权利要求1所述重组融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.一种重组幽门螺杆菌蛋白疫苗，所述疫苗的活性成分包括权利要求1或7所述的重组融合蛋白。