CN113209285B

CN113209285B - 幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis基因的应用

Info

Publication number: CN113209285B
Application number: CN202110436351.7A
Authority: CN
Inventors: 杜方川; 童文德; 朱白梅; 童武学; 杨融融
Original assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: CN113209285A

Abstract

本发明公开了一种幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis基因在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，所述chemotaxis基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

Description

幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis基因的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说是涉及一种幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis基因的应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种革兰氏阴性菌，它感染人后通常能引发患者慢性胃炎、消化性溃疡、胃淋巴增生性淋巴瘤、胃癌等消化系统疾病。目前，国内外还未见上市的幽门螺杆菌疫苗，但已有Novartis在内的6个幽门螺杆菌疫苗相继进入临床实验，包括灭活全菌疫苗、重组亚单位疫苗、重组多亚单位疫苗及载体疫苗。

到目前为止，幽门螺杆菌已公布测序菌株达200多株，幽门螺杆菌具有1400多个蛋白，不同菌株之间存在20％-30％基因组差异，通过相关生物学软件，初步选定273个幽门螺杆菌候选抗原，其中将趋化因子作为幽门螺杆菌候选疫苗进行开发备受关注。

趋化因子(chemokines)是一类小细胞因子或信号蛋白，它们具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力。比如人体在防御和清除入侵病原体等异物时，有一些物质能使免疫细胞进行定向趋化，如SIS细胞因子家族等。在幽门螺杆菌定植过程中，趋化信号系统调节幽门螺杆菌的运动，使幽门螺杆菌从胃液经过胃粘液层，再从胃黏膜上皮层到达基底层。有研究表明，在趋化系统缺陷性突变体中，幽门螺杆菌定植率降低。这为将趋化因子作为幽门螺杆菌疫苗候选抗原来研究提供了理论基础，也为幽门螺杆菌疫苗开发提供了新的突破口。

因此，如何将幽门螺杆菌趋化因子应用于制备幽门螺杆菌疫苗中是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis蛋白的应用，chemotaxis蛋白可以应用于制备幽门螺杆菌疫苗中，保护率高达20.7％，为预防幽门螺杆菌感染提供了保障。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis基因在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，所述chemotaxis基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis重组蛋白在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，所述chemotaxis重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

以上技术方案达到的技术效果是：首次将趋化因子chemotaxis蛋白应用于制备幽门螺杆菌疫苗中，为幽门螺杆菌的普及应用提供了保障。

Chemotaxis重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生黏膜免疫应答，并且能够清除幽门螺杆菌SS1菌株在小鼠胃内的定植，将黏膜佐剂与Chemotaxis重组蛋白制成幽门螺杆菌亚单位疫苗可用于预防幽门螺杆菌感染。

一种表达幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis重组蛋白的表达载体，包括：Chemotaxis重组蛋白、His-tag、pET29b质粒、GST蛋白和MBP蛋白。

一种表达幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis重组蛋白的表达载体的构建方法，包括下述步骤：

1)将His-tag基因、MBP基因和GST基因连接，得到His-tag-MBP-GST基因；

2)将步骤1)所得His-tag-MBP-GST基因与pET29b质粒连接，并转化感受态细胞，得到pET29b-5质粒；

3)克隆chemotaxis基因，并将克隆得到的chemotaxis基因与步骤2)所得pET29b-5质粒连接，并转化感受态细胞，得到chemotaxis重组蛋白的表达载体。

一种表达幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis重组蛋白的发酵方法，包括下述步骤：

1)pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌接种培养：将构建好的pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌工程菌从-80℃超低温冰箱中取出，将工程菌接种于LB-1培养基中，37℃、220rpm恒温培养过夜；

2)pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌扩大培养：取出过夜培养的工程菌，以1.5％接种比例接种于TB培养基，共接种4L，37℃、220rpm恒温培养3h；

3)pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌诱导表达：扩大培养结束时，设置诱导温度为15℃，加入0.08mM IPTG进行诱导表达，诱导时间为20h；

4)pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌菌体收集：诱导结束时，采用离心机离心收集菌体、然后破菌，得到重组蛋白。

作为本发明优选的技术方案，TB培养基组成为：磷酸二氢钾0.2312％、磷酸氢二钾1.2540％、酵母提取物2.4000％、胰蛋白胨1.2000％、甘油0.4000％、消泡剂0.0500％，余量为水。

作为本发明优选的技术方案，步骤4)中的离心参数为：10000g，8℃，10min。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明采用基因工程技术克隆表达幽门螺杆菌Chemotaxis重组蛋白，上清表达量高，分离纯化步骤简便，免疫效价高且有保护性。Chemotaxis重组蛋白可以直接与黏膜佐剂LT(B)₅配合使用，适用于口服免疫接种。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为pET29b-5质粒构建示意图；

图2附图为His(Tag)-MBP-GST基因片段质粒鉴定PCR结果；M为DNA分子量标准；1为His(Tag)-MBP-GST基因片段(1803bp)PCR产物；

图3附图为Chemotaxis基因片段高保真PCR扩增结果；M为DNA分子量标准；1为Chemotaxis基因片段(936bp)PCR产物；

图4附图为重组pET29b-Chemotaxis/BL21(DE)3普通PCR鉴定结果图，M为DNA分子量标准；1为Chemotaxis基因片段(936bp)PCR产物；

图5附图为Chemotaxis重组蛋白/BL21(DE)3工程菌破菌上清经初次纯化亲和层析图，第一个峰为破菌上清上样峰，第二、三、四个峰为A2缓冲液洗涤杂蛋白峰，第五个峰为A3缓冲液洗涤杂蛋白峰，第六个峰为A4缓冲液洗脱得目的蛋白峰；

