CN113150086B

CN113150086B - 幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用

Info

Publication number: CN113150086B
Application number: CN202110436551.2A
Authority: CN
Inventors: 杜方川; 童文德; 朱白梅; 童武学; 税静
Original assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Chengdu Olymvax Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: CN113150086A

Abstract

本发明公开了幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的幽门螺杆菌HefC重组蛋白在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，采用基因工程技术克隆表达幽门螺杆菌HefC重组蛋白，上清表达量高，分离纯化步骤简便，免疫效价高且有保护性。HefC重组蛋白可以直接与黏膜佐剂LT(B)₅配合使用，适用于口服免疫接种。

Description

幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种传染病，幽门螺杆菌感染与慢性胃炎、消化性溃疡相关性较为明确，同时幽门螺杆菌感染是造成胃癌的主要病因。幽门螺杆菌感染后不存在“幽门螺杆菌携带”的状态，患者不能自发清除，大部分患者并无临床症状。幽门螺杆菌感染存在性别、年龄、职业、生活区域、生活习惯、家族聚集性差异。目前标准四联疗法中，根除方案中6种抗生素药物组合的种类不断增多、抑酸药和抗生素的用量不断增大，疗程由7天、10天延长到14天，副作用也随之增加。幽门螺杆菌根除率的下降与抗生素耐药、菌株毒力因子改变、患者依从性差等有关，其中抗生素耐药为主要影响因素，同时有限可选用的抗生素也增加根除幽门螺杆菌感染难度。

开发一种有效的幽门螺杆菌疫苗可以避免目前根除方法中存在的药物抗菌疗法对幽门螺杆菌治疗存在根除率不高、易复发、难以群体防治等不足，同时也不会对幽门螺杆菌和其它共生菌产生更多的抗生素耐药性。近年来幽门螺杆菌疫苗已被美国幽门螺杆菌临床处理指南、欧洲幽门螺杆菌感染处理共识和中国幽门螺杆菌感染处理共识认为是预防Hp感染的最佳措施。

外排泵被认为是细菌产生多重耐药的主要机制之一，目前主要的外排泵系统主要有：(1)小多重耐药家族(Small multidruy family，SMR)、(2)主要促进因子超家族(MajorFacilitator Super family，MFS)、(3)多重耐药与毒性化合物外排家族(Multidruy andtoxic compound extrusion family，MATE)、(4)耐药-生节-分化家族(Resistance-Nodylation-Division family，RND)、(5)ATP结合盒家族(ATP binding cassette，ABC)。幽门螺杆菌中研究较多的是HefABC-RND外排系统。

因此，提供幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明选用HefABC-RND外排系统中的HefC(efflux RND transporter permeasesubunit HefC)，幽门螺杆菌中HefC的作用机制可能是抗胆汁盐。HefC氨基酸大小为1028aa，其中1-27个aa为信号肽，跨膜区域为5-27aa，327-344aa，351-373aa，378-400aa，421-443aa，458-480aa，510-532aa，855-874aa，881-900aa，910-932aa，953-975aa，990-1012aa。本发明选用HefC的28-326aa外膜片段，运用基因工程等技术进行重组蛋白表达，后将其制备成幽门螺杆菌口服疫苗，取得了一定的保护效果。

幽门螺杆菌HefC重组蛋白在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，所述HefC重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，编码所述HefC重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述HefC重组蛋白的构建方法如下：

(1)将His标签、MBP、GST基因连接，获得His标签-MBP-GST基因；所述His标签-MBP-GST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)将步骤(1)获得的His标签-MBP-GST基因与pET29b质粒连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pET29b-5质粒；

(3)克隆HefC基因，与步骤(2)得到的pET29b-5质粒连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得pET29b-5-HefC质粒；

(4)pET29b-5-HefC质粒转入大肠杆菌BL21(DE)3感受态细胞，经诱导纯化，获得HefC重组蛋白。

进一步，步骤(4)所述纯化方法如下：依次进行Ni-NTA初步纯化、PP酶酶切、Ni-NTA再纯化；纯化所用缓冲液为：缓冲液A1、缓冲液A2、缓冲液A3；

缓冲液A1组成为：氯化钠0.800％，氯化钾0.020％，磷酸氢二钠0.284％，磷酸二氢钾0.027％，pH8.0，溶剂为水；

缓冲液A2组成为：氯化钠2.922％，氯化钾0.020％，磷酸氢二钠0.284％，磷酸二氢钾0.027％，咪唑0.136％，pH8.0，溶剂为水；

缓冲液A3组成为：氯化钠0.800％，氯化钾0.020％，磷酸氢二钠0.284％，磷酸二氢钾0.027％，咪唑0.340％，pH8.0，溶剂为水

进一步，所述HefC重组蛋白在制备用于检测、预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。

进一步，HefC重组蛋白免疫产生的抗体在制备用于检测、预防或治疗幽门螺杆菌感染的生物制品中的应用。

进一步，包含HefC重组蛋白的组合物或试剂盒。

HefC重组蛋白可以直接与黏膜佐剂LT(B)₅配合使用，适用于口服免疫接种。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用，采用基因工程技术克隆表达幽门螺杆菌HefC重组蛋白，上清表达量高，分离纯化步骤简便，免疫效价高且有保护性。HefC重组蛋白可以直接与黏膜佐剂LT(B)5配合使用，适用于口服免疫接种。本发明提供的发酵能够大量上清表达HefC重组蛋白；本发明提供的纯化能够简单、快速、高得率的纯化HefC重组蛋白；本发明提供的HefC蛋白能够有效激发机体引起保护性免疫应答，从而抵御幽门螺杆菌在胃内定植，且安全有效、质量可控。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明pET29b-5载体图谱；

图2附图为本发明His标签-MBP-GST基因片段菌落PCR鉴定结果；

其中，M：DNA分子量标准；1：His标签-MBP-GST基因片段(1803bp)PCR产物；

图3附图为本发明HefC基因片段高保真PCR扩增结果；

其中，M：DNA分子量标准；1：HefC基因片段(897bp)PCR产物；

图4附图为本发明重组pET29b-5-HefC/BL21(DE)₃普通PCR鉴定结果；

其中，M：DNA分子量标准；1：HefC基因片段(897bp)PCR产物；

图5附图为本发明pET29b-5-HefC/BL21(DE)₃工程菌破菌上清经初次纯化亲和层析图；

其中，1：第一个峰为破菌上清上样峰；2-4：第二、三、四个峰为A2缓冲液洗涤杂蛋白峰；5：第五个峰为A3缓冲液洗涤杂蛋白峰；6：第六个峰为A4缓冲液洗脱得目的蛋白峰；

