CN110669714B

CN110669714B - 肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的制备与应用

Info

Publication number: CN110669714B
Application number: CN201911074627.0A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 李求春; 朱悦; 耿士忠; 任经伟; 李扬; 袁妤; 潘志明
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2039-11-06
Also published as: CN110669714A

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种肠炎沙门菌双基因敲除减毒疫苗候选株CZ14‑1ΔspiCΔnmpC的构建与应用。本发明的肠炎沙门菌减毒疫苗候选株，为将肠炎沙门菌CZ14‑1的spiC基因及nmpC基因敲除后获得。本发明还进一步公开了所述肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的制备方法与用途。本发明实现了对肠炎沙门菌减毒菌株的进一步减毒。为研制肠炎沙门菌减毒活疫苗及活载体疫苗奠定基础。

Description

肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的制备与应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的制备与应用。

背景技术

沙门菌是重要的人兽共患病原菌，能引起不同的宿主发病，主要表现为胃肠炎、败血症等等。沙门菌血清型众多，根据沙门菌感染的宿主谱差异，可将其分为宿主限制性沙门菌和宿主泛嗜性沙门菌。肠炎沙门菌是禽类中分离率最高的血清型，极易污染禽蛋、禽肉、以及乳制品，人类食用了被污染的禽制品后会产生自限性胃肠炎等症状。疫苗接种是目前防控沙门菌感染的有效措施之一，其中减毒活疫苗因免疫保护效果强于传统灭活疫苗和亚单位疫苗而成为研究热点。将沙门菌中毒力相关基因敲除构建的沙门菌减毒疫苗候选株，不仅对人和动物的致病力显著降低，且保持了较好的免疫原性。

国内常采用药物控制法，造成了细菌耐药性和药物残留等一系列问题。最近几年，许多国家逐渐转向使用疫苗预防来控制沙门菌病，取得了很好的效果，近年来，利用基因工程技术将强毒株毒力相关基因切除构建的新型减毒沙门菌作疫苗的研究备受关注，新型减毒活疫苗安全性好、不易返祖；在减毒的同时不丧失免疫原性，活疫苗可在免疫动物体内繁殖，能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应，可对病原体的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚实，免疫期长，比灭活疫苗和亚单位疫苗在预防控制沙门菌的感染方面更有优势，因而是较为理想的疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC的制备与应用。

本发明首先提供了一种肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC，为将肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis)CZ14-1的spiC基因及nmpC基因敲除后获得，所述肠炎沙门菌 CZ14-1于2019年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，菌株保藏编号为：CCTCC NO: M 2019813。

野生型肠炎沙门菌CZ14-1的nmpC基因序列的完整阅读框为SEQ ID NO:1。

进一步的，如实施例具体列举的，野生型肠炎沙门菌CZ14-1的nmpC基因中序列为SEQ ID NO:2的多核苷酸片段缺失，替换成了序列为SEQ ID NO:3的多核苷酸片段。

野生型肠炎沙门菌CZ14-1的spiC基因序列的完整阅读框为SEQ ID NO:4。

进一步的，如实施例具体列举，野生型肠炎沙门菌CZ14-1的spiC基因中，序列为SEQ ID NO:5的多核苷酸片段缺失。

进一步的，为便于筛选，本发明的肠炎沙门菌减毒疫苗候选株在nmpC基因完整阅读框缺失处插入抗性基因，如氯霉素抗性基因。更为精确的，如本发明实施例列举，可在野生型 CZ14-1的nmpC基因的完整阅读框缺失处插入氯霉素抗性基因。该肠炎沙门菌减毒疫苗候选株具有氯霉素抗性。

进一步的，所述氯霉素抗性基因的序列为SEQ ID NO:6：

本发明进一步提供了所述肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的构建方法，包括下列步骤：

(1)以肠炎沙门菌CZ14-1为出发菌株，用重组自杀质粒方法敲除CZ14-1的spiC基因，获得突变株CZ14-1ΔspiC；

(2)经采用λ-Red同源重组法将肠炎沙门菌nmpC基因敲除，获得突变株CZ14-1ΔspiCΔnmpC；进一步的，步骤2中，采用λ-Red同源重组法，将野生型肠炎沙门菌CZ14-1的nmpC基因中序列为SEQ ID NO:2的多核苷酸片段替换成了序列为SEQ ID NO:3的片段。进一步的，步骤1中，采用重组自杀质粒方法，将CZ14-1的spiC基因中序列为SEQ ID NO:5 的多核苷酸片段恰好重组替换为序列为SEQ ID NO:6的氯霉素抗性基因。