图6附图为Chemotaxis重组蛋白/BL21(DE)3重组工程菌诱导表达、破菌后上清纯化结果图，泳道1为蛋白质分子质量标准(Thermo Fisher，26616)，泳道2为Chemotaxis/BL21(DE)3重组工程菌破菌全菌，泳道3为Chemotaxis/BL21(DE)3重组工程菌破菌上清，泳道4为Chemotaxis/BL21(DE)3重组工程菌上清纯化第一次流穿；泳道5为Chemotaxis/BL21(DE)3重组工程菌上清纯化第二次流穿；泳道6为含促溶标签的Chemotaxis重组蛋白；泳道7为PP酶酶切含促溶标签的Chemotaxis重组蛋白；泳道8为Chemotaxis重组蛋白；

图7附图为重组pET28a-LT(B)₅/BL21(DE)₃普通PCR鉴定结果；M为DNA分子量标准；1为LT(B)₅基因片段(375bp)PCR产物；

图8附图为LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌破菌上清经初次纯化亲和层析图；第一个峰为破菌上清上样峰，第二峰为B₂缓冲液洗脱得目的蛋白峰；

图9附图为LT(B)₅/BL21(DE)₃重组工程菌诱导表达、破菌后上清纯化结果；泳道1为LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌破菌全菌，泳道2为LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌破菌上清，泳道3为LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌破菌沉淀，泳道4为LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌上清纯化第一次流穿，泳道5为LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌上清纯化第二次流穿，泳道6为蛋白质分子质量标准(Thermo Fisher，26616)，泳道7为LT(B)₅重组蛋白；

图10附图为Chemotaxis重组蛋白免疫Balb/c小鼠后，小鼠唾液IgA(1:4)、血清IgG(1:800)检测阳转率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：pET29b-5双促溶标签载体构建

本实施例提供一种Chemotaxis蛋白的基因构建、发酵和纯化方法，所述Chemotaxis蛋白为幽门螺杆菌趋化因子。

本发明提供一种用于表达Chemotaxis重组蛋白的重组表达载体，其包含编码所述Chemotaxis重组蛋白、His(Tag)、促溶蛋白的核苷酸序列和质粒序列，所述质粒优选地是pET29b，His(Tag)序列为7个组氨酸(His)，促溶蛋白序列分为GST和MBP(麦芽糖结合蛋白)。质粒构建如图1。

(一)His(Tag)、MBP、GST基因克隆及连接

1、His(Tag)的蛋白氨基酸序列选自SEQ ID NO.3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4。

2、MBP基因来源于pMAL-c2X质粒(长沙优宝生物科技有限公司)，MBP的蛋白氨基酸序列选自SEQ ID NO.5，核苷酸序列如SEQ ID NO.6。

3、GST基因来源于pGEX-6P-1质粒(长沙优宝生物科技有限公司)，GST的蛋白氨基酸序列选自SEQ ID NO.7，核苷酸序列如SEQ ID NO.8。

4、根据引物设计原则，设计相应引物，并加入酶切位点。引物序列如表1所示：

表1

5、His(Tag)、MBP、GST基因连接

采用高保真PCR方法并以上述表1的引物序列扩增His(Tag)、MBP、GST基因序列，高保真体系及程序参照说明书。高保真PCR酶(KOD-Plus-Neo)来源于东洋纺上海生物科技有限公司。

以pMAL-c2X质粒为模板，F29b-1、R502为引物进行高保真PCR，产物命名为MBP-1。

以pGEX-6P-1质粒为模板，F502、R503为引物进行高保真PCR，产物命名为GST-1。

以MBP-1、GST-1为模板，F29b-2，R503为引物进行高保真PCR，产物命名为His(Tag)-MBP-GST，His(Tag)-MBP-GST基因大小为1803bp。

高保真PCR后将其产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果；

当高保真PCR片段与原始序列片段大小相符时，则进行琼脂糖凝胶回收，凝胶回收操作参照说明书。凝胶回收采用琼脂糖胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。

(二)His(Tag)-MBP-GST基因与pET29b质粒连接

将His(Tag)-MBP-GST基因、pET29b分别进行双酶切，酶切位点为NedI/NcoI。酶切体系及程序参照说明书。NedI/NcoI来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将双酶切的产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在成像系统下观察结果。切胶回收需要的片段，后进行琼脂糖凝胶回收，琼脂糖凝胶回收操作同上。用连接酶将双酶切好的His(Tag)-MBP-GST基因和pET29b质粒进行连接，连接体系及程序参照说明书。连接后的产物命名为pET29b-5，连接酶(Ligation high)来源于东洋纺上海生物科技有限公司。

(三)pET29b-5质粒转化DH5a

将连接后的产物pET29b-5质粒转入大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化体系及程序参照说明书。大肠杆菌DH5a感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物1。LB培养基组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，溶剂为水。

取100μL培养物1涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，琼脂粉1.750％，卡那霉素0.001％，溶剂为水。

在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，鉴定体系及程序参照TaKaRa Ex Taq说明书，引物为F29b-2、R503，TaKaRa Ex Taq来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

取菌落PCR扩增液10μL与10×loadingbuffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物2。LB-1培养基组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，卡那霉素0.001％，溶剂为水。

将培养物2进行保种，保种参数为培养物2：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。

(四)pET29b-5质粒(含His(Tag)-MBP-GST基因)鉴定

取培养物2进行质粒抽提，质粒抽提程序参照说明书。重组质粒DNA抽提试剂盒来源于上海捷瑞生物工程有限公司。

将抽提质粒进行普通PCR鉴定，引物为F29b-2、R503，鉴定体系及程序参照TaKaRaEx Taq说明书。

将质粒PCR扩增液10μL与10×loadingbuffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果如图2。

将经普通PCR鉴定符合质粒进行测序，测序引物为T7启动子和T7终止子，测序单位为生工生物工程(上海)股份有限公司。

将测序结果与原始序列进行对比，符合率为100％。

将测序符合质粒进行-20℃保存备用。

实施例2：Chemotaxis基因构建

(一)Chemotaxis基因克隆

幽门螺杆菌SS1菌株来源于中国食品药品检定研究院。

幽门螺杆菌培养参考本领域中常规的条件、配方及操作方法。取幽门螺杆菌培养物进行全基因组抽提，抽提体系及程序参照说明书，抽提产物放置-20℃保存备用。细菌基因组抽提试剂盒来源于上海捷瑞生物工程有限公司。

根据引物设计原则，设计Chemotaxis基因相应引物，并加入酶切位点NcoI、EcoRI。引物序列如表2所示：

表2

采用高保真PCR方法扩增基因序列，Chemotaxis基因大小为936bp，高保真PCR酶、高保真体系及程序同上。

将高保真产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、35min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果如图3。

当高保真PCR片段与原始序列片段大小相符时，则进行琼脂糖凝胶回收，凝胶回收操作同上。

(二)Chemotaxis基因与pET29b-5质粒连接

将Chemotaxis基因、pET29b-5分别进行双酶切，酶切位点为NcoI、EcoRI。酶切体系及程序参照说明书NcoI/EcoRI酶来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将双酶切的产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在成像系统下观察结果。

切胶回收需要的片段，琼脂糖凝胶回收操作同上。

用连接酶将双酶切好的Chemotaxis基因和pET29b-5质粒进行连接，连接酶来源、酶切体系及程序同上。

(三)pET29b-5-Chemotaxis转化DH5a

将连接后的产物转入大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化体系及程序参照说明书，大肠杆菌DH5a感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物3。LB培养基组成同上。

取100μL培养物3涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成同上。

在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落以引物F93-a、R93进行普通PCR鉴定，鉴定体系及程序参照TaKaRa Ex Taq说明书，TaKaRa Ex Taq来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物4。LB-1培养基组成同上。

将培养物4进行保种，保种参数为培养物4：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。

(四)pET29b-5-Chemotaxis质粒抽提

取过夜培养物4进行抽提质粒，此质粒命名为pET29b-5-Chemotaxis。重质粒抽提程序参照说明书。重组质粒DNA抽提试剂盒来源于上海捷瑞生物工程有限公司。

将抽提质粒进行普通PCR鉴定，引物为F93-a、R93，鉴定体系及程序参照TaKaRa ExTaq说明书。

取质粒鉴定普通PCR扩增液10μL与10×loading buffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。

将经普通PCR鉴定符合质粒(800-1000bp)进行-20℃保存备用。

(五)pET29b-5-Chemotaxis转化BL21(DE)₃

将pET29b-5-Chemotaxis质粒转入大肠杆菌BL21(DE)₃感受态细胞，大肠杆菌BL21(DE)₃感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司，转化体系及程序参照说明书。

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物5。LB培养基组成同上。

取50μL培养物5涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成同上。

在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，TaKaRa Ex Taq来源、普通PCR鉴定体系及程序参照TaKaRa Ex Taq说明书。

取菌落PCR扩增液10μL与10×loadingbuffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果如图4。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物6。LB-1培养基组成同上。

将培养物6进行保种，保种参数为过夜培养物：30％甘油体积比为1:1，保存条件为-80℃。

实施例3：Chemotaxis大肠杆菌发酵

(一)pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌接种培养

将构建好的pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌工程菌(培养物6)从-80℃超低温冰箱中取出，将工程菌接种于LB-1培养基中，37℃、220rpm恒温培养过夜。LB-1培养基组成同上。

(二)pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌扩大培养

取出过夜培养的工程菌，以1.5％接种比例接种于TB培养基，共接种4L，37℃、220rpm恒温培养3h。TB培养基组成为：磷酸二氢钾0.2312％，磷酸氢二钾1.2540％，酵母提取物2.4000％，胰蛋白胨1.2000％，甘油0.4000％，消泡剂0.0500％，溶剂为水。

(三)pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌诱导表达

扩大培养结束时，设置诱导温度为15℃，加入0.08mM IPTG进行诱导表达，诱导时间为20h。

(四)pET29b-5-Chemotaxis大肠杆菌菌体收集

诱导结束时，采用离心机离心收集菌体，离心参数为：10000g，8℃，10min，离心结束后将菌体放置在-80℃保存备用。湿菌产率为10.98g/L。

实施例4：Chemotaxis重组蛋白纯化

(一)破菌

取发酵所得菌体10～100g，按质量(g)：体积(mL)比1:15加入缓冲液A1，在4℃条件下使用剪切机对含菌体的缓冲液进行剪切悬浮。缓冲液A1组成为氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，pH8.0，溶剂为水。

使用RO水冲洗高压均质机(AH-1500，ATS工业系统有限公司)管道。打开低温制冷系统进行预冷，备用。将预冷的悬浮菌液加入高压均质机，在480～520bar条件下破菌7～8次，后取全菌样品。

将破菌后的液体装入离心桶，10000g离心30min，离心温度为8℃，收集上清，此为上清液1。

将上清液1使用真空抽滤泵进行过滤，收集过滤后的上清备用，此为上清液2，后取上清样品。

将沉淀用缓冲液A1进行悬浮，悬浮后取此样品，命名为沉淀。

(二)含标签Chemotaxis重组蛋白Ni填料亲和层析纯化

1、亲和层析条件：

(1)仪器系统：APPS200D纯化系统(利穗科技(苏州)有限公司)

(2)填料：Ni-NTA

(3)纯化柱规格：50mm×200mm

(4)装柱体积：100mL

2、用缓冲液A1进行平衡填料至电导、紫外平衡。

3、在4℃低温条件下上样上清液2，上样流速为10mL/min，上样1个柱体积后，取流穿，此为流穿1。

4、第一次洗涤：

(1)上样结束后，取流穿，此为流穿2。

(2)用缓冲液A1进行洗涤，洗涤体积为1～2个柱体积，流速为15mL/min。

5、第二次洗涤：缓冲液A1洗涤后，用缓冲液A2进行洗涤，洗涤至紫外值小于100mAu，流速为15mL/min。缓冲液A2组成为：氯化钠2.92％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，咪唑0.136％，pH8.0，溶剂为水。

6、第三次洗涤：缓冲液A2洗涤后，用缓冲液A3进行洗涤，洗涤至紫外值小于70mAu，流速为15mL/min。缓冲液A3组成为：氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，咪唑0.340％，pH8.0，溶剂为水。

7、洗脱：缓冲液A3洗涤后，用缓冲液A4进行洗脱，流速为15mL/min。当紫外值大于250mAu时开始收集样品，当紫外值小于250mAu时停止收集样品。缓冲液A4组成为：氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，咪唑1.700％，pH8.0，溶剂为水。此样品为含标签Chemotaxis重组蛋白，取此样品进行后续SDS-PAGE鉴定，命名为样品1，结果见图5；

(三)含标签Chemotaxis重组蛋白酶切

用缓冲液A1对含标签Chemotaxis重组蛋白进行稀释5倍。

用10KD超滤管对稀释后含标签Chemotaxis重组蛋白进行离心超滤浓缩，离心条件为4000g，15min。

从-80℃超低温冰箱中取出PP酶，在4℃条件下解冻备用。

将10～30mL PP酶加入上述浓缩后含标签Chemotaxis重组蛋白中，4℃酶切过夜。

取过夜酶切后样品进行后续SDS-PAGE鉴定，此为样品2。

(四)Chemotaxis重组蛋白Ni柱填料亲和层析纯化

用缓冲液A1平衡填料至电导、紫外平衡。此步骤所用仪器、填料、纯化柱同上。

在4℃低温条件下上样过夜酶切的含标签Chemotaxis重组蛋白溶液，上样流速为10mL/min。

当紫外值大于10mAu时开始收集样品。

上样结束后，继续上样缓冲液A1，上样流速为10mL/min。

当紫外值小于10mAu时停止收集样品。

(五)Chemotaxis重组蛋白浓缩

用10KD超滤管对Chemotaxis重组蛋白样品进行离心超滤浓缩，离心条件为4000g，15min。

将Chemotaxis重组蛋白浓缩至5～15mL后放入-80℃超低温冰箱保存备用。

取浓缩后Chemotaxis重组蛋白样品进行后续SDS-PAGE鉴定，此为样品3。

实施例5：Chemotaxis重组蛋白SDS-PAGE鉴定

配制15％SDS-PAGE。

取全菌、上清、沉淀、流穿1、流穿2、样品1、样品2、样品3各40μL，分别加入10μL 5xSDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴5min。

取上述沸水浴后样品，以10μL每孔加入SDS-PAGE，Protein Marker加样量为3μL。

加样结束后，先调节电压为80V，电泳15min；再调节电压为220v，电泳40min左右。

电泳结束后采用考马斯亮蓝法进行染色和脱色。

脱色结束后在成像系统下观察结果，结果如图6。

实施例6：Chemotaxis重组蛋白含量测定

采用福林酚法进行蛋白含量测定。

根据Chemotaxis重组蛋白SDS-PAGE电泳图预估检测样品浓度。

Chemotaxis重组蛋白测得浓度为3.70mg/mL，标准曲线的相关系数R²＝0.9940，质控回收率为95.5％。

实施例7：幽门螺杆菌Chemotaxis基因工程疫苗的制备

(一)、佐剂LT(B)₅基因构建

1、LT(B)₅基因克隆

LT(B)₅的蛋白氨基酸序列选自SEQ ID NO.16，核苷酸序列如SEQ ID NO.17。

LT(B)₅基因合成于上海捷瑞生物工程有限公司。

根据引物设计原则，设计LT(B)₅基因相应引物，并加入酶切位点NdeI、XhoI。引物序列如下：

2、LT(B)₅基因与pET28a质粒连接

将LT(B)₅基因、pET28a分别进行双酶切，酶切位点为NdeI、XhoI，酶切体系及程序参照说明书。NedI/NcoI来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将双酶切的产物分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在成像系统下观察结果。

切胶回收需要的片段，琼脂糖凝胶回收操作。

用连接酶将双酶切好的LT(B)₅基因和pET28a质粒进行连接，连接体系及程序参照说明书。连接酶(Ligation high)来源于东洋纺上海生物科技有限公司。

3、pET28a-LT(B)₅转化DH5a

将连接后的产物转入大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化体系及程序参照说明书。大肠杆菌DH5a感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物7。LB培养基组成同上。

取100μL培养物7涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成同上。

在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，引物为F-B01、R-B01，TaKaRa Ex Taq来源、普通PCR鉴定体系及程序参见TaKaRa说明书。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物8。LB-1培养基组成同上。

将培养物8进行保种，保种参数为培养物8：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。

取过夜培养物8进行抽提质粒，此质粒命名为pET28a-LT(B)₅。重组质粒DNA抽提试剂盒、质粒抽提程序参见说明书。

将抽提质粒进行普通PCR鉴定，引物为F-B01、R-B01，鉴定体系及程序参见说明书。

将经普通PCR鉴定符合质粒进行-20℃保存备用。

4、pET28a-LT(B)₅转化BL21(DE)₃

将pET28a-LT(B)₅质粒转入大肠杆菌BL21(DE)₃感受态细胞，大肠杆菌BL21(DE)₃感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司，转化体系及程序参见说明书。

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物9。LB培养基组成同上。

取50μL培养物9涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成同上。

在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，TaKaRa Ex Taq来源、普通PCR鉴定体系及程序同上。

取菌落PCR扩增液10μL与10×loadingbuffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果如图7。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物10。LB-1培养基组成同上。

将培养物10进行保种，保种参数为过夜培养物：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃

(二)、佐剂LT(B)₅大肠杆菌BL21(DE)₃发酵

1、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌接种培养

将构建好的pET28a-LT(B)₅大肠杆菌工程菌从-80℃超低温冰箱中取出，将工程菌接种于LB-1培养基中，37℃、220rpm恒温培养过夜。LB-1培养基组成同上。

2、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌转种10L发酵罐培养

取出过夜培养的工程菌以10％接种比例移种于10L发酵罐中，发酵培养基为TB培养基，接种体积为5L。在37℃、溶氧浓度在30％以上恒温培养2h。TB培养基组成为：磷酸二氢钾0.2312％，磷酸氢二钾1.2540％，酵母提取物2.4000％，胰蛋白胨1.2000％，甘油0.4000％，消泡剂0.0500％，溶剂为水。

3、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌移种100L发酵罐扩大培养

将转种培养的工程菌以10％接种比例移种于100L发酵罐中，发酵培养基为TB培养基，接种体积为55L。在37℃、溶氧浓度在30％以上恒温培养6h。TB培养基组成同上。

4、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌诱导表达

扩大培养结束时，设置诱导温度为16℃，加入0.8mM IPTG进行诱导表达，诱导时间为10h。

5、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌菌体收集

诱导结束时，采用离心机离心收集菌体，离心参数为：10000g，8℃，10min，离心结束后将菌体放置在-80℃保存备用。菌体产率为120g/L湿菌。

(三)、佐剂LT(B)₅重组蛋白纯化

1、破菌

取发酵所得菌体300g，按质量(g)：体积(mL)比1:15加入缓冲液B1，在4℃条件下使用剪切机对含菌体的缓冲液进行剪切悬浮。缓冲液B1组成为乙二胺四乙酸二钠0.115％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸钠0.18％，甘油1.25％。

将破菌后的液体装入离心桶，10，000g离心30min，离心温度为8℃，收集上清，此为上清液1。

将沉淀用缓冲液B1进行悬浮，悬浮后取此样品，命名为沉淀。

2、LT(B)₅重组蛋白D-Galactose填料亲和层析纯化

(1)亲和层析条件：仪器系统为APPS200D纯化系统(利穗科技(苏州)有限公司)，填料为D-Galactose填料，纯化柱规格为50mm×200mm，装柱体积为100mL。

(2)用缓冲液B1进行平衡填料至电导、紫外平衡。

(3)在4℃低温条件下上样上清液2，上样流速为30mL/min，上样1个柱体积后，取流穿，此为流穿1。

(4)上样结束后，取流穿，此为流穿2。

(5)用缓冲液B1进行洗涤，流速为50mL/min，洗涤至紫外值小于30mAu。

(6)用缓冲液B2进行洗脱，流速为50mL/min。当紫外值大于100mAu时开始收集样品，当紫外值小于100mAu时停止收集样品。缓冲液B2组成为：乙二胺四乙酸二钠0.115％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸钠0.18％，甘油1.25％，D-半乳糖4.50％。pH8.0，溶剂为水。

洗脱样品为LT(B)₅重组蛋白，取此样品进行后续SDS-PAGE鉴定，命名为样品1。

3、LT(B)₅重组蛋白D-Galactose填料亲和层析纯化如图8。

(四)、佐剂LT(B)₅重组蛋白SDS-PAGE鉴定

配制15％SDS-PAGE。

取全菌、上清、沉淀、流穿1、流穿2、样品1各40μL，分别加入10μL 5x SDS-PAGELoading Buffer，沸水浴15min。

电泳结束后采用考马斯亮蓝法进行染色和脱色。

脱色结束后在成像系统下观察结果，结果如图9。

(五)、佐剂LT(B)₅重组蛋白含量测定

采用福林酚法进行蛋白含量测定。

根据LT(B)₅重组蛋白SDS-PAGE电泳图预估检测样品浓度。

LT(B)₅重组蛋白测得浓度为2.3mg/mL，标准曲线的相关系数R²＝0.9945，质控回收率为100.8％。

(六)、Chemotaxis重组蛋白与LT(B)₅重组蛋白物理混合制备疫苗

将Chemotaxis重组蛋白、LT(B)₅重组蛋白放置4℃融化。

将融化后的Chemotaxis重组蛋白、LT(B)₅重组蛋白以1mg/只小鼠剂量混合。

小鼠免疫体积为1mL/只。

实施例12：幽门螺杆菌Chemotaxis基因工程疫苗口服免疫动物

(一)、口服灌胃免疫动物

1、实验动物：6周龄雌性Balb/c小鼠，90只，18g±2g。小鼠自购买后采用随机分组法对鼠进行分组，10只/笼。免疫组30只，感染组30只，空白对照组30只。过渡饲养1天进行免疫实验。

2、Chemotaxis疫苗组成：Chemotaxis重组蛋白抗原1mg/mL，LT(B)₅重组蛋白为1mg/mL，溶剂为：氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，甘油5mL/100mL，溶液pH为8.0。

3、感染组(佐剂对照组)免疫组成：LT(B)₅为1mg/mL，溶剂为：氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸氢钠0.18％，甘油5mL/100mL，溶液pH为8.0。

4、口服灌胃免疫程序：共免疫3次，免疫时间点为0天、7天、28天。

5、免疫前需提前24h断食断水。

6、口服灌胃免疫：

(1)免疫前将幽门螺杆菌疫苗从-80℃取出放置在4℃冰箱解冻备用。

(2)用无菌注射器吸取Chemotaxis疫苗，免疫剂量为Chemotaxis抗原1mg/只，LT(B)₅为1mg/只。

(3)每次免疫分3次给小鼠灌胃1mL疫苗，每次口服灌胃间隔时间不超过45min。

(4)免疫结束后2h恢复食水。

(5)每次免疫操作均相同。

(二)末次免疫后口服灌胃感染幽门螺杆菌

末次免疫后第10天进行口服灌胃幽门螺杆菌SS1活菌进行攻毒实验，每只小鼠感染剂量为4×10⁶CFU。

(三)、末次免疫结束后唾液和血样本采集

1、小鼠唾液样本采集

末次免疫结束后第10天、第38天对小鼠进行采集唾液。

唾液采集前小鼠需断食断水24h。

采集小鼠唾液前，需给小鼠腹腔注射5mg/mL毛果芸香碱20uL，采集唾液放置在-80℃保存备用。

2、小鼠血样本采集

末次免疫结束后第10天对小鼠进行采集尾静脉血，第38天采集小鼠眼眶静脉血。

3、唾液采集前小鼠需断食断水24h。

4、将采集的血室温静置4h，采用3000g离心2min，吸上清，后再重复上述操作一次，将分离的血清放置在-80℃保存备用。

(四)、唾液IgA和血清IgG样本Elisa间接法检测

1、Elisa检测准备

封闭液组成如下：0.01M PBS，1.5％BSA，溶剂为水。

PBST洗涤液组成如下：0.01M PBS，0.05mL/100mLTween-20，溶剂为水。

抗体稀释液组成如下：0.01M PBS，0.05mL/100mLTween-20，0.5％BSA，溶剂为水。

底物缓冲液组成如下：磷酸氢二钠1.4％，一水合柠檬酸1.5％，溶剂为水。

2M硫酸组成如下：浓硫酸11.22mL/100mL，溶剂为水。

1mg/mLTMB组成如下：TMB 0.1.5％，溶剂为DMSO。

显色液组成如下：1mg/mLTMB：底物缓冲液：30％双氧水配制体积比例为100:900:1。

Chemotaxis抗原包被酶标板：用2ug/mL免疫抗原包被酶标板，包被条件为37℃下孵育2h，后用PBST洗涤液洗板三次。300μL/孔将封闭液加入上述酶标板，放入4℃冰箱中，封闭过夜。再用PBST洗涤液洗上述酶标板三次，将此酶标板命名为酶标板1并放入4℃冰箱保存备用。

2、血清IgG样本Elisa检测

将血清样本用抗体稀释液以1:800进行稀释，100μL/孔加入酶标板1中，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板2。

将羊抗鼠IgG二抗用抗体稀释液1:10000进行稀释，100μL/孔加入酶标板2，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板3。

将显色液按100μL/孔加入酶标板3中，37℃、孵育15min，后按50μL/孔加入2M H₂SO₄终止液，此酶标板命名为酶标板4。

将酶标板4放入酶标分析仪中，选择OD450进行检测，将检测数据保存并进行后续分析。

3、唾液IgA样本Elisa检测

将唾液样本用抗体稀释液以1:5进行稀释，100μL/孔加入酶标板1中，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板5。

将羊抗鼠IgA二抗用抗体稀释液1:5000进行稀释，100μL/孔加入酶标板5，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板6。

将显色液按100μL/孔加入酶标板6中，37℃、孵育15min，后按50μL/孔加入2M H₂SO₄终止液，此酶标板命名为酶标板7。

将酶标板7放入酶标分析仪中，选择OD450进行检测，将检测数据保存并进行后续分析。

4、唾液IgA和血清IgG效价检测结果

检测结果判定：将样本(免疫组)/阴性(感染组)值≥2.1定义为阳性。将感染组效价检测阳性小鼠/感染组小鼠×100％定义为阳转率。

(1)唾液IgA效价检测结果：小鼠免疫组保护率判定终点时唾液IgA(1:4)效价检测阳转率为40％，如图10所示。

(2)血清IgG效价检测结果：小鼠免疫组保护率判定终点时血清IgG(1:800)效价检测阳转率为70％，如图10所示。

(3)通过唾液IgA和血清IgG效价检测结果说明本发明的Chemotaxis疫苗具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，为Chemotaxis疫苗用于清除胃内幽门螺杆菌定植提供了支撑。

(五)、Chemotaxis疫苗保护结果

1、末次免疫结束后第38天通过平板培养法检测各组小鼠幽门螺杆菌感染定植率，以此计算Chemotaxis疫苗保护率。保护率＝(免疫组只数×感染组感染率—免疫组感染只数)/(免疫组只数×感染组感染率)×100/100。

2、幽门螺杆菌平板培养参考本领域中常规的条件、配方及操作方法。

3、幽门螺杆菌平板培养判定标准：

(1)、菌落形态鉴定标准：将平板上生长出直径为0.1mm～0.5mm、呈透明针尖样大小的特征性菌落判定为幽门螺杆菌阳性，用“+”号表示；在平板上没有长出或者不是上述形态的菌落时，则判定为幽门螺杆菌阴性，用“-”号表示；当平板上长出疑似幽门螺杆菌菌落形态的菌时，用“*”表示。

(2)、快速尿素酶实验认定标准：在平板菌落上滴上适量尿素酶溶液，菌落若变为红色，即此菌落尿素触酶阳性，此菌落则被判定为幽门螺杆菌阳性，用“+”号表示；若菌落尿素触酶反应不变为红色或不变色时，则判定此菌落为幽门螺杆菌阴性，用“-”号表示；当菌落尿素触酶反应颜色变为红色不明显时，则判定此菌落为疑似幽门螺杆菌，用“*”表示。

(3)快速革兰氏染色镜检鉴定标准：对菌落形态、快速尿素酶实验存疑时进行镜检，镜检标准：菌为紫色，形态为螺旋形弯曲、末端钝圆时，则判定此菌落中含有幽门螺旋杆菌，用“+”号表示；反之，若镜检菌不为紫色，且形态没有螺旋形弯曲、末端钝圆时，则判定为幽门螺杆菌阴性，用“-”号表示；若未进行此项检测，用“/”号表示。

4、幽门螺杆菌平板培养判定标准：当平板上有一个或者一个以上的菌落生长时，经菌落形态鉴定、快速尿素酶实验、快速革兰氏染色镜检，当菌落形态鉴定和快速尿素酶实验均为阳性或快速革兰氏染色镜检阳性，则判定该菌落为幽门螺杆菌，同时判定幽门螺杆菌在鼠胃内感染定植成功；当菌落形态鉴定和快速尿素酶实验均为阴性或快速革兰氏染色镜检阴性，则判定该菌落不是幽门螺杆菌，同时判定幽门螺杆菌在鼠胃内感染定植不成功。

5、Chemotaxis疫苗免疫组连续3轮(10只/轮)动物保护实验其定植率检测结果如表3-表5下：

表3

表4

表5

6、由于能直接从培养平板进行幽门螺杆菌菌落形态鉴定和快速尿素酶实验，故未进行快速革兰氏染色镜检。

7、根据平板培养结果，连续3轮动物保护实验其各组平均定植率如表6所示：

表6

组别	定植率
		免疫组	83.3％(23/30)
感染组	96.7％(29/30)
		空白对照组	0％(0/30)

根据定植率结果，其保护率如表7所示：

表7

组别	保护率
		免疫组	20.7％(6/29)
感染组	0％(0/29)
		空白对照组	0％(0/30)

由上表可知，免疫组的3轮平均保护率为20.7％，感染组的3轮平均保护率为0％。

因此，本发明的Chemotaxis重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生黏膜免疫应答，并且能够清除幽门螺杆菌SS1菌株在小鼠胃内的定植，将黏膜佐剂与Chemotaxis重组蛋白制成幽门螺杆菌亚单位疫苗可用于预防幽门螺杆菌感染。

通过以上实施例，本发明的Chemotaxis重组蛋白发酵、纯化步骤简单，得到的Chemotaxis重组蛋白产量高，免疫原性强，可进一步将其应用于预防幽门螺杆菌感染。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 成都亿妙生物科技有限公司

<120> 幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis基因的应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 933

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 1

gcagaaaaaa cagctaacga tttaaaacta agtgagatag aactcgtgga ttttcgtatt 60

tatggcatgc aagagggcgt cccttatgag gggatttatg gcatcaatgt ggctaaagtc 120

caagagatta tccccatgcc cacccttttt gaatacccca cgaatttgga ttacattatc 180

ggcgtgtttg atttgcgctc cacgatcatt ccgcttatag acttggctaa atggataggg 240

attgtcccag ataaaagcaa ggaaaacgaa aaaatcgtca ttatcacgga atttaataat 300

gtcaaattgg gctttttagt ccattccgct aggcgtatca ggcgcattag ctggaaagat 360

gtggagcctg catcctttag tgcctctaat agcatcaata aagaaaatat caccggcacg 420

acacgcattg aaaacgacaa aaccctactc attttggatt tagaaagcat tttagacgat 480

ttaaaactta atgaagacgc caaaaacact aaagacaccc ctaaagagcg ttttgaaggc 540

gaagtgttgt ttttagacga tagcagaacg gcgagaaaaa ccttaaaaaa ccatttgagt 600

aaattgggtt ttagcatcac ggaagctgtg gatggggaag acgggctgaa caaattagaa 660

atgttgttca aaaaatacgg ggacgatttg aggaaacatt tgaaattcat tatttcagat 720

gttgaaatgc ctaaaatgga tggctatcat ttcttattca agctccaaaa agaccctagg 780

tttgcttata ttcctgtgat ttttaattct tctatttgcg ataattatag cgctgaaagg 840

gctaaagaaa tgggggcagt agcgtattta gtcaagtttg acgcagaaaa attcaccgaa 900

gaaatttcta agattttaga caagaatgca taa 933

<210> 2

<211> 310

<212> PRT

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 2

Ala Glu Lys Thr Ala Asn Asp Leu Lys Leu Ser Glu Ile Glu Leu Val

1 5 10 15

Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Met Gln Glu Gly Val Pro Tyr Glu Gly Ile

20 25 30

Tyr Gly Ile Asn Val Ala Lys Val Gln Glu Ile Ile Pro Met Pro Thr

35 40 45

Leu Phe Glu Tyr Pro Thr Asn Leu Asp Tyr Ile Ile Gly Val Phe Asp

50 55 60

Leu Arg Ser Thr Ile Ile Pro Leu Ile Asp Leu Ala Lys Trp Ile Gly

65 70 75 80

Ile Val Pro Asp Lys Ser Lys Glu Asn Glu Lys Ile Val Ile Ile Thr

85 90 95

Glu Phe Asn Asn Val Lys Leu Gly Phe Leu Val His Ser Ala Arg Arg

100 105 110

Ile Arg Arg Ile Ser Trp Lys Asp Val Glu Pro Ala Ser Phe Ser Ala

115 120 125

Ser Asn Ser Ile Asn Lys Glu Asn Ile Thr Gly Thr Thr Arg Ile Glu

130 135 140

Asn Asp Lys Thr Leu Leu Ile Leu Asp Leu Glu Ser Ile Leu Asp Asp

145 150 155 160

Leu Lys Leu Asn Glu Asp Ala Lys Asn Thr Lys Asp Thr Pro Lys Glu

165 170 175

Arg Phe Glu Gly Glu Val Leu Phe Leu Asp Asp Ser Arg Thr Ala Arg

180 185 190

Lys Thr Leu Lys Asn His Leu Ser Lys Leu Gly Phe Ser Ile Thr Glu

195 200 205

Ala Val Asp Gly Glu Asp Gly Leu Asn Lys Leu Glu Met Leu Phe Lys

210 215 220

Lys Tyr Gly Asp Asp Leu Arg Lys His Leu Lys Phe Ile Ile Ser Asp

225 230 235 240

Val Glu Met Pro Lys Met Asp Gly Tyr His Phe Leu Phe Lys Leu Gln

245 250 255

Lys Asp Pro Arg Phe Ala Tyr Ile Pro Val Ile Phe Asn Ser Ser Ile

260 265 270

Cys Asp Asn Tyr Ser Ala Glu Arg Ala Lys Glu Met Gly Ala Val Ala

275 280 285

Tyr Leu Val Lys Phe Asp Ala Glu Lys Phe Thr Glu Glu Ile Ser Lys

290 295 300

Ile Leu Asp Lys Asn Ala

305 310

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 3

His His His His His His His

1 5

<210> 4

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

<210> 5

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly

1 5 10 15

Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly

20 25 30

Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro

35 40 45

Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His

50 55 60

Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr

65 70 75 80

Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala

85 90 95

Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala

100 105 110

Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr

115 120 125

Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys

130 135 140

Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu

145 150 155 160

Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr

165 170 175

Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu

180 185 190

Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr

195 200 205

Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met

210 215 220

Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val

225 230 235 240

Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys

245 250 255

Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn

260 265 270

Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu

275 280 285

Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu

290 295 300

Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr

305 310 315 320

Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met

325 330 335

Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser

340 345 350

Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr

355 360 365

<210> 6

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaatcgaag aaggtaaact ggtaatctgg attaacggcg ataaaggcta taacggtctc 60

gctgaagtcg gtaagaaatt cgagaaagat accggaatta aagtcaccgt tgagcatccg 120

gataaactgg aagagaaatt cccacaggtt gcggcaactg gcgatggccc tgacattatc 180

ttctgggcac acgaccgctt tggtggctac gctcaatctg gcctgttggc tgaaatcacc 240

ccggacaaag cgttccagga caagctgtat ccgtttacct gggatgccgt acgttacaac 300

ggcaagctga ttgcttaccc gatcgctgtt gaagcgttat cgctgattta taacaaagat 360

ctgctgccga acccgccaaa aacctgggaa gagatcccgg cgctggataa agaactgaaa 420

gcgaaaggta agagcgcgct gatgttcaac ctgcaagaac cgtacttcac ctggccgctg 480

attgctgctg acgggggtta tgcgttcaag tatgaaaacg gcaagtacga cattaaagac 540

gtgggcgtgg ataacgctgg cgcgaaagcg ggtctgacct tcctggttga cctgattaaa 600

aacaaacaca tgaatgcaga caccgattac tccatcgcag aagctgcctt taataaaggc 660

gaaacagcga tgaccatcaa cggcccgtgg gcatggtcca acatcgacac cagcaaagtg 720

aattatggtg taacggtact gccgaccttc aagggtcaac catccaaacc gttcgttggc 780

gtgctgagcg caggtattaa cgccgccagt ccgaacaaag agctggcaaa agagttcctc 840

gaaaactatc tgctgactga tgaaggtctg gaagcggtta ataaagacaa accgctgggt 900

gccgtagcgc tgaagtctta cgaggaagag ttggcgaaag atccacgtat tgccgccact 960

atggaaaacg cccagaaagg tgaaatcatg ccgaacatcc cgcagatgtc cgctttctgg 1020

tatgccgtgc gtactgcggt gatcaacgcc gccagcggtc gtcagactgt cgatgaagcc 1080

ctgaaagacg cgcagact 1098

<210> 7

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr

20 25 30

Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly

35 40 45

Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu

50 55 60

Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met

65 70 75 80

Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly

85 90 95

Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys

100 105 110

Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met

115 120 125

Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly

130 135 140

Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val

145 150 155 160

Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val

165 170 175

Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu

180 185 190

Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr

195 200 205

Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu Phe

210 215 220

Gln Gly Pro Leu

225

<210> 8

<211> 545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcccctatac taggttattg gaaaattaag ggccttgtgc aacccactcg acttcttttg 60

gaatatcttg aagaaaaata tgaagagcat ttgtatgagc gcgatgaagg tgataaatgg 120

cgaaacaaaa agtttgaatt gggtttggag tttcccaatc ttccttatta tattgatggt 180

gatgttaaat taacacagtc tatggccatc atacgttata tagctgacaa gcacaacatg 240

ttgggtggtt gtccaaaaga gcgtgcagag atttcaatgc ttgaaggagc ggttttggat 300

attagatacg gtgtttcgag aattgcatat agtaaagact ttgaaactct caaagttgat 360

tttcttagca agctacctga aatgctgaaa atgttcgaag atcgtttatg tcataaaaca 420

tatttaaatg gtgatcatgt aacccatcct gacttcatgt tgtatgacgc tcttgatgtt 480

gttttataca tggacccaat gtgcctggat gcgttcccaa aattagtttg ttttaaaaaa 540

cgtat 545

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catcatcatc atcatcataa aatcgaagaa ggtaaa 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ataacctagt ataggggaag tctgcgcgtc tttcag 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctgaaagacg cgcagacttc ccctatacta ggttat 36

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catgccatgg acaggggccc ctggaacag 29

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggaattccat atgcatcatc atcatcatca tcat 34

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catgccatgg cagaaaaaac agctaacg 28

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggaattctta tgcattcttg tctaaaatct tag 33

<210> 16

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser

1 5 10 15

Leu Cys Ala Tyr Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu

20 25 30

Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

35 40 45

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

50 55 60

Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

65 70 75 80

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

85 90 95

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105 110

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn

115 120

<210> 17

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgaacaaag tcaaatgtta tgttttattt acggcgttac tgtcctctct gtgtgcatac 60

ggagctccgc agtctattac agaactgtgt tcggaatatc gcaacacaca aatttatacg 120

attaatgaca agattctgtc atatacggaa tcgatggcag gcaaacgcga aatggttatc 180

attacattta agagcggcgc aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatattgac 240

tcccaaaaaa aagccattga acgcatgaag gacacattac gcatcacata tctgaccgag 300

accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc cgaattcaat tgcggcaatc 360

agtatggaaa actag 375

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggaattccat atgaacaaag tcaaatgtta tg 32

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccgctcgagc tagttttcca tactgattg 29

Claims

1.一种幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis基因在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，其特征在于，所述chemotaxis基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种幽门螺杆菌趋化因子chemotaxis重组蛋白在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，所述chemotaxis重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。