图6附图为本发明pET29b-5-HefC/BL21(DE)₃重组工程菌诱导表达、破菌后上清纯化结果；

其中，泳道1为蛋白质分子质量标准(Thermo Fisher，26616)；泳道2为pET29b-5-HefC/BL21(DE)₃重组工程菌破菌全菌；泳道3为pET29b-5-HefC/BL21(DE)₃重组工程菌破菌上清；泳道4为pET29b-5-HefC/BL21(DE)₃重组工程菌上清纯化第一次流穿(流穿1)；泳道5为pET29b-5-HefC/BL21(DE)₃重组工程菌上清纯化第二次流穿(流穿2)；泳道6为含促溶标签的HefC重组蛋白(样品1)；泳道7为PP酶酶切含促溶标签的HefC重组蛋白(样品2)；泳道8为HefC重组蛋白(样品3)；

图7附图为本发明重组pET28a-LT(B)₅/BL21(DE)₃普通PCR鉴定结果；

其中，M：DNA分子量标准；1：LT(B)₅基因片段(375bp)PCR产物；

图8附图为本发明pET28a-LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌破菌上清经初次纯化亲和层析图；1：第一个峰为破菌上清上样峰；2：第二峰为B2缓冲液洗脱得目的蛋白峰；

图9附图为本发明pET28a-LT(B)₅/BL21(DE)₃重组工程菌诱导表达、破菌后上清纯化结果；泳道1为pET28a-LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌破菌全菌；泳道2为pET28a-LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌破菌上清；泳道3为pET28a-LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌破菌沉淀；泳道4为pET28a-LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌上清纯化第一次流穿(流穿1)；泳道5为pET28a-LT(B)₅/BL21(DE)₃工程菌上清纯化第二次流穿(流穿2)；泳道6为蛋白质分子质量标准(ThermoFisher，26616)；泳道7为LT(B)₅重组蛋白(样品1)；

图10附图为本发明HefC重组蛋白免疫Balb/c小鼠，唾液IgA(1:5)、血清IgG(1:800)检测阳转率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种HefC蛋白的基因构建、发酵和纯化方法，HefC蛋白为幽门螺杆菌的外排泵，与幽门螺杆菌耐药机制有关。

本发明提供一种用于表达HefC重组蛋白的重组表达载体，其包含编码HefC重组蛋白、His标签、促溶蛋白的核苷酸序列和质粒序列，质粒优选地是pET29b，His标签序列为7个组氨酸(His)，促溶蛋白序列分为GST和MBP(麦芽糖结合蛋白)。

实施例1 pET29b-5双促溶标签载体构建

(一)His标签、MBP、GST基因克隆及连接

1、MBP基因来源于pMAL-c2X质粒(长沙优宝生物科技有限公司)，GST基因来源于pGEX-6P-1质粒(长沙优宝生物科技有限公司)。

2、His标签-MBP-GST的蛋白氨基酸序列选自SEQ ID NO.3，核苷酸序列如SEQ IDNO.4。

3、根据引物设计原则，设计相应引物，并加入酶切位点。引物序列见表1。

表1

引物名称	引物序列(5’-3’)	序号
			F29b-1	CATCATCATCATCATCATAAAATCGAAGAAGGTAAA	SEQ ID NO.5
R502	ATAACCTAGTATAGGGGAAGTCTGCGCGTCTTTCAG	SEQ ID NO.6
			F502	CTGAAAGACGCGCAGACTTCCCCTATACTAGGTTAT	SEQ ID NO.7
R503	CATG<u>CCATGG</u>ACAGGGGCCCCTGGAACAG	SEQ ID NO.8
			F29b-2	GGAATTC<u>CATATG</u>CATCATCATCATCATCATCAT	SEQ ID NO.9

4、His标签、MBP、GST基因连接

采用高保真PCR方法并以上述表1的引物序列扩增His标签、MBP、GST基因序列，高保真体系及程序参照说明书。高保真PCR酶(KOD-Plus-Neo)来源于东洋纺上海生物科技有限公司。

以pMAL-c2X质粒为模板，F29b-1、R502为引物进行高保真PCR，产物命名为MBP-1。

以pGEX-6P-1质粒为模板，F502、R503为引物进行高保真PCR，产物命名为GST-1。

以MBP-1、GST-1为模板，F29b-2，R503为引物进行高保真PCR，产物命名为His标签-MBP-GST，His标签-MBP-GST基因大小为1803bp。

高保真PCR后将其产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。

当高保真PCR片段与原始序列片段大小相符时，则进行琼脂糖凝胶回收，凝胶回收操作参照说明书。凝胶回收采用琼脂糖胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。

(二)His标签-MBP-GST基因与pET29b质粒连接

将His标签-MBP-GST基因、pET29b分别进行双酶切，酶切位点为Ned I/Nco I。酶切体系及程序参照说明书。Ned I/Nco I来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将双酶切的产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在成像系统下观察结果。

切胶回收需要的片段，后进行琼脂糖凝胶回收，琼脂糖凝胶回收采用琼脂糖胶回收试剂盒。

用连接酶将双酶切好的His标签-MBP-GST基因和pET29b质粒进行连接，连接体系及程序参照说明书。连接后的产物命名为pET29b-5(载体图谱见图1)，连接酶(Ligationhigh)来源于东洋纺上海生物科技有限公司。

(三)pET29b-5质粒转化DH5α

将连接后的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化体系及程序参照说明书。大肠杆菌DH5α感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物1。LB培养基组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，溶剂为水。

取100μL培养物1涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，琼脂粉1.750％，卡那霉素0.001％，溶剂为水。

在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，鉴定体系及程序参照TaKaRa Ex Taq说明书，引物为F29b-2、R503，TaKaRa Ex Taq来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

取菌落PCR扩增液10μL与10×loading buffer 1μL进行混合，后进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果如图2。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物2。LB-1培养基组成为：酵母提取物0.500％，胰蛋白胨1.000％，氯化钠1.000％，卡那霉素0.001％，溶剂为水。

将培养物2进行保种，保种参数为培养物2：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。

(四)pET29b-5质粒(含His标签-MBP-GST基因)鉴定

取培养物2进行质粒抽提，质粒抽提程序参照说明书。重组质粒DNA抽提试剂盒来源于上海捷瑞生物工程有限公司。

将抽提质粒进行普通PCR鉴定，引物为F29b-2、R503，鉴定体系及程序参照TaKaRaEx Taq说明书。

将质粒PCR扩增液10μL与10×loading buffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。

将经普通PCR鉴定符合质粒进行测序，测序引物为T7启动子和T7终止子，测序单位为生工生物工程(上海)股份有限公司。

将测序结果与原始序列进行对比，符合率为100％。

将测序符合质粒进行-20℃保存备用。

实施例2 HefC基因构建

(一)HefC基因克隆

幽门螺杆菌SS1菌株来源于中国食品药品检定研究院。

幽门螺杆菌培养参考本领域中常规的条件、配方及操作方法。取幽门螺杆菌培养物进行全基因组抽提，抽提体系及程序参照说明书，抽提产物放置-20℃保存备用。细菌基因组抽提试剂盒来源于上海捷瑞生物工程有限公司。

根据引物设计原则，设计HefC基因相应引物，并加入酶切位点Nco I、EcoR I。引物序列如下：

F61-1：5’-CATGCCATGGAAAAATTGAGCGTGGCGC-3’；SEQ ID NO.10；

R61：5’-GGAATTCTCATTTCACGTCTTCAATAGAGGT-3’；SEQ ID NO.11。

采用高保真PCR方法扩增基因序列，HefC基因大小为897bp，高保真PCR酶、高保真体系及程序参照高保真PCR酶(KOD-Plus-Neo)说明书。

将高保真产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、35min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果如图3。

当高保真PCR片段与原始序列片段大小相符时，则进行琼脂糖凝胶回收，凝胶回收采用琼脂糖胶回收试剂盒。

(二)HefC基因与pET29b-5质粒连接

将HefC基因、pET29b-5分别进行双酶切，酶切位点为NcoI、EcoRI。酶切体系及程序以及酶的来源同实施例1。

切胶回收需要的片段，琼脂糖凝胶回收操作同实施例1。

用连接酶将双酶切好的HefC基因和pET29b-5质粒进行连接，连接酶来源、酶切体系及程序同实施例1。

(三)pET29b-5-HefC转化DH5α

将连接后的产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞来源、转化体系及程序同实施例1。

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物3。LB培养基组成同实施例1。

取100μL培养物3涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成同实施例1。

在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，TaKaRa Ex Taq来源、普通PCR鉴定体系及程序同实施例1。

取菌落PCR扩增液10μL与10×loading buffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物4。LB-1培养基组成同实施例1。

将培养物4进行保种，保种参数为培养物4：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。

(四)pET29b-5-HefC质粒抽提

取过夜培养物4进行抽提质粒，此质粒命名为pET29b-5-HefC。重组质粒DNA抽提试剂盒、质粒抽提程序同实施例1。

将抽提质粒进行普通PCR鉴定，引物为F61-1、R61，鉴定体系及程序同实施例1。

取质粒鉴定普通PCR扩增液10μL与10×loading buffer 1μL进行混合，后进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。

将经普通PCR鉴定符合质粒进行-20℃保存备用。

(五)pET29b-5-HefC转化BL21(DE)₃

将pET29b-5-HefC质粒转入大肠杆菌BL21(DE)3感受态细胞，大肠杆菌BL21(DE)₃感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司，转化体系及程序同实施例1。

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物5。LB培养基组成同实施例1。

取100μL培养物5涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成同实施例1。

取菌落PCR扩增液10μL与10×loading buffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果如图4。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物6。LB-1培养基组成同实施例1。

将培养物6进行保种，保种参数为过夜培养物6：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。

实施例3 HefC大肠杆菌发酵

(一)pET29b-5-HefC大肠杆菌接种培养

将构建好的pET29b-5-HefC大肠杆菌工程菌从-80℃超低温冰箱中取出，将工程菌接种于LB-1培养基中，37℃、220rpm恒温培养过夜。LB-1培养基组成同实施例1。

(二)pET29b-5-HefC大肠杆菌扩大培养

取出过夜培养的工程菌，以1％接种比例接种于TB培养基，共接种4L，37℃、220rpm恒温培养3h。TB培养基组成为：磷酸二氢钾0.2312％，磷酸氢二钾1.2540％，酵母提取物2.4000％，胰蛋白胨1.2000％，甘油0.4000％，消泡剂0.0500％，溶剂为水。

(三)pET29b-5-HefC大肠杆菌诱导表达

扩大培养结束时，设置诱导温度为15℃，加入0.08mM IPTG进行诱导表达，诱导时间为20h。

(四)pET29b-5-HefC大肠杆菌菌体收集

诱导结束时，采用离心机离心收集菌体，离心参数为：10000g，8℃，10min，离心结束后将菌体放置在-80℃保存备用。湿菌产率为11.77g/L。

实施例4 HefC重组蛋白纯化

(一)破菌

取发酵所得菌体10～100g，按质量(g)：体积(mL)比1:15加入缓冲液A1，在4℃条件下使用剪切机对含菌体的缓冲液进行剪切悬浮。缓冲液A1组成为氯化钠0.800％，氯化钾0.020％，磷酸氢二钠0.284％，磷酸二氢钾0.027％，pH8.0，溶剂为水。

使用RO水冲洗高压均质机(AH-1500，ATS工业系统有限公司)管道。打开低温制冷系统进行预冷，备用。将预冷的悬浮菌液加入高压均质机，在480～520bar条件下破菌7～8次，后取全菌样品。

将破菌后的液体装入离心桶，10，000g离心30min，离心温度为8℃，收集上清，此为上清液1。

将上清液1使用真空抽滤泵进行过滤，收集过滤后的上清备用，此为上清液2，后取上清样品。

将沉淀用缓冲液A1进行悬浮，悬浮后取此样品，命名为沉淀。

(二)含标签HefC重组蛋白Ni填料亲和层析纯化

1、亲和层析条件：

(1)仪器系统：APPS200D纯化系统(利穗科技(苏州)有限公司)

(2)填料：Ni-NTA

(3)纯化柱规格：50mm×200mm

(4)装柱体积：100mL

2、用缓冲液A1进行平衡填料至电导、紫外平衡。

3、在4℃低温条件下上样上清液2，上样流速为10mL/min，上样1个柱体积后，取流穿，此为流穿1。

4、第一次洗涤：

(1)上样结束后，取流穿，此为流穿2。

(2)用缓冲液A1进行洗涤，洗涤体积为1～2个柱体积，流速为15mL/min。

5、第二次洗涤：缓冲液A1洗涤后，用缓冲液A2进行洗涤，洗涤至紫外值小于100mAu，流速为15mL/min。缓冲液A2组成为：氯化钠2.922％，氯化钾0.020％，磷酸氢二钠0.284％，磷酸二氢钾0.027％，咪唑0.136％，pH8.0，溶剂为水。

6、第三次洗涤：缓冲液A2洗涤后，用缓冲液A3进行洗涤，洗涤至紫外值小于70mAu，流速为15mL/min。缓冲液A3组成为：氯化钠0.800％，氯化钾0.020％，磷酸氢二钠0.284％，磷酸二氢钾0.027％，咪唑0.340％，pH8.0，溶剂为水。

7、洗脱：缓冲液A3洗涤后，用缓冲液A4进行洗脱，流速为15mL/min。当紫外值大于250mAu时开始收集样品，当紫外值小于250mAu时停止收集样品。缓冲液A4组成为：氯化钠0.800％，氯化钾0.020％，磷酸氢二钠0.284％，磷酸二氢钾0.027％，咪唑1.700％，pH8.0，溶剂为水。此样品为含标签HefC重组蛋白，取此样品进行后续SDS-PAGE鉴定，命名为样品1。pET29b-5-HefC/BL21(DE)₃工程菌破菌上清经初次纯化亲和层析结果见图5。

(三)含标签HefC重组蛋白酶切

用缓冲液A1对含标签HefC重组蛋白进行稀释5倍。

用10KD超滤管对稀释后含标签HefC重组蛋白进行离心超滤浓缩，离心条件为4000g，15min。

从-80℃超低温冰箱中取出PP酶，在4℃条件下解冻备用。

将10～30mL PP酶加入浓缩后含标签HefC重组蛋白中，4℃酶切过夜。

取过夜酶切后样品进行后续SDS-PAGE鉴定，此为样品2。

(四)HefC重组蛋白Ni柱填料亲和层析纯化

用缓冲液A1平衡填料至电导、紫外平衡。此步骤所用仪器、填料、纯化柱同步骤(二)。

在4℃低温条件下上样过夜酶切的含标签HefC重组蛋白溶液，上样流速为10mL/min。

当紫外值大于10mAu时开始收集样品。

上样结束后，继续上样缓冲液A1，上样流速为10mL/min。

当紫外值小于10mAu时停止收集样品。

(五)HefC重组蛋白浓缩

用10KD超滤管对HefC重组蛋白样品进行离心超滤浓缩，离心条件为4000g，15min。

将HefC重组蛋白浓缩至5～15mL后放入-80℃超低温冰箱保存备用。

取浓缩后HefC重组蛋白样品进行后续SDS-PAGE鉴定，此为样品3。

实施例5 HefC重组蛋白SDS-PAGE鉴定

配制12％SDS-PAGE。

取全菌、上清、流穿1、流穿2、样品1、样品2、样品3各40μL，分别加入10μL 5x SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴5min。

取上述沸水浴后样品，以10μL每孔加入SDS-PAGE，Protein Marker加样量为3μL。

加样结束后，先调节电压为80V，电泳15min；再调节电压为220v，电泳40min左右。

电泳结束后采用考马斯亮蓝法进行染色和脱色。

脱色结束后在成像系统下观察结果，结果如图6。

实施例6 HefC重组蛋白含量测定

采用福林酚法进行蛋白含量测定。

根据HefC重组蛋白SDS-PAGE电泳图预估检测样品浓度。

HefC重组蛋白测得浓度为5.10mg/mL，标准曲线的相关系数R²＝0.9981，质控回收率为104％。

实施例7 LT(B)₅重组蛋白制备

(一)佐剂LT(B)₅基因构建

1、LT(B)₅基因克隆

LT(B)₅的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

LT(B)₅基因合成于上海捷瑞生物工程有限公司。

根据引物设计原则，设计LT(B)₅基因相应引物，并加入酶切位点Nde I、Xho I。引物序列如下：

F-B01：5’-GGAATTCCATATGAACAAAGTCAAATGTTATG-3’；SEQ ID NO.14；

R-B01：5’-CCGCTCGAGCTAGTTTTCCATACTGATTG-3’；SEQ ID NO.15。

2、LT(B)₅基因与pET28a质粒连接

将LT(B)₅基因、pET28a分别进行双酶切，酶切位点为Nde I、Xho I，酶切体系及程序参照说明书。NedI/Xho I来源于宝日医生物技术(北京)有限公司。

将双酶切的产物分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在成像系统下观察结果。

切胶回收需要的片段，琼脂糖凝胶回收操作。

用连接酶将双酶切好的LT(B)₅基因和pET28a质粒进行连接，连接体系及程序参照说明书。连接酶(Ligation high)来源于东洋纺上海生物科技有限公司。

3、pET28a-LT(B)₅转化DH5α

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物7。LB培养基组成同实施例1。

取100μL培养物7涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成同实施例1。

在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，引物为F-B01、R-B01，TaKaRa Ex Taq来源、普通PCR鉴定体系及程序参见TaKaRa说明书。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物8。LB-1培养基组成同实施例1。

将培养物8进行保种，保种参数为培养物7：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。

取过夜培养物8进行抽提质粒，此质粒命名为pET28a-LT(B)₅。重组质粒DNA抽提试剂盒、质粒抽提程序参见说明书。

将抽提质粒进行普通PCR鉴定，引物为F-B01、R-B01，鉴定体系及程序参见说明书。

取质粒鉴定普通PCR扩增液10μL与10×loading buffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果。

将经普通PCR鉴定符合质粒进行-20℃保存备用。

4、pET28a-LT(B)₅转化BL21(DE)₃

将pET28a-LT(B)₅质粒转入大肠杆菌BL21(DE)₃感受态细胞，大肠杆菌BL21(DE)₃感受态细胞来源于宝日医生物技术(北京)有限公司，转化体系及程序参见说明书。

将转化产物加入500μL LB液体中，37℃、220rpm振荡培养1h，此为培养物9。LB培养基组成同实施例1。

取50μL培养物9涂布于LB琼脂平板上，37℃过夜培养。LB琼脂平板组成同实施例1。

在过夜培养LB琼脂平板上挑取菌落进行普通PCR鉴定，TaKaRa Ex Taq来源、普通PCR鉴定体系及程序参见说明书。

取菌落PCR扩增液10μL与10×loading buffer 1μL进行混合，后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为220V、30min，电泳结束后在成像系统下观察结果，结果见图7。

将菌落PCR鉴定阳性菌接种于LB-1培养基中，后在37℃、220rpm振荡培养过夜，此为培养物10。LB-1培养基组成同实施例1。

将培养物10进行保种，保种参数为过夜培养物：30％甘油比例为1:1，保存条件为-80℃。

(二)佐剂LT(B)₅大肠杆菌BL21(DE)₃发酵

1、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌接种培养

将构建好的pET28a-LT(B)₅大肠杆菌工程菌从-80℃超低温冰箱中取出，将工程菌接种于LB-1培养基中，37℃、220rpm恒温培养过夜。LB-1培养基组成同实施例1。

2、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌转种10L发酵罐培养

取出过夜培养的工程菌以10％接种比例移种于10L发酵罐中，发酵培养基为TB培养基，接种体积为5L。在37℃、溶氧浓度在30％以上恒温培养2h。TB培养基组成为：磷酸二氢钾0.2312％，磷酸氢二钾1.2540％，酵母提取物2.4000％，胰蛋白胨1.2000％，甘油0.4000％，消泡剂0.0500％，溶剂为水。

3、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌移种100L发酵罐扩大培养

将转种培养的工程菌以10％接种比例移种于100L发酵罐中，发酵培养基为TB培养基，接种体积为55L。在37℃、溶氧浓度在30％以上恒温培养6h。

4、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌诱导表达

扩大培养结束时，设置诱导温度为16℃，加入0.8mM IPTG进行诱导表达，诱导时间为10h。

5、pET28a-LT(B)₅大肠杆菌菌体收集

诱导结束时，采用离心机离心收集菌体，离心参数为：10000g，8℃，10min，离心结束后将菌体放置在-80℃保存备用。菌体产率为120g/L湿菌。

(三)佐剂LT(B)₅重组蛋白纯化

1、破菌

取发酵所得菌体300g，按质量(g)：体积(mL)比1:15加入缓冲液B1，在4℃条件下使用剪切机对含菌体的缓冲液进行剪切悬浮。缓冲液B1组成为乙二胺四乙酸二钠0.11.5％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸钠0.18％，甘油1.25％。

将沉淀用缓冲液B1进行悬浮，悬浮后取此样品，命名为沉淀。

2、LT(B)₅重组蛋白D-Galactose填料亲和层析纯化

(1)亲和层析条件：仪器系统为APPS200D纯化系统(利穗科技(苏州)有限公司)，填料为D-Galactose填料，纯化柱规格为50mm×200mm，装柱体积为100mL。

(2)用缓冲液B1进行平衡填料至电导、紫外平衡。

(3)在4℃低温条件下上样上清液2，上样流速为30mL/min，上样1个柱体积后，取流穿，此为流穿1。

(4)上样结束后，取流穿，此为流穿2。

(5)用缓冲液B1进行洗涤，流速为50mL/min，洗涤至紫外值小于30mAu。

(6)用缓冲液B2进行洗脱，流速为50mL/min。当紫外值大于100mAu时开始收集样品，当紫外值小于100mAu时停止收集样品。缓冲液B2组成为：乙二胺四乙酸二钠0.11.5％，氯化钠1.17％，碳酸钠0.03％，碳酸钠0.18％，甘油1.25％，D-半乳糖4.50％，pH8.0，溶剂为水。

洗脱样品为LT(B)₅重组蛋白，取此样品进行后续SDS-PAGE鉴定，命名为样品1。

LT(B)₅重组蛋白D-Galactose填料亲和层析纯化结果见图8。

(四)佐剂LT(B)₅重组蛋白SDS-PAGE鉴定

配制15％SDS-PAGE。

取全菌、上清、沉淀、流穿1、流穿2、样品1各40μL，分别加入10μL 5x SDS-PAGELoading Buffer，沸水浴15min。

电泳结束后采用考马斯亮蓝法进行染色和脱色。

脱色结束后在成像系统下观察结果，结果见图9。

(五)、佐剂LT(B)₅重组蛋白含量测定

采用福林酚法进行蛋白含量测定。

根据LT(B)₅重组蛋白SDS-PAGE电泳图预估检测样品浓度。

LT(B)₅重组蛋白测得浓度为2.3mg/mL，标准曲线的相关系数R²＝0.9945，质控回收率为100.8％。

实施例8 幽门螺杆菌HefC基因工程疫苗口服免疫动物

(一)口服灌胃免疫动物

1、实验动物：6周龄雌性Balb/c小鼠，120只，18g±2g。小鼠自购买后采用随机分组法对鼠进行分组，10只/笼。免疫组60只，感染组60只。过渡饲养1天进行免疫实验。

2、HefC疫苗组成：HefC抗原(HefC重组蛋白)1mg/mL，LT(B)₅为1mg/mL，溶剂为：氯化钠0.800％，氯化钾0.020％，磷酸氢二钠0.284％，磷酸二氢钾0.027％，甘油5mL/100mL，溶液pH为8.0。

3、感染组疫苗组成：LT(B)₅为1mg/mL，溶剂为：氯化钠0.800％，氯化钾0.020％，磷酸氢二钠0.284％，磷酸二氢钾0.027％，甘油5mL/100mL，溶液pH为8.0。

4、口服灌胃免疫程序：共免疫3次，免疫时间点为0天、7天、28天。

5、免疫前需提前24h断食断水。

6、口服灌胃免疫：

(1)免疫前将幽门螺杆菌疫苗从-80℃取出放置在4℃冰箱解冻备用。

(2)用无菌注射器吸取HefC疫苗，免疫剂量为HefC抗原1mg/只，LT(B)₅为1mg/只。

(3)每次免疫分3次给小鼠灌胃1mL疫苗，每次口服灌胃间隔时间不超过45min。

(4)免疫结束后2h恢复食水。

(5)每次免疫操作均相同。

(二)末次免疫后口服灌胃感染幽门螺杆菌

末次免疫后第10天进行口服灌胃幽门螺杆菌SS1活菌进行攻毒实验，每只小鼠感染剂量为4×10⁶CFU。

(三)、末次免疫结束后唾液和血样本采集

1、小鼠唾液样本采集

末次免疫结束后第10天、第38天对小鼠进行采集唾液。

唾液采集前小鼠需断食断水24h。

采集小鼠唾液前，需给小鼠腹腔注射5mg/mL毛果芸香碱20μL，采集唾液放置在-80℃保存备用。

2、小鼠血样本采集

末次免疫结束后第10天对小鼠进行采集尾静脉血，第38天采集小鼠眼眶静脉血。

3、唾液采集前小鼠需断食断水24h。

4、将采集的血室温静置4h，采用3000g离心2min，吸上清，后再重复上述操作一次，将分离的血清放置在-80℃保存备用。

(四)唾液IgA和血清IgG样本Elisa间接法检测

1、Elisa检测准备

封闭液组成如下：0.01M PBS，1％BSA，溶剂为水。

PBST洗涤液组成如下：0.01M PBS，0.05mL/100mL Tween-20，溶剂为水。

抗体稀释液组成如下：0.01M PBS，0.05mL/100mL Tween-20，0.5％BSA，溶剂为水。

底物缓冲液组成如下：磷酸氢二钠1.4％，一水合柠檬酸1％，溶剂为水。

2M硫酸组成如下：浓硫酸11.22mL/100mL，溶剂为水。

1mg/mL TMB组成如下：TMB 0.1％，溶剂为DMSO。

显色液组成如下：1mg/mL TMB：底物缓冲液：30％双氧水配制体积比例为100:900:1。

HefC抗原包被酶标板：用2μg/mL免疫抗原包被酶标板，包被条件为37℃下孵育2h，后用PBST洗涤液洗板三次。300μL/孔将封闭液加入上述酶标板，放入4℃冰箱中，封闭过夜。再用PBST洗涤液洗上述酶标板三次，将此酶标板命名为酶标板1，并放入4℃冰箱保存备用。

2、血清IgG样本Elisa检测

将血清样本用抗体稀释液以1:800进行稀释，100μL/孔加入酶标板1中，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板2。

将羊抗鼠IgG二抗用抗体稀释液1:10000进行稀释，100μL/孔加入酶标板2，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板3。

将显色液按100μL/孔加入酶标板3中，37℃、孵育15min，后按50μL/孔加入2M H₂SO₄终止液，此酶标板命名为酶标板4。

将酶标板4放入酶标分析仪中，选择OD450进行检测，将检测数据保存并进行后续分析。

3、唾液IgA样本Elisa检测

将唾液样本用抗体稀释液以1:5进行稀释，100μL/孔加入酶标板1中，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板5。

将羊抗鼠IgA二抗用抗体稀释液1:5000进行稀释，100μL/孔加入酶标板5，37℃、孵育45min，PBST洗涤液洗板三次，此酶标板命名为酶标板6。

将显色液按100μL/孔加入酶标板6中，37℃、孵育15min，后按50μL/孔加入2M H₂SO₄终止液，此酶标板命名为酶标板7。

将酶标板7放入酶标分析仪中，选择OD450进行检测，将检测数据保存并进行后续分析。

4、唾液IgA和血清IgG效价检测结果

检测结果判定：将样本(免疫组)/阴性(感染组)值≥2.1定义为阳性。将感染组效价检测阳性小鼠/感染组小鼠×100％定义为阳转率。

(1)唾液IgA效价检测结果：小鼠免疫组保护率判定终点时唾液IgA(1:5)效价检测阳转率为30％，如图10所示。

(2)血清IgG效价检测结果：小鼠免疫组保护率判定终点时血清IgG(1:800)效价检测阳转率为75％，如图10所示。

(3)通过唾液IgA和血清IgG效价检测结果说明本发明的HefC疫苗具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，为HefC疫苗用于清除胃内幽门螺杆菌定植提供了支撑。

(五)HefC疫苗保护结果

1、末次免疫结束后第38天通过平板培养法检测各组小鼠幽门螺杆菌感染定植率，以此计算HefC疫苗保护率。保护率＝(免疫组只数×感染组感染率-免疫组感染只数)/(免疫组只数×感染组感染率)×100/100。

2、幽门螺杆菌平板培养参考本领域中常规的条件、配方及操作方法。

3、幽门螺杆菌平板培养判定标准：

(1)菌落形态鉴定标准：将平板上生长出直径为0.1mm～0.5mm、呈透明针尖样大小的特征性菌落判定为幽门螺杆菌阳性，用“+”号表示；在平板上没有长出或者不是上述形态的菌落时，则判定为幽门螺杆菌阴性，用“-”号表示；当平板上长出疑似幽门螺杆菌菌落形态的菌时，用“*”表示。

(2)快速尿素酶实验认定标准：在平板菌落上滴上适量尿素酶溶液，菌落若变为红色，即此菌落尿素触酶阳性，此菌落则被判定为幽门螺杆菌阳性，用“+”号表示；若菌落尿素触酶反应不变为红色或不变色时，则判定此菌落为幽门螺杆菌阴性，用“-”号表示；当菌落尿素触酶反应颜色变为红色不明显时，则判定此菌落为疑似幽门螺杆菌，用“*”表示。

(3)快速革兰氏染色镜检鉴定标准：对菌落形态、快速尿素酶实验存疑时进行镜检，镜检标准：菌为紫色，形态为螺旋形弯曲、末端钝圆时，则判定此菌落中含有幽门螺旋杆菌，用“+”号表示；反之，若镜检菌不为紫色，且形态没有螺旋形弯曲、末端钝圆时，则判定为幽门螺杆菌阴性，用“-”号表示；若未进行此项检测，用“/”号表示。

4、幽门螺杆菌平板培养判定标准：当平板上有一个或者一个以上的菌落生长时，经菌落形态鉴定、快速尿素酶实验、快速革兰氏染色镜检，当菌落形态鉴定和快速尿素酶实验均为阳性或快速革兰氏染色镜检阳性，则判定该菌落为幽门螺杆菌，同时判定幽门螺杆菌在鼠胃内感染定植成功；当菌落形态鉴定和快速尿素酶实验均为阴性或快速革兰氏染色镜检阴性，则判定该菌落不是幽门螺杆菌，同时判定幽门螺杆菌在鼠胃内感染定植不成功。

5、HefC疫苗动物保护实验3批次平板培养检测结果：

(1)V152、V153批次平板培养结果：

V1521-1到V1521-10(10只)、V1522-1到V1522-10(10只)为免疫组(HefC疫苗)，V1533-1到V1533-10(10只)、V1534-1到V1534-10(10只)为感染组(对照组)。结果见表2-表5。

表2

表3

表4

表5

(2)V157批次平板培养结果：

V1571-1到V1571-10(10只)、V1572-1到V1572-10(10只)为免疫组(HefC疫苗)，V1573-1到V1573-10(10只)、V1574-1到V1574-10(10只)为感染组(对照组)。结果见表6-表9。

表6

表7

表8

表9

(3)V160批次平板培养结果：

V1603-1到V1603-10(10只)、V1604-1到V1604-10(10只)为免疫组(HefC疫苗)，V1605-1到V1605-10(10只)、V1606-1到V1606-10(10只)为感染组(对照组)。结果见表10-表13。

表10

表11

表12

表13

由于能直接从培养平板进行幽门螺杆菌菌落形态鉴定和快速尿素酶实验，故未进行快速革兰氏染色镜检。

6、根据平板培养结果，HefC疫苗3批次动物保护率结果见表14。

表14

批次	保护率
		V152	23.5％
V157	27.8％
		V160	20％

由表可知，HefC疫苗的3轮平均保护率为23.8％。

因此，本发明的HefC疫苗具有良好的免疫原性，能够诱导Balb/c小鼠产生黏膜免疫应答，并且能够清除小鼠体内的幽门螺杆菌定植，将黏膜佐剂LT(B)₅与HefC进行物理混合制成的幽门螺杆菌疫苗可用于预防幽门螺杆菌感染。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 成都亿妙生物科技有限公司

<120> 幽门螺杆菌HefC重组蛋白及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 299

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Lys Lys Leu Ser Val Ala Leu Phe Pro Lys Ile Asp Leu Pro Thr Val

1 5 10 15

Val Val Thr Thr Thr Tyr Pro Gly Ala Ser Ala Glu Ile Ile Glu Ser

20 25 30

Lys Val Thr Asp Lys Ile Glu Glu Ala Val Met Gly Ile Asp Gly Ile

35 40 45

Lys Lys Val Thr Ser Thr Ser Ser Lys Asn Val Ser Ile Val Val Ile

50 55 60

Glu Phe Glu Leu Glu Lys Pro Asn Glu Glu Ala Leu Asn Asp Val Met

65 70 75 80

Asn Lys Ile Ser Ser Val Arg Phe Asp Asp Ser Asn Ile Lys Lys Pro

85 90 95

Ser Ile Asn Lys Phe Asp Thr Asp Ser Gln Ala Ile Ile Ser Leu Phe

100 105 110

Val Ser Ser Ser Ser Val Pro Ala Thr Thr Leu Asn Asp Tyr Ala Lys

115 120 125

Asn Thr Ile Lys Pro Met Leu Gln Lys Ile Asn Gly Val Gly Gly Val

130 135 140

Gln Leu Asn Gly Phe Arg Glu Arg Gln Ile Arg Ile Tyr Ala Asp Pro

145 150 155 160

Thr Leu Met Asn Lys Tyr Asn Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Phe Ser Thr

165 170 175

Leu Lys Ala Glu Asn Val Glu Ile Asp Gly Gly Arg Ile Val Asn Ser

180 185 190

Gln Arg Glu Leu Ser Ile Leu Ile Asn Ala Asn Ser Tyr Ser Val Ala

195 200 205

Asp Val Glu Lys Ile Gln Val Gly Asn His Val Arg Leu Gly Asp Ile

210 215 220

Ala Lys Ile Glu Ile Gly Leu Glu Glu Asp Asn Thr Phe Ala Ser Phe

225 230 235 240

Lys Asp Lys Pro Gly Val Ile Leu Glu Ile Gln Lys Ile Ala Gly Ala

245 250 255

Asn Glu Ile Glu Ile Val Asp Arg Val Tyr Glu Ala Leu Lys His Ile

260 265 270

Gln Ala Ile Ser Pro Ser Tyr Glu Ile Arg Pro Phe Leu Asp Thr Thr

275 280 285

Ser Tyr Ile Arg Thr Ser Ile Glu Asp Val Lys

290 295

<210> 2

<211> 897

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aaaaaattga gcgtggcgct tttccctaaa attgatttgc ctacggtggt ggttactacg 60

acttatcctg gggctagcgc tgaaatcata gagagtaagg taaccgataa gattgaagaa 120

gcggtgatgg ggattgatgg gatcaaaaag gttacttcta cgagttctaa aaatgtgagt 180

atcgtcgtca ttgaatttga attagaaaag cctaatgaag aagccttaaa cgatgtgatg 240

aataaaattt cttcggtgcg ttttgatgac tccaacatta aaaaaccctc tatcaataaa 300

tttgataccg acagccaagc cattatttca ttgtttgtga gcagttcaag cgtgccggct 360

acaaccctta atgactacgc taaaaacacc atcaaaccca tgctccaaaa aatcaatggg 420

gtagggggcg tgcagctcaa cggctttagg gagcgccaga ttaggattta tgccgatccc 480

actttgatga ataaatacaa tctcacttat gcggatcttt tcagcacgct taaagcggag 540

aatgtggaaa ttgatggggg gcgcattgtc aatagccaaa gggaattgtc tattttaatt 600

aatgcgaata gttatagcgt tgcggatgta gaaaagatcc aagtgggtaa tcatgtgcgt 660

cttggcgata ttgcaaagat tgaaatcggt ttggaagaag acaacacttt tgcgagcttt 720

aaagacaaac ccggtgtgat tttagaaatc caaaagattg ccggagcgaa tgaaattgaa 780

atcgtggata gggtgtatga agctttaaaa cacattcaag ccattagccc tagctatgaa 840

atcagaccct ttttagacac cacgagctat atccgcacct ctattgaaga cgtgaaa 897

<210> 3

<211> 601

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

His His His His His His His Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile

1 5 10 15

Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys

20 25 30

Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp

35 40 45

Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro

50 55 60

Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser

65 70 75 80

Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu

85 90 95

Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala

100 105 110

Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu

115 120 125

Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys

130 135 140

Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu

145 150 155 160

Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe

165 170 175

Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn

180 185 190

Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn

195 200 205

Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe

210 215 220

Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser

225 230 235 240

Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr

245 250 255

Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly

260 265 270

Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu

275 280 285

Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys

290 295 300

Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys

305 310 315 320

Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile

325 330 335

Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr

340 345 350

Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu

355 360 365

Lys Asp Ala Gln Thr Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly

370 375 380

Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr

385 390 395 400

Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys

405 410 415

Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp

420 425 430

Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala

435 440 445

Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile

450 455 460

Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg

465 470 475 480

Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser

485 490 495

Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys

500 505 510

Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr

515 520 525

Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala

530 535 540

Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln

545 550 555 560

Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln

565 570 575

Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp

580 585 590

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Leu

595 600

<210> 4

<211> 1803

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

catcatcatc atcatcatca taaaatcgaa gaaggtaaac tggtaatctg gattaacggc 60

gataaaggct ataacggtct cgctgaagtc ggtaagaaat tcgagaaaga taccggaatt 120

aaagtcaccg ttgagcatcc ggataaactg gaagagaaat tcccacaggt tgcggcaact 180

ggcgatggcc ctgacattat cttctgggca cacgaccgct ttggtggcta cgctcaatct 240

ggcctgttgg ctgaaatcac cccggacaaa gcgttccagg acaagctgta tccgtttacc 300

tgggatgccg tacgttacaa cggcaagctg attgcttacc cgatcgctgt tgaagcgtta 360

tcgctgattt ataacaaaga tctgctgccg aacccgccaa aaacctggga agagatcccg 420

gcgctggata aagaactgaa agcgaaaggt aagagcgcgc tgatgttcaa cctgcaagaa 480

ccgtacttca cctggccgct gattgctgct gacgggggtt atgcgttcaa gtatgaaaac 540

ggcaagtacg acattaaaga cgtgggcgtg gataacgctg gcgcgaaagc gggtctgacc 600

ttcctggttg acctgattaa aaacaaacac atgaatgcag acaccgatta ctccatcgca 660

gaagctgcct ttaataaagg cgaaacagcg atgaccatca acggcccgtg ggcatggtcc 720

aacatcgaca ccagcaaagt gaattatggt gtaacggtac tgccgacctt caagggtcaa 780

ccatccaaac cgttcgttgg cgtgctgagc gcaggtatta acgccgccag tccgaacaaa 840

gagctggcaa aagagttcct cgaaaactat ctgctgactg atgaaggtct ggaagcggtt 900

aataaagaca aaccgctggg tgccgtagcg ctgaagtctt acgaggaaga gttggcgaaa 960

gatccacgta ttgccgccac tatggaaaac gcccagaaag gtgaaatcat gccgaacatc 1020

ccgcagatgt ccgctttctg gtatgccgtg cgtactgcgg tgatcaacgc cgccagcggt 1080

cgtcagactg tcgatgaagc cctgaaagac gcgcagactt cccctatact aggttattgg 1140

aaaattaagg gccttgtgca acccactcga cttcttttgg aatatcttga agaaaaatat 1200

gaagagcatt tgtatgagcg cgatgaaggt gataaatggc gaaacaaaaa gtttgaattg 1260

ggtttggagt ttcccaatct tccttattat attgatggtg atgttaaatt aacacagtct 1320

atggccatca tacgttatat agctgacaag cacaacatgt tgggtggttg tccaaaagag 1380

cgtgcagaga tttcaatgct tgaaggagcg gttttggata ttagatacgg tgtttcgaga 1440

attgcatata gtaaagactt tgaaactctc aaagttgatt ttcttagcaa gctacctgaa 1500

atgctgaaaa tgttcgaaga tcgtttatgt cataaaacat atttaaatgg tgatcatgta 1560

acccatcctg acttcatgtt gtatgacgct cttgatgttg ttttatacat ggacccaatg 1620

tgcctggatg cgttcccaaa attagtttgt tttaaaaaac gtattgaagc tatcccacaa 1680

attgataagt acttgaaatc cagcaagtat atagcatggc ctttgcaggg ctggcaagcc 1740

acgtttggtg gtggcgacca tcctccaaaa tcggatctgg aagttctgtt ccaggggccc 1800

ctg 1803

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

catcatcatc atcatcataa aatcgaagaa ggtaaa 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ataacctagt ataggggaag tctgcgcgtc tttcag 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ctgaaagacg cgcagacttc ccctatacta ggttat 36

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

catgccatgg acaggggccc ctggaacag 29

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ggaattccat atgcatcatc atcatcatca tcat 34

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

catgccatgg aaaaattgag cgtggcgc 28

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ggaattctca tttcacgtct tcaatagagg t 31

<210> 12

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser

1 5 10 15

Leu Cys Ala Tyr Gly Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu

20 25 30

Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr

35 40 45

Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys

50 55 60

Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp

65 70 75 80

Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr

85 90 95

Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys

100 105 110

Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn

115 120

<210> 13

<211> 375

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

atgaacaaag tcaaatgtta tgttttattt acggcgttac tgtcctctct gtgtgcatac 60

ggagctccgc agtctattac agaactgtgt tcggaatatc gcaacacaca aatttatacg 120

attaatgaca agattctgtc atatacggaa tcgatggcag gcaaacgcga aatggttatc 180

attacattta agagcggcgc aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatattgac 240

tcccaaaaaa aagccattga acgcatgaag gacacattac gcatcacata tctgaccgag 300

accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc cgaattcaat tgcggcaatc 360

agtatggaaa actag 375

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ggaattccat atgaacaaag tcaaatgtta tg 32

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ccgctcgagc tagttttcca tactgattg 29

Claims

1.幽门螺杆菌HefC重组蛋白在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用，其特征在于，所述HefC重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述HefC重组蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

2.权利要求1中所述的幽门螺杆菌HefC重组蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将His标签、MBP、GST基因连接，获得His标签-MBP-GST基因；所述His标签-MBP-GST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；

（2）将步骤（1）获得的His标签-MBP-GST基因与pET29b质粒连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到pET29b-5质粒；

（3）克隆HefC基因，与步骤（2）得到的pET29b-5质粒连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得pET29b-5-HefC质粒；

（4）pET29b-5-HefC质粒转入大肠杆菌BL21(DE)₃感受态细胞，经诱导纯化，获得HefC重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的幽门螺杆菌HefC重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述纯化方法如下：依次进行Ni-NTA初步纯化、PP酶酶切、Ni-NTA再纯化；纯化所用缓冲液为：缓冲液A1、缓冲液A2、缓冲液A3；

缓冲液A1组成为：氯化钠0.800%，氯化钾0.020%，磷酸氢二钠0.284%，磷酸二氢钾0.027%，pH8.0，溶剂为水；

缓冲液A2组成为：氯化钠2.922%，氯化钾0.020%，磷酸氢二钠0.284%，磷酸二氢钾0.027%，咪唑0.136%，pH8.0，溶剂为水；

缓冲液A3组成为：氯化钠0.800%，氯化钾 0.020%，磷酸氢二钠 0.284%，磷酸二氢钾0.027%，咪唑0.340%，pH8.0，溶剂为水。