步骤2具体包括下列步骤：

a)从肠炎沙门菌CZ14-1基因组中扩增出spiC基因的上下游同源臂spiC12和spiC34片段；将获得的spiC12和spiC34片段分别T克隆构建到pMD20T载体，得到pMD-spiC12, 和pMD-spiC34；

b)将步骤a获得的pMD-spiC12和pMD-spiC34用HindIII和XhoI分别双酶切，回收pMD-spiC12和spiC34，将两回收产物连接，构建质粒pMD-ΔspiC；(ΔspiC为spiC12 和spiC34的拼接片段)。

c)将步骤b获得的重组质粒的spiC12和spiC34片段之间插入Cm抗性基因，构建质粒 pMD-ΔspiC/Cm，用BamHI单酶切酶切获得两端分别为spiC基因的上下游同源臂 spiC12和spiC34片段，中间为Cm抗性基因的重组片段；

d)将步骤c获得的重组片段克隆入自杀性质粒pGMB152，获得重组自杀性质粒pGMB152ΔspiC/Cm(保存于E.coli Spy372)；

e)将步骤d获得的重组自杀性质粒转化入合适的宿主E.coliχ7213作为供体菌，野生株 CZ14-1为受体菌进行接合转移与重组，利用抗性和蔗糖敏感性筛选获得突变株CZ14-1ΔspiC。

本发明进一步公开了本发明的肠炎沙门菌减毒疫苗候选株在制备禽类肠炎沙门菌病的活疫苗上的用途。

所述禽类肠炎沙门菌病为鸡肠炎沙门菌病。

本发明还公开了一种鸡肠炎沙门菌病疫苗，包括上述肠炎沙门菌减毒疫苗候选株。

本发明实现对肠炎沙门菌减毒菌株进一步减毒。为研制肠炎沙门菌减毒活疫苗及活载体疫苗奠定基础。

有益效果：

肠炎沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌，不仅能引发动物疾病，也能通过污染的食品传递给人类，引起人急性胃肠炎等疾病。疫苗接种是目前防控沙门菌感染的有效措施之一，其中减毒活疫苗因免疫保护效果强于传统灭活疫苗和亚单位疫苗而成为研究热点。目前国外已有用于禽副伤寒病的沙门菌病疫苗，但是价格昂贵，且免疫的鸡群仍然会感染肠炎沙门菌。因此我们选择国内亲养殖过程中分离获得的菌株作为亲本株，将肠炎沙门菌中毒力相关基因敲除，构建的沙门菌减毒疫苗候选株。通过毒力实验、保护力实验和安全实验等证实改疫苗候选株不仅对动物的致病力显著降低，且提供了良好的免疫原性和免疫保护力。本发明实现对肠炎沙门菌减毒菌株的进一步减毒，可广泛应用于禽沙门菌病的防控，预测经济效益达1000 万，为研制肠炎沙门菌减毒活疫苗及活载体疫苗奠定基础。

附图说明

图1为PCR验证图；

其中图1A.自杀质粒pGMB152-ΔspiC/Cm的双酶切验证。

M:markerλ14；

Lane1:质粒PGMB152-ΔspiC/Cm被XhoI和SalI双酶切后的片段

Lane2:质粒PGMB151被XhoI和SalI双酶切后的片段

图1B第一次同源重组后利用引物spiC-YZ-F/R进行PCR验证

M：DL2000 marker

Lane1-3:第一次单交换后的PCR产物

Lane4：野生株CZ14-1

图1C.突变株CZ14-1ΔspiC的内部引物验证

M:DL2000 marker；

Lane1-2:利用引物spiC-NYZ-F/R对CZ14-1ΔspiC进行验证；

Lane3:利用引物spiC-NYZ-F/R对野生株CZ14-1进行验证。

图1D.突变株CZ14-1ΔspiC的外部引物验证

M:DL2000 marker；

Lane1-3:利用引物spiC-WYZ对CZ14-1ΔspiC进行验证；

Lane4：利用引物spiC-WYZ对野生株CZ14进行验证。

图1E.目的基因nmpC的扩增与纯化

M:DL2000 marker

Lane1：目的基因nmpC的扩增片段

图1F.突变株CZ14-1ΔspiCΔnmpC/Cm的内部引物nmpC-NB-F/R验证

M:DL2000 marker

Lane1：利用引物nmpC-NB-F/R对CZ14-1ΔspiCΔnmpC/Cm的进行PCR验证；

Lane2：利用引物nmpC-NB-F/R对野生株CZ14-1进行PCR验证

图1G.突变株CZ14-1ΔspiCΔnmpC/Cm的外部引物nmpC-WB-F/R验证

M:DL2000 marker

Lane1：利用引物nmpC-WB-F/R对CZ14-1ΔspiCΔnmpC/Cm的进行PCR验证；

Lane2：利用引物nmpC-WB-F/R对野生株CZ14-1进行PCR验证

图2.生长曲线

图3.细菌在鸡肝脏内的分布与定殖

图4.细菌在鸡脾脏内的分布与定殖

图5.细菌在鸡回肠内的分布与定殖

图6.细菌在鸡盲脏内的分布与定殖

图7.缺失株免疫后血清抗水平的动态变化

图8-11缺失株免疫后细胞因子表达量分析

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

本发明的肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的具体的构建方法是：将spiC上下游序列分别连接到氯霉素抗性基因(Cm^R)两端，将连接片段构建至自杀质粒pGMB152，经接合转移导入肠炎沙门菌CZ14-1中，利用蔗糖压力筛选和蓝白斑筛选，肠炎沙门菌spiC基因的全部阅读框缺失，获得阳性转化子命名为CZ14-1ΔspiC。再利用随后利用PCR技术扩增出两端与肠炎沙门菌基因nmpC上、下游序列同源且中间为氯霉素抗性基因的DNA片段电击转化入含有质粒pKD46的CZ14-1ΔspiC中，分别获得替换nmpC的阳性克隆(CZ14-1ΔspiCΔnmpC::Cat)，再电转入温度敏感性型质粒pCP20消除氯霉素抗性基因，通过PCR以及测序鉴定，成功构建了肠炎沙门菌双基因缺失株CZ14-1ΔspiCΔnmpC。以3日龄海兰白雏鸡和SPF雏鸡为模型，比较基因缺失突变株与野生株之间毒力的差异，致死率试验结果表明，CZ14-1ΔspiCΔnmpC 突变株的毒力显著低于野生型CZ14-1，是潜在的肠炎沙门菌减毒候选活疫苗。

本发明中所说的CZ14-1，是本实验室从江苏省海安市某种鸡场中分离到的一株肠炎沙门菌。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC的制备

1.1.1靶基因的扩增

根据GenBank上已发表的沙门菌基因组序列，用引物设计软件Primer5.0设计出特异性的引物，如表2所示。以肠炎沙门菌C50041基因组DNA为模板，PCR方法扩增spiC的PCR扩增体系如下表：

表1 spiC基因PCR扩增体系

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，64℃退火30s，72℃延伸45s，共30 个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

表2：扩增靶基因引物序列

1.1.2 T-A克隆及鉴定

反应结束后利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒回收纯化PCR产物，回收操作按 TAKARA Fragment Purification Kit说明书进行。回收产物与pMD-18T载体连接，连接体系 (10μL)：回收产物4.5μL，pMD18-T载体0.5μL，Solution I 5.0μL，16℃金属浴连接过夜。将连接产物转化入大肠杆菌感受态DH5α，在Amp、IPTG和X-gal的固体LB培养基上37℃培养，经蓝白斑筛选，挑取单个白斑菌落培养，提取质粒PCR(所用引物：spiC-F/R)鉴定， PCR方法同上，阳性样品送测序。

1.2自杀质粒的构建

1.2.1引物

根据GenBank上已发表的沙门菌基因组序列，用引物设计软件Primer 5.0设计出特异性的spiC上下游序列引物。

表3：spiC基因敲除引物

1.2.2 spiC上下游同源臂spiC12、spiC34片段的扩增

以肠炎沙门菌CZ14-1基因组DNA为模板，PCR方法扩增spiC上下游同源臂spiC12、spiC34片段。spiC12、spiC34的PCR扩增体系(50μL)同前。

PCR反应条件如下:94℃预变性5min；94℃变性45s，64℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

反应结束后利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒回收纯化PCR产物，回收操作按 Fragment purification Kit说明书进行。回收产物与pMD-18T载体连接，连接体系(10μL)：回收产物4.5μL，pMD18-T载体0.5μL，Solution I 5.0μL，16℃金属浴连接过夜。将连接产物转化入大肠杆菌感受态DH5α，在Amp、IPTG和X-gal的固体LB培养基上37℃培养，经蓝白斑筛选，挑取单个白斑菌落培养，提取质粒PCR(所用引物分别为spiC12-F/R和 spiC34-F/R)、酶切鉴定，PCR方法同上。阳性克隆送测序，测序正确的质粒分别命名为 pMD-spiC12、pMD-spiC34。

1.2.3同源重组片段的拼接与鉴定

1.2.3.1 spiC12和spiC34片段的拼接

小量提取pMD-spiC12、pMD-spiC34质粒，分别用XhoI和Hind III限制性内切酶进行双酶切，酶切体系(20μL)：质粒(pMD-spiC12/pMD-spiC34)8μL，Hind III 1μL，XhoI 1μL，10×M Buffer 2μL，灭菌的ddH₂O 8μL，37℃水浴酶切2h。质粒pMD-spiC12双酶切为一个片段(约3.5kb)，质粒pMD-spiC34双酶切为两个片段(约520bp和2.7kb)。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收纯化pMD-spiC12的3.5kb片段和pMD-spiC34的520bp片段，将两者16℃金属浴连接过夜。连接体系(10μL)：T4 DNA连接酶1μL，10×连接Buffer 1μL， pMD-spiC12的3.5kb片段2μL，pMD-spiC34的520bp片段6μL。连接产物转化DH5α，涂布 Amp(100μg/mL)LB固体平板，挑取单菌落培养，提取质粒进行PCR(所用引物为ΔspiC-YZ-F/R)、酶切鉴定。鉴定正确的质粒命名为pMD-ΔspiC。

1.2.3.2 Cm抗性基因与pMD-ΔspiC的拼接

将重组质粒pMD-ΔspiC与已构建好的pMD-Cm质粒，分别进行XhoI限制性内切酶单酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收纯化pMD-ΔspiC的约4.0kb片段与pMD-Cm的约1.4kb片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α，在含Amp(100μg/mL)和Cm(50μg/mL)的固体 LB平板上培养，挑取单菌落培养，PCR(所用引物为ΔspiC-YZ-F/R)、酶切鉴定。鉴定正确的重组质粒命名为pMD-ΔspiC/Cm。

1.2.3.3自杀性质粒的构建及鉴定

将自杀性质粒pGMB152经XhoI限制性内切酶单酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化pGMB152约7800bp载体片段，质粒pMD-ΔspiC/Cm经SalI限制性内切酶酶切酶切成单个片段，回收纯化后，再用XhoI限制性内切酶酶切，回收约2.7kb片段，与pGMB152约7800bp回收片段经T4 DNA连接酶连接。连接产物转化入E.coli.Spy372感受态细胞，在Amp(100μg/mL)、Sm(100μg/mL)、Cm(100μg/mL)的固体LB平板上培养。挑取单菌落培养，提取质粒PCR(所用引物为ΔspiC-YZ-F/R)、酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为 pGMB152-ΔspiC/Cm，如图1A所示。

1.3肠炎沙门菌ΔCZ14-1spiC突变株的筛选与鉴定

1.3.1同源重组

将重组质粒pGMB152-ΔspiC/Cm转化入E.coliχ7213，在Amp(100μg/mL)、Sm (100μg/mL)、Cm(100μg/mL)、DAP(50mg/mL)的固体LB平板上培养，阳性菌命名为χ7213 (pGMB152-ΔspiC/Cm)。以χ7213(pGMB151-ΔspiC/Cm)为供体菌，肠炎沙门菌CZ14-1为受体菌，进行接合转移。第一次同源重组：分别挑取受体菌CZ14-1单菌落于LB液体培养基中，供体菌χ7213(pGMB151-ΔspiC/Cm于含Amp(100μg/mL)、Sm(100μg/mL)、Cm(100μg/mL)、 DAP(50mg/mL)的LB液体培养基中，37℃，200r/min振摇过夜培养后，菌液用无菌的PBS 洗两遍后悬浮，按供体菌和受体菌比例为4:1将受体菌与供体菌悬液混合，将0.22μm无菌滤膜贴于含DAP的LB固体平板上，将混合的悬液滴于滤膜上，平板于37℃培养过夜(约24h)。用无菌的PBS将滤膜上生长的菌苔洗下，涂布于含Amp(100μg/mL)、Sm(100μg/mL)、Cm (100μg/mL)、DAP(50mg/mL)三种抗生素的LB平板，37℃培养过夜。

第二次同源重组：将第一次同源重组所得阳性细菌用无菌的10mM MgSO₄溶液洗两遍后悬浮，稀释涂布于无NaCl的固体LB培养基(含Cm 50μg/mL、10％蔗糖)，37℃培养过夜(约不少于24h)，筛选Cm^RSm^RAmp^R阳性的菌落，通过含10％蔗糖的无NaCl液体LB培养基多次传代(5-7代)，菌液用无菌10mM MgSO₄溶液洗两遍后悬浮，涂布含Cm、10％蔗糖的无NaCl的平板，筛选Cm^RSm^SAmp^S的细菌。应用引物ΔspiC-YZ-F/R对以上筛选的细菌进行PCR验证，经测序鉴定正确，且未发生突变。验证正确的细菌命名为CZ14-1ΔspiC，如图1B所示。

1.4肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC缺失株的构建：

1.4.1.1引物

根据GenBank上已发表的沙门菌基因组序列，用引物设计软件Primer5.0设计出特异性的nmpC上下游序列引物，如表4。

表4：扩增nmpC基因上下游序列的引物

1.4.1.2 nmpC基因PCR片段的扩增与纯化

λ-Red同源重组的辅助质粒pKD3为模板，nmpC-QC为引物分别扩增，反应体系如下：

表5：PCR反应体系

PCR反应条件如下：

94℃预变性5min；94℃变性45sec，64℃退火45sec，72℃延伸60sec，共30个循环；72℃延伸10min。反应结束后利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒回收纯化PCR 产物，回收操作按Fragment purification Kit说明书进行。结果如图1E所示。

1.4.1.3λ-Red同源重组系统的诱导表达和感受态细胞的制备

将编码λ-Red同源重组系统的质粒pKD46电转化入肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiC中，涂布于含有Amp(100μg/mL)的LB固体平板上，30℃培养24h，挑取单菌落，接种于含有Amp (100μg/mL)的LB液体培养基中30℃振荡培养过夜，以1:100的接种比例转接于50mL的LB 培养基中扩大培养，30℃振荡培养至OD₆₀₀约0.2时，加入终浓度为30mmol/L的L-阿拉伯糖，继续置于30℃恒温摇床中振荡培养至OD₆₀₀约为0.3-0.6，诱导同源重组酶Exo、Bet和Gam 的充分表达。将菌液冰浴20min后，5000rpm，10min，4℃，离心收集菌体，用无菌SW洗涤3次，最后将菌体重悬于80μL预冷的无菌10％甘油中，-70℃冻存，作为打靶基因电转化的感受态细胞。

1.4.1.4目的基因nmpC的替换和鉴定

将100ng纯化的PCR片段与感受态细胞混合加入直径为1mm的eppendorf电极杯中，冰浴3min，在电压1.8KV的参数下电击4-5s，电击后迅速加入900μL预热的SOC培养基，移液枪混匀后转移至1.5mL指型管中，置于37℃摇床中振荡培养2h，涂布于含有氯霉素的 LB固体平板上，置于37℃恒温培养箱中静置培养过夜，筛选Cm^R转化子，用ΔnmpC-NB-F/R 和ΔnmpC-WB-F/R引物进行PCR验证，验证正确的菌落命名为CZ14-1ΔspiCΔnmpC/Cm。如图1F和图1G所示。

1.4.1.5 Cm抗性基因的敲除

挑取CZ14-1ΔspiCΔnmpC/Cm单菌落于液体LB培养基中过夜培养，次日以1:100的接种比例转接于30mL液体LB培养基中，培养至OD₆₀₀约为0.3-0.6。菌液冰浴20min后，5000rpm，10min离心收集菌体，无菌SW洗涤3次，最后将菌体重悬于80μL预冷的无菌10％甘油中， -70℃冻存。取2μL温度敏感型质粒pCP20，与80μL CZ14-1ΔspiCΔnmpC/Cm感受态细菌混合，转移到预冷的电极杯中，在电压1.8KV的参数下电击4-5s，电击后迅速加入900μL预热的SOC 培养基，移液枪混匀后转移至1.5mL指型管中，置于30℃摇床中振荡培养2h，将转化产物涂布含有Amp和Cm双抗LB固体平板，置于30℃恒温培养箱中过夜培养，筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆转接至无抗性的LB液体培养基中，42℃恒温摇床振荡培养消除pCP20质粒，连续传3-5代，于LB固体平板上三区划线分离单菌落，挑取单菌落接种于无抗性的LB液体培养基中，菌液送测序进行验证。

实施例2：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC的生物学分析

CZ14-1来源：本实验室从江苏省海安市某种鸡场中分离到的一株肠炎沙门菌，已通过全基因组测序。

2.1.生化鉴定

将肠炎沙门菌CZ14-1ΔspiCΔnmpC以及野生株CZ14-1分别三区划线接种于LB固体平板，然后挑取单菌落转接于生化鉴定板，上机检测，进行各项生化指标鉴定，生化鉴定结果如表6所示。结果表明，野生株和两株缺失株之间的生化特性无较大差异。

表6肠炎沙门菌的生化鉴定结果

2.2.生长曲线

将调整至相同浓度的CZ14-1ΔspiCΔnmpC缺失株以及野生株CZ14-1于37℃摇床中振荡培养，每隔一小时测定OD₆₀₀，根据所记录的数据绘制生长曲线。结果表明，野生株和两株缺失株之间的体外生长速度无明显差异(图2)。

实施例3：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC的毒力评价

3.1肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC的LD50测定

细菌的培养：细菌在LB平板上37℃静置培养24h，挑取10个饱满单菌落在LB平板上全板划线，37℃静置培养5h，用灭菌PBS将LB平板上的细菌刮下，将细菌浓度调节到10⁹CFU/ml。

将野生株和缺失株分别以不同的浓度梯度肌肉注射接种3日龄的SPF雏鸡，每只雏鸡的接种量为100μL，每组10只，连续观察2周鸡群的生存情况。结果显示(表7)，与野生株CZ14-1相比，CZ14-1ΔspiCΔnmpC缺失株的毒力下降了约710倍。

表7：野生株CZ14-1和突变株对3日龄SPF鸡的致死率：

缺失株和野生株对3日龄海兰白雏鸡的致死率试验

将野生株和两株缺失株分别以不同的浓度梯度肌肉注射接种3日龄的海兰白雏鸡，每只雏鸡的接种量为100μL，每组10只，连续观察2周，观察鸡群的生存情况。结果显示，与野生株CZ14-1相比，CZ14-1ΔspiCΔnmpC缺失株在海兰白雏鸡上的毒力下降了约2030倍。

表8：野生株CZ14-1和突变株CZ14-1ΔspiCΔnmpC对3日龄海兰白雏鸡的致死率：

3.2肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC的鸡体内定殖能力评价

分别挑取野生株CZ14-1和CZ14-1ΔspiCΔnmpC缺失株单菌落于液体LB培养基中，37℃， 180rpm振荡培养16h，分别将2株细菌以1:500的比例扩大培养，37℃，180rpm振荡培养16h，将细菌用无菌PBS洗涤3次，调整细菌的浓度为1×10⁵CFU/mL。

3日龄的海兰白雏鸡随机分为2组，每组30只。将2株细菌CZ14-1和CZ14-1ΔspiCΔnmpC 缺失株以肌肉注射的途径免疫3日龄的海兰白雏鸡，免疫剂量为1×10⁵CFU/羽。

分别在接种后1、3、7、14、21天对各组鸡群进行剖检，每组5只，无菌取其肝脏、脾脏、回肠、盲肠，称重后加入1mL无菌的PBS彻底均质，取100μL均质好的原液连续倍比稀释。选择3个合适的稀释度，每个稀释度取10μL滴板(BG固体平板)，做3个重复，置于37℃恒温培养箱中静置培养12h，细菌计数，计算细菌在内脏器官中的载菌量。结果显示，肝脏和回肠中的细菌在免疫后21天能够基本清除(图3-6)。

实施例5：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC的免疫学效应分析

5.1肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC引发的抗体水平测定

将减毒株CZ14-1ΔspiCΔnmpC免疫组和PBS对照组的血清，进行间接ELISA检测IgG。结果如图7：免疫后第1周即可刺激产生IgG抗体，之后抗体水平逐渐上升，并在免疫后第5 周达到高峰。

5.2肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC引发的细胞因子表达分析

5.2.1鸡细胞因子引物的合成

合成检测鸡细胞因子表达水平的探针法qRT-PCR引物。引物由南京金斯瑞公司合成。

表9鸡细胞因子qRT-PCR引物

5.2.2鸡脾脏总RNA提取与cDNA合成

细菌的培养及处理同实施例4。鸡的免疫同实施例4。设立未免疫的空白对照组。

分别在人工感染后的7、14、21天采集脾脏，将组织样品浸泡在RNA保护剂中，放置于-70℃冰箱中保存。

取出-70℃冰箱中保存的组织样品，按照QIAGEN总RNA小量提取试剂盒说明书的要求提取脾脏的总RNA。每个时间点检测3份样品，利用One-drop检测总RNA的浓度。

将提取的RNA按照PrimeScript^TMRT reagent kit的说明书步骤，反转录合成cDNA(表 10-11)，反应体系如下：

表10：gDNA的去除体系

反应条件为：42℃，2min

表11.cDNA的合成体系

反应条件为37℃15min，85℃5s。反转录后的cDNA置于-20℃保存备用。

5.2.3 qRT-PCR检测细胞因子

将cDNA稀释成适当浓度，以cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测鸡脾脏中各个细胞因子的表达量。PCR反应体系如下(20μL)：

表12 qRT-PCR反应体系

荧光定量PCR反应体系如下：95℃30s；95℃5s，60℃34s，共40个循环。

免疫组与未免疫组的鸡群，在免疫后的7、14、21天取出脾脏组织，qRT-PCR检测细胞因子的相对表达量，并与未免疫的PBS组相比较。图8显示了IFN-γ在试验期间的表达量变化，在免疫后7-21天内，其表达量稳定上调(约5-20倍)，发挥清除细菌的作用，与脾脏内菌量的消减变化相符合。试验期间CZ14-1ΔspiCΔnmpC缺失株免疫组的IFN-γ在各个时间点的表达量均显著高于PBS对照组(P<0.01)，但与CZ14-1ΔspiCΔrfaL缺失株之间的差异不明显 (P>0.05)。图9反映了试验期间IL-1β的表达量变化，免疫后7-14天，脾脏内的细菌含量较高，引起了IL-1β的高水平表达，CZ14-1ΔspiCΔnmpC缺失株免疫组的表达量均显著高于PBS 组(P<0.01)。随着脾脏内细菌的逐渐消减，IL-1β的表达量逐渐下调，免疫后21天，免疫组 IL-1β的表达量与PBS组无明显差异(P>0.05)。IL-6能够刺激B细胞增殖，促进体液免疫，在免疫初期CZ14-1ΔspiCΔnmpC缺失株的表达量与PBS组相比无明显差异(P>0.05)，攻毒后 14-21天，表达量显著上升(P<0.001)，IL-6发挥抗感染作用，促进抗体的分泌(图10)。趋化因子CXCLi1在各个时间点的表达量与PBS组相比无明显差异(P>0.05)(图11)。

实施例6：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株CZ14-1ΔspiCΔnmpC的免疫保护力评价

将100只海兰白蛋鸡随机分为2组，每组50只。又将每组进一步划分为观察组20只和剖检组30只。将CZ14-1ΔspiCΔnmpC缺失株以肌肉注射的方式接种7日龄的海兰白蛋鸡，14 日龄进行加强免疫，免疫剂量均为1×10⁵CFU/羽，同时设立未免疫的PBS对照组。免疫后连续3周内对每组鸡群的体重变化进行观测。加强免疫后1周对鸡群进行人工感染，以肌肉注射的方式感染野生株CZ14-1，剂量为2×10⁹CFU/mL。在攻毒后的14天内，CZ14-1ΔspiCΔnmpC 缺失株免疫后的鸡群有4只死亡，保护率达到80％(表13)。

表13缺失株CZ14-1ΔspiCΔnmpC针对野生株攻毒的免疫保护效力

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的制备与应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 633

<212> DNA

<213> 肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)

<400> 1

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actcttgaat ggttcttgtc tcattgccac 60

attcataagt acccgtcaaa gagcacgctg attcaccagg gtgaaaaagc agaaacgctg 120

tactacatcg ttaaaggctc cgtggcagtg ctgatcaaag atgaagaagg gaaagaaatg 180

atcctttctt atctgaatca gggtgatttt attggtgaac tgggcctgtt tgaagaaggc 240

caggaacgca gcgcctgggt acgtgcgaaa accgcatgtg aggtcgctga aatttcctac 300

aaaaaatttc gccaattaat ccaggtcaac ccggatattc tgatgcgcct ctcttcccag 360

atggctcgtc gcttacaagt cacctctgaa aaagtaggta acctcgcctt ccttgacgtc 420

accgggcgta tcgctcagac gctgctgaat ctggcgaaac agcccgatgc catgacgcac 480

ccggatggga tgcagatcaa aatcacccgt caggaaatcg gccagatcgt cggctgctcc 540

cgcgaaaccg ttggtcgtat tttgaaaatg ctggaagatc aaaacctgat ctccgcgcat 600

ggcaagacca tcgtcgtcta cggcacccgt taa 633

<210> 2

<211> 637

<212> DNA

<213> 肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)

<400> 2

tggcaaaccg caaacagacc cgactcttga atggttcttg tctcattgcc acattcataa 60

gtacccgtca aagagcacgc tgattcacca gggtgaaaaa gcagaaacgc tgtactacat 120

cgttaaaggc tccgtggcag tgctgatcaa agatgaagaa gggaaagaaa tgatcctttc 180

ttatctgaat cagggtgatt ttattggtga actgggcctg tttgaagaag gccaggaacg 240

cagcgcctgg gtacgtgcga aaaccgcatg tgaggtcgct gaaatttcct acaaaaaatt 300

tcgccaatta atccaggtca acccggatat tctgatgcgc ctctcttccc agatggctcg 360

tcgcttacaa gtcacctctg aaaaagtagg taacctcgcc ttccttgacg tcaccgggcg 420

tatcgctcag acgctgctga atctggcgaa acagcccgat gccatgacgc acccggatgg 480

gatgcagatc aaaatcaccc gtcaggaaat cggccagatc gtcggctgct cccgcgaaac 540

cgttggtcgt attttgaaaa tgctggaaga tcaaaacctg atctccgcgc atggcaagac 600

catcgtcgtc tacggcaccc gttaattccg tcagaat 637

<210> 3

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcgagatgg gaattagcca tggtccatat gaatatcctc cttagttcct attccgaagt 60

tcctattctc tagaaagtat aggaacttcg aagctgctcc agcctacacc tcgag 115

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> 肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)

<400> 4

atgctggcag ttttaaaagg cattgcatta attcaggata tcaaggccga aggtaatagc 60

cgatcctgga taatgactat tgatgggcat cctgccagag gagaaatttt ctcagaagca 120

ttttctattt ctttgttctt aaatgacctg gaaagcttac ctaagccttg tcttgcctat 180

gtgacactac tgcttgcagc acacccggac gtccatgatt atgctataca gctcacagcg 240

gatgggggat ggttaaacgg ttattatacc acaagtagta gctctgagct tattgctatt 300

gagatagaaa aacacctggc tttaacttgc attttaaaaa atgtaatacg caatcaccat 360

aaactttatt cgggtggggt ataa 384

<210> 5

<211> 508

<212> DNA

<213> 肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)

<400> 5

atagaaactc ccatttatgt ctgaggaggg attcatgctg gcagttttaa aaggcattcc 60

attaattcag gatatcaggg ccgaaggtaa tagccgatcc tggataatga ctattgatgg 120

gcatcctgcc agaggagaaa ttttctcaga agcattttct atttctttgt tcttaaatga 180

cctggaaagc ttacctaagc cttgtcttgc ctatgtgaca ctactgcttg cagcacaccc 240

ggacgtccat gactatgcta tacagctcac agcggatggg ggatggttaa acggttatta 300

taccacaagt agtagctctg agcttattgc tattgagata gaaaaacacc tggctttaac 360

ttgcatttta aaaaatgtaa tacgcaatca ccataaactt tattcgggtg gggtataaaa 420

tggtagtaaa taaacgttta atcttaattt tactatttat actcaataca gcaaagagtg 480

atgagttatc atggaaaggt aatgactt 508

<210> 6

<211> 1506

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 6

ctcgagatgg gaattagcca tggtccatat gaatatcctc cttagttcct attccgaagt 60

tcctattctc tagaaagtat aggaacttca gagcgctttt gaagctgggg tgggcgaaga 120

actccagcat gagatccccg cgctggagga tcatccagcc ggcgtcccgg aaaacgattc 180

cgaagcccaa cctttcatag aaggcggcgg tggaatcgaa atctcgtgat ggcaggttgg 240

gcgtcgcttg gtcggtcatt tcgaacccca gagtcccgct cagaagaact cgtcaagaag 300

gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca cgaggaagcg 360

gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg ctatgtcctg 420

atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc ggccattttc 480

caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct cgccgtcggg 540

catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat gctcttcgtc 600

cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct cgatgcgatg 660

tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc 720

atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc 780

cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt cgagcacagc 840

tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt cctgcagttc 900

attcaggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc 960

cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc 1020

ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac 1080

gatcctcatc ctgtctcttg atcagatctt gatcccctgc gccatcagat ccttggcggc 1140

aagaaagcta tccagtttac tttgcagggc ttcccaacct taccagaggg cgccccagct 1200

ggcaattccg gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc 1260

ccactgcaag ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag 1320

tagctgacat tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgttccgc 1380

ttcctttagc agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgggggatc ttgaagttcc 1440

tattccgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc gaagcagctc cagcctacac 1500

ctcgag 1506

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taggatccat gctggcagtt ttaaaaggca tt 32

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tactcgagtt ataccccacc cgaataaagt ttatg 35

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaagaattcg tcgacggatