CN112011555A - 一种调控沙门氏菌自裂解的重组基因、重组质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控沙门氏菌菌自裂解的重组基因、重组质粒及其应用，属于疫苗学、细菌遗传学及合成生物学领域。所述重组基因序列由启动子序列、信号肽基因序列和Tse1基因序列依次连接组成，所述重组质粒由所述重组基因与载体连接而成。利用本发明，可以使得保证沙门氏菌菌株在体外培养时能够正常生长，而进入体内时会经短暂定植后完全裂解；与传统噬菌体裂解系统相比，本发明能够更加彻底地裂解宿主菌，使细菌内容物完全释放出；并且有着更好的菌株通用性，更适合在不同血清型沙门氏菌之间或其它革兰氏细菌中进行改造；改造后，可以在同一质粒载体中调控裂解蛋白和外源性蛋白进行表达，有利于更便捷高效地递送免疫抗原或其它小分子物质。

Description

一种调控沙门氏菌自裂解的重组基因、重组质粒及其应用

技术领域

本发明属于疫苗学和细菌遗传学领域，具体涉及一种调控沙门氏菌自裂解的重组基因、重组质粒及其应用。

背景技术

疫苗接种是预防和控制人和动物传染病传播和流行的一种重要手段，传统疫苗如灭活疫苗和弱毒疫苗由于存在生产工艺限制、毒力回复和需多次免疫等弊端，逐渐呈现出被新型生物疫苗所取代的趋势。近年来发展出了一种新型的重组活载体疫苗，它以减毒的活细菌或病毒作为载体将携带的外源保护性抗原或者重组到真核表达质粒的外源核酸递送至宿主细胞内而发挥免疫作用。活载体疫苗的出现也克服了亚单位疫苗免疫原性差和核酸疫苗接种用量大以及接种方式繁琐等缺点，逐渐受到了研究学者的广泛关注和研究。其中重组减毒沙门氏菌疫苗因其可以诱导粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫已经被广泛作为疫苗载体来递送外源抗原和核酸疫苗，用于预防某些细菌、病毒、真菌的感染或治疗某些癌症，其一些脂类成分还可以发挥佐剂的作用，制成的口服疫苗便于接种，成本较低，适用于大规模接种免疫。

经过重组优化后的减毒沙门氏菌能够保持和野生型菌株相当的侵袭力并且能定植到宿主的深层组织细胞中，但是重组到载体疫苗的保护性抗原很难从菌株中释放，进而难以被免疫细胞捕获加工，难以有效诱导免疫反应，降低了疫苗的免疫效果。此外，接种疫苗后的动物体内残留的沙门氏菌还可能在环境中进行传播造成污染，这对于活细菌载体疫苗的生产应用也是一大考验。构建一种体内诱导沙门氏菌自动裂解的策略能够有效解决以上问题。目前应用的细菌裂解系统主要包括：基于延迟调控asdA基因和murA基因(参与细菌肽聚糖合成的基因)的裂解系统、基于噬菌体裂解蛋白调控的裂解系统等。但这些系统存在着菌株适用范围窄，或无法彻底裂解宿主菌的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题的至少一个，本发明旨在提供一种能够体内调控沙门氏菌裂解的系统，以提高减毒细菌载体疫苗递送外源性抗原的免疫效果，并解决细菌在宿主体内残留的问题。为此，

本发明第一方面提供一种能够调控细菌在宿主体内自裂解的重组基因，所述重组基因序列由启动子序列、信号肽基因序列和Tse1基因序列依次连接组成。

在本发明中，所述细菌是能够制备减毒疫苗的细菌，包括但不限于毒性因子基因完全突变菌、调控延迟减毒菌等。在本发明的一些实施方案中，所述细菌为沙门氏菌。在本发明的一些具体实施方案中，所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌。

在本发明中，所述启动子可以是任何能够在宿主体内诱导的启动子。

在本发明的一些实施方案中，所述启动子基因序列为鼠伤寒沙门氏菌的P_pagC启动子序列。

在本发明中，所述信号肽可以是任意能指导重组蛋白定位到细菌的周质空间的信号肽。

在本发明的一些实施方案中，所述信号肽基因序列为欧文氏菌pelBss基因序列。

在本发明的一些实施方案中，所述Tse1基因序列为铜绿假单胞菌Tse1基因序列。

铜绿假单胞菌Tse1蛋白是铜绿假单胞菌的Ⅵ型分泌系统分泌的一种肽聚糖水解因子。Ⅵ型分泌系统是革兰阴性细菌的一种独特分泌方式，在25％的革兰阴性细菌中都发现了相关基因簇。该蛋白能切割肽聚糖肽链中的酰胺键以及肽链残基中的γ-D-谷氨酰基-L-内消旋-二氨基庚二酸键，从而破坏细菌细胞壁肽聚糖层。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明第二方面提供一种能够调控细菌在宿主体内自裂解的重组质粒，所述重组质粒是将本发明第一方面任意一种重组基因与载体进行连接而成的。

在本发明中，所述载体可以是任意一种载体，优先选择高拷贝质粒载体。

在本发明的一些实施方案中，所述重组载体为pUC载体。

本发明的第三方面提供一种重组细菌，所述重组细菌包含将本发明第一方面任意一种重组基因与载体进行连接而成的重组质粒，其中，所述重组细菌不能表达asd基因。

在本发明中，所述重组细菌为重组的任意一种能够制备减毒疫苗的细菌。

在本发明的一些实施方案中，所述重组细菌为重组鼠沙门氏菌。

沙门氏菌作为一种胞内寄生菌，其一些基因的表达活性会受到巨噬细胞的刺激后而显著上调，其中两个常见的基因为ssaG和pagC。这两种基因的启动子P_ssaG和P_pagC均受到巨噬细胞的刺激后才会发生高水平的转录活性，在体外培养条件下P_pagC还会受到培养基中Mg^{2 +}的影响，在高浓度Mg²⁺条件下其转录活性受到抑制，而在低浓度Mg²⁺环境中其表现出较高的转录活性。利用内源性启动子P_pagC调控Tse1蛋白进入宿主周质空间进行表达的策略，可以构建一种适用范围较广的菌株裂解系统。

其中，不能表达asd基因的鼠伤寒沙门氏菌是利用以下方法制备得到的：以鼠伤寒沙门氏菌UK-1株为例，设计引物，PCR方法分别扩增asd基因上下游同源臂片段(各300bp左右)，通过融合PCR方式将上下游同源臂嵌合在一起，然后使用酶切连接的方式将融合片段和pRE112-T载体进行连接，将连接后的质粒转化到大肠杆菌χ7213感受态细胞中，选取测序正确的单克隆用于和UK-1菌株进行结合转移，通过两次氯霉素抗性(Cm⁺)和蔗糖筛选，挑取单克隆划线于LB平板和LB(Cm⁺)平板，菌落PCR鉴定LB平板生长而LB(Cm⁺)平板不生长的单克隆，与同源臂融合片段大小一致的单克隆即为asd基因缺失成功菌株。

在本发明中，所述载体可以是任意一种载体，优选地，为高拷贝质粒载体。

在本发明的一些实施方案中，所述载体为pUC载体。

本发明的第四方面提供本发明第一方面所述的重组基因或本发明第二方面所述的重组质粒或本发明第三方面所述的重组细菌在制备疫苗中的用途。

在本发明的一些实施方案中，所述重组基因序列还连接有外源性抗原基因序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述外源性抗原为肺炎链球菌外膜蛋白PspA的α螺旋区域。

在本发明的一些更优选实施方案中，从P_pagC基因序列开始，按5'端到3'端的顺序包含以下基因：P_pagC、pelBss、tse1、T7终止子、P_trc、blass、pspA、5ST1T2。

本发明的有益效果

相对现有技术，本发明具有以下有益技术效果：

本发明基于平衡-致死原理，在沙门氏菌中引入了Asd⁺的无抗性裂解蛋白表达质粒，通过限Mg²⁺启动子P_pagC调控铜绿假单胞菌Ⅵ型肽聚糖水解分泌蛋白进入宿主菌周质中进行表达，在低Mg²⁺或者动物体内环境中实现宿主菌的彻底裂解以及外源性抗原的有效释放，提高了沙门氏菌载体疫苗的免疫效果和实现了生物防疫功能。

利用本发明，可以使得保证沙门氏菌菌株在体外培养时能够正常生长，而进入体内时会经短暂定植后完全裂解；与传统噬菌体裂解系统相比，本发明所述裂解系统更加彻底地裂解了宿主菌；与延迟调控肽聚糖合成系统相比，本发明所述方法更适合在不同血清型沙门氏菌之间进行改造及其它可以用于减毒疫苗细菌中如大肠杆菌等，有着更好的菌株通用性；本发明所述裂解质粒经改造后，可以在同一质粒载体中调控裂解蛋白和外源性蛋白进行表达，有利于更便捷高效地递送免疫抗原。

附图说明

图1为pUC-Lysis质粒图谱。

图2为鼠伤寒沙门氏菌裂解后的扫描电镜图片。

图3为不同血清型沙门氏菌裂解系统在10μM N-minimal培养基中的生长曲线。

图4为pUC-Lysis-rPspA Rx1质粒图谱。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。下述实施例中用到的菌株和质粒的具体信息如表1所示。

表1实施例中所用到菌株和质粒的具体信息。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1能够调控沙门氏菌在宿主体内自裂解的重组质粒的构建

1引物的设计

本发明所有引物均由SnapeGene软件设计，并由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

所有引物的设计原则均基于重叠PCR原理，即两个片段连接处的引物之间需要设计25～30bp的重叠序列。

2细菌基因组和质粒的抽提

χ3761菌株和P.aeruginosa PAO1菌株基因组的抽提按照细菌基因组抽提试剂盒(天根，目录DP302)说明书的方法进行。pYA3341和pSW220质粒的抽提方式按照质粒小提试剂盒(天根，目录DP103)的说明书进行。

3目的片段的扩增与融合

以χ3761菌株基因组为模板扩增P_pagC启动子，以P.aeruginosa PAO1菌株基因组为模板扩增tse1基因，以pSW220质粒为模板扩增pelBss基因，以pYA3341为模板扩增pUC载体。使用2×PrimeSTAR Max(购自TakaRa公司)酶进行PCR反应，反应条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸10～45s(根据片段大小)，30个循环；最后72℃延伸5min。

PCR产物经电泳鉴定后，使用DNA纯化回收试剂盒(天根，目录号DP214)或者胶回收试剂盒(天根，目录号DP209)对产物进行纯化回收。

片段融合：按照摩尔数1:1:1的比例，取纯化后的P_pagC，pelBss以及tse1基因片段于PCR反应管中(不加入引物)，加入PCR反应酶(10μL体系)，进行PCR反应：72℃延伸20s，10个循环，其他反应条件和上述相同；以反应后的PCR产物为模板，加入P_pagC上游引物和tse1基因下游引物，加入PCR反应酶，进行PCR反应：72℃延伸20s，30个循环其他反应条件和上述相同，该PCR产物即为P_pagC-pelBss-tse1融合基因，其序列如下所示(SEQ ID NO.1):

ACCACTCTTAATAATAATGGGTTTTATAGCGAAATAGACTTTTTTATCGCGTGTTCAATATTTGCGTTAGTTATTATTTTTTTGGAATGTAAATTCTCTCTAAACACAGGTGATATTTATGTTGGAATTGTGGTGTTGATTCTATTCTTATAATATAACAAGAAATGTTGTAACTGATAGATATATTAAAAGATTAAATCGGAGCGGGAATAAAGCGTGCTAAGCATCATCGTGAATATGATTACAGCGCCTGCGATGGCATATAACCGTATTGCGGATGGAGCGTCACGTGAGGACTGTGAAGCACAATGCGATATGTTCTGATTATATGGCGAGTTTGCTTAATGACATGTTTTTAGCCGAACGGTGTCAAGTTTCTTAATGTGGTTGTGAGATTTTCTCTTTAAATATCAAAATGTTGCATGGGTGATTTGTTGTTCTATAGTGGCTAAACACTTTATGGTTTCTGTTAAATATATATGCGTGAGAAAAATTAGCATTCAAATCTATAAAAGTTAGATGACATTGTAGAACCGGTTACCTAAATGAGCGATAGAGTGCTTCGGTAGTAAAAATATCTTTCAGGAAGTAAACACATCAGGAGCGATAGCGGTGAATTATTCGTGGTTTTGTCGATTCGGCATAGTGGCGATAACTGAATGCCGGATCGGTACTGCAGGTGTTTAAACACACCGTAAATAATAAGTAGTATTAAGGAGTTGTTATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCACTGGATTGTTATTACTCGCGGCTCAGCCAGCGGTGGCAATGGACAGTCTCGATCAATGCATCGTCAACGCCTGCAAGAACAGCTGGGACAAGAGCTACCTGGCCGGCACCCCGAACAAGGACAACTGTTCCGGCTTCGTCCAGTCGGTGGCCGCCGAGCTGGGCGTACCGATGCCCCGCGGCAACGCCAACGCCATGGTCGACGGCCTGGAGCAGAGCTGGACCAAGCTCGCCTCCGGCGCCGAGGCCGCGCAGAAGGCGGCCCAGGGCTTCCTGGTGATCGCCGGCCTGAAGGGCCGCACCTACGGGCACGTCGCGGTGGTCATCAGCGGTCCGCTGTATCGGCAGAAGTACCCGATGTGCTGGTGCGGCAGCATCGCCGGCGCGGTCGGCCAGAGCCAGGGCCTGAAGTCGGTCGGCCAGGTGTGGAATCGCACCGACCGCGACCGCCTCAACTACTACGTCTACTCCCTGGCCAGTTGCAGCCTGCCCAGGGCCAGTTGA

4片段和载体的组装连接

按照组装酶说明书(NEB公司，目录号：E2621L)对纯化后的P_pagC-pelBss-tse1片段和pUC载体片段进行组装连接，反应条件为50℃，5min。使用此方法可快速构建pUC-Lysis质粒，质粒图谱见图1。

实施例2沙门氏菌asd基因缺失株的构建

1引物设计

分别选取鼠伤寒χ3761菌株asd基因上游和下游各300bp左右的片段作为同源臂，引物设计规则和上述相同，上游片段3’端引物和下游片段5’端引物之间需要设计25～30bp重复序列。

2同源臂扩增及融合

以χ3761菌株为模板扩增asd基因上下游同源臂片段，PCR反应条件及融合PCR反应条件均按照实施例1中所述方法进行。上下游同源臂融合完毕后，需用LA Taq酶(购自TakaRa公司)再次扩增融合片段以在产物两端加入碱基“A”，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性2min，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸5min。

3自杀质粒的构建与转化

pYA4278质粒的抽提按照实施例1中所述方法进行。使用Ahd I限制性内切酶对pYA4278进行酶切，酶切完成后，和同源臂融合片段进行连接。酶切、连接、大肠杆菌χ7213感受态的制备以及质粒转化和鉴定等操作步骤详见《分子克隆》所述方法。特别注意，χ7213菌株为asd基因缺失株，需要在额外添加50μg/mL DAP的LB培养基才能生长。DNA测序委托北京六合华大基因科技股份有限公司进行。

4同源重组以及突变株的筛选和鉴定

结合转移：将鼠伤寒沙门氏菌χ3761菌株接种到LB固体培养基上进行复苏，将带有自杀质粒的χ7213菌株接种到含有Cm(25μg/mL)和DAP(50μg/mL)的LB培养基上进行复苏。第二天，分别挑取平板上的单克隆接种至相应液体培养基中，摇床振荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右。分别取300μLχ3761菌液(受体菌)和500μL带有自杀质粒的χ7213菌液混匀于1.5mL离心管中，然后取400μL混合菌液滴入到倾斜的LB平板(50μg/mL DAP)上，正置于37℃培养箱中培养24h。

氯霉素正筛选：用接种环刮取结合转移平板上的菌苔，重新划线于LB平板(Cm⁺)上，37℃培养箱中培养12～16h。挑取单克隆菌落，再次划线于LB平板(Cm⁺)上，37℃培养箱中培养12～16h，以获得自杀质粒和沙门氏菌基因组发生整合的突变菌株。

蔗糖负筛选：挑取LB平板(Cm⁺)上长出的阳性克隆3～5个，分别接种于LB液体培养基，摇床振荡培养至OD₆₀₀＝0.3左右。将菌液分别稀释100和1000倍，各吸取100μL菌液涂布于不含NaCl和含有10％蔗糖的LB培养基上，28℃培养箱中培养24h。

突变株鉴定：挑取蔗糖板上长出的单菌落，分别在LB和LB(Cm⁺)平板上划线，37℃培养箱中培养8h。在LB(Cm⁺)平板上不生长而在LB平板上生长良好的菌株一般为正确突变株的克隆。

挑取LB板上生长的疑似突变株克隆，利用同源臂融合片段的上下游引物进行菌落PCR鉴定，与同源臂融合片段大小一致的片段为asd基因缺失成功的菌株，即为UK-1Δasd缺失株。

实施例3调控裂解系统的构建

将实施例1构建成的pUC-Lysis质粒转化到实施例2制备的UK-1ΔasdI的感受态中，即构建成调控裂解系统。

1.裂解系统体外生长曲线的测定

将UK-1Δasd+pUC-Lysis菌株以及UK-1Δasd+pYA3341菌株(对照组)接种至5ml液体LB培养基中过夜振荡培养；第二天按照1:50的比例吸取过夜菌液至新鲜的液体LB培养基中(每组两份)，培养至OD₆₀₀＝0.3～0.5之间；各组两份菌液全部离心，8000r/min离心5min，弃去上清；向一份菌体中加入适量N-minimal液体培养基(10μM Mg²⁺，低浓度)，另一份菌体中加入适量N-minimal液体培养基(50mM Mg²⁺，高浓度)，重悬菌体，5000r/min离心5min，重复三次洗去菌体表面的LB液体培养基成分；向各组两只离心管中分别加入等量的新鲜的N-minimal液体培养基(10μM或者50mM Mg²⁺)，适当稀释菌液，确保OD₆₀₀在0.3～0.5之间。恒温摇床中进行培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀值。

结果：当试验组和对照组菌株在50mM Mg²⁺(高浓度Mg²⁺)的N-minimal液体培养基培养时，它们的生长趋势几乎一致，菌株能够继续生长，培养6h后OD₆₀₀值在0.8左右；当试验组和对照组菌株10μM Mg²⁺(低浓度Mg²⁺)液体培养基培养时，对照组菌株生长趋势几乎和其在高浓度Mg²⁺N-minimal液体培养基中的生长趋势一致，而试验组在培养2h后滴度明显下降，6h后OD₆₀₀下降到0.1以下(见图3)，菌液中能观察到絮状沉淀出现，菌液澄清透明。

2裂解系统扫描电子显微镜观察

电镜观察细菌表面结构：在合适的时间点取1mL菌液，5000r/min离心5min，收集菌体，用PBS洗菌体两遍，用戊二醇(2.5％in PBS),4℃过夜固定，送去电镜公司镜检。

结果：取诱导后2h时的菌体进行镜检，可以观察到未受到诱导的杆状沙门氏菌，诱导后在逐渐吸水胀大的菌体以及已经完全吸水涨破的裂解菌体，扫描电镜照片见图2。

实施例4定植试验：体内裂解效果检测

按照1～3×10⁹CFU/20μL的剂量分别对小鼠进行口服免疫(每只小鼠口服20μLUK-1Δasd+pUC-Lysis菌株或者UK-1Δasd+pYA3341菌株)，分别在口服免疫后的第3d、7d、11d以及15d检测细菌定植的情况，每次每组取3只小鼠进行剖检，收集小鼠的肝脏、脾脏和PPs，称量重量，加入一定量的PBS缓冲液(如脾脏重量是0.1g，则加入900μL PBS)，研磨后，根据菌量稀释样品(10倍梯度稀释，10^-1至10^-6)滴于LB以及麦康凯平板，进行计数(CFU/g)。定植期间，观察小鼠生理状态。

结果：对照组小鼠在免疫一周后全部死亡，而试验组小鼠全部存活；11d后，试验组肝脏和脾脏中已经检测不到沙门氏菌，15d后PPs中也检测不到沙门氏菌。

实施例5构建不同血清型沙门氏菌的调控裂解系统

表2本实施例所用菌株的具体信息

1asd突变株的构建

不同血清型asd基因突变株的构建按照实施例2中所述方法进行。

2裂解系统的构建

将实施例1构建成的pUC-Lysis分别转化至c500Δasd、χ3700Δasd、χ4173Δasd、χ8218Δasd以及χ9241感受态细胞。

3生长曲线的测定

生长曲线的测定按照实施例4中的方法进行。

结果：pUC-Lysis质粒转入不同血清型沙门氏菌后，均在10μM Mg²⁺(低浓度Mg²⁺)液体培养基培养时出现裂解现象，6h后各菌液滴度均降至0.1左右，具体滴度变化见图3。

实施例6调控裂解系统表达并递送外源性抗原

本实施例中所用宿主菌为χ9241，递送的外源性抗原为肺炎链球菌外膜蛋白PspA的α螺旋区域(rPspA Rx1)，该蛋白在P_trc-blass模块调控下进行表达。P_trc序列具有LacI阻遏蛋白的结合位点，而χ9241菌株具有araC P_BADlacI调控模块，体外培养时额外添加阿拉伯糖可以促进LacI蛋白的表达进而抑制P_trc的转录，在体内环境中因缺少阿拉伯糖而激活P_trc的转录进而实现rPspA Rx1的调控表达。本发明不限于本实例，技术人员可选用其他启动子或终止子模块来调控外源性蛋白的表达。

实施例7双调控蛋白表达质粒的构建

以PCR方法从本实验室保存的pYA4088质粒中克隆出P_trc-blass-rPspA Rx1模块，从pET28a(+)质粒中克隆出T7终止子模块，以融合PCR的方式构建T7终止子-P_trc-blass-rPspA Rx1模块，通过组装方法，将该模块连接到pUC-Lysis质粒中(位于tse1基因下游和pUC终止子上游之间的区域)，构建成pUC-Lysis-rPspA Rx1质粒，图谱见图4。

1 裂解效果的检测

将pUC-Lysis-rPspA Rx1转化至χ9241菌株中，按照实施例1中的方法测定生长曲线，并进行扫描电镜观察。

结果：χ9241+pUC-Lysis-rPspA Rx1在10μM Mg²⁺(低浓度Mg²⁺)液体培养基培养时出现裂解现象，6h后各菌液滴度降至0.1以下；扫描电镜下观察到菌株膨大裂解。

2 rPspA Rx1蛋白的检测

分别将pYA3341和pYA4088转化至χ9241菌株中以作为空质粒和阳性对照组，将χ9241+pUC-Lysis-rPspA Rx1菌株，χ9241+pYA3341菌株以及χ9241+pYA4088菌株均接种于液体LB中，37℃过夜培养；分别吸取1mL过夜培养的菌液进行离心，加入上样缓冲液后进行SDS-PAGE电泳以及Western blot检测。

结果：经SDS-PAGE电泳并对凝胶进行考染后，χ9241+pUC-Lysis-rPspA Rx1泳道和χ9241+pYA4088泳道均在40kDa左右出现一条清晰的条带，其余条带均和空质粒对照组相同；Western blot结果显示，χ9241+pUC-Lysis-rPspA Rx1泳道和χ9241+pYA4088泳道均出现了一条和特异性rPspA Rx1蛋白抗体反应的条带，而空质粒对照组无条带出现。

3 裂解系统递送rPspA Rx1

按照1～3×10⁹CFU/20μL的剂量分别将χ9241+pUC-Lysis-rPspA Rx1菌株，χ9241+pYA3341菌株以及χ9241+pYA4088菌株口服免疫小鼠，免疫二周后，再次用相同剂量进行加强免疫，分别在二免后第2，4，6，8周采取小鼠阴道分泌物和血清样品，并进行ELISA检测。

结果：在免疫期间，所有小鼠均无明显症状出现；ELISA检测结果显示，在阴道分泌物和血清中样品中，χ9241+pUC-Lysis-rPspA Rx1组均比χ9241+pYA4088阳性对照组诱导机体产生了针对rPspA Rx1更高水平的抗体反应。这一结果说明利用裂解系统递送外源性抗原能够产生更好的免疫效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种调控细菌自裂解的重组基因、重组质粒及其应用

<130> JIA-2020-1-W-024

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1255

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accactctta ataataatgg gttttatagc gaaatagact tttttatcgc gtgttcaata 60

tttgcgttag ttattatttt tttggaatgt aaattctctc taaacacagg tgatatttat 120

gttggaattg tggtgttgat tctattctta taatataaca agaaatgttg taactgatag 180

atatattaaa agattaaatc ggagcgggaa taaagcgtgc taagcatcat cgtgaatatg 240

attacagcgc ctgcgatggc atataaccgt attgcggatg gagcgtcacg tgaggactgt 300

gaagcacaat gcgatatgtt ctgattatat ggcgagtttg cttaatgaca tgtttttagc 360

cgaacggtgt caagtttctt aatgtggttg tgagattttc tctttaaata tcaaaatgtt 420

gcatgggtga tttgttgttc tatagtggct aaacacttta tggtttctgt taaatatata 480

tgcgtgagaa aaattagcat tcaaatctat aaaagttaga tgacattgta gaaccggtta 540

cctaaatgag cgatagagtg cttcggtagt aaaaatatct ttcaggaagt aaacacatca 600

ggagcgatag cggtgaatta ttcgtggttt tgtcgattcg gcatagtggc gataactgaa 660

tgccggatcg gtactgcagg tgtttaaaca caccgtaaat aataagtagt attaaggagt 720

tgttatgaaa tacctattgc ctacggcagc cactggattg ttattactcg cggctcagcc 780

agcggtggca atggacagtc tcgatcaatg catcgtcaac gcctgcaaga acagctggga 840

caagagctac ctggccggca ccccgaacaa ggacaactgt tccggcttcg tccagtcggt 900

ggccgccgag ctgggcgtac cgatgccccg cggcaacgcc aacgccatgg tcgacggcct 960

ggagcagagc tggaccaagc tcgcctccgg cgccgaggcc gcgcagaagg cggcccaggg 1020

cttcctggtg atcgccggcc tgaagggccg cacctacggg cacgtcgcgg tggtcatcag 1080

cggtccgctg tatcggcaga agtacccgat gtgctggtgc ggcagcatcg ccggcgcggt 1140

cggccagagc cagggcctga agtcggtcgg ccaggtgtgg aatcgcaccg accgcgaccg 1200

cctcaactac tacgtctact ccctggccag ttgcagcctg cccagggcca gttga 1255

Claims (10)

1.一种能够调控细菌在宿主体内自裂解的重组基因，其特征在于，所述重组基因序列由启动子序列、信号肽基因序列和Tse1基因序列依次连接组成。

2.根据权利要求1所述的重组基因，其特征在于，所述启动子基因序列为鼠伤寒沙门氏菌的PpagC启动子序列。

3.根据权利要求1所述的重组基因，其特征在于，所述信号肽基因序列为欧文氏菌pelBss基因序列。

4.根据权利要求1所述的重组基因，其特征在于，所述Tse1基因序列为铜绿假单胞菌Tse1基因序列。

5.根据权利要求1-4任一所述的重组基因，其特征在于，所述细菌为毒性因子基因完全突变菌或调控延迟减毒菌。

6.一种能够调控细菌在宿主体内自裂解的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是将权利要求1-4任一所述的重组基因与载体进行连接而成的。

7.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述载体为高拷贝质粒载体。

8.根据权利要求5或6所述的重组质粒，其特征在于，所述重组载体为pUC载体。

9.一种重组细菌，其特征在于，所述重组细菌包含权利要求6所述的重组质粒，其中，所述重组细菌不能表达asd基因。

10.权利要求1所述的重组基因或权利要求5所述的重组质粒或权利要求7所述的重组细菌在制备疫苗中的用途。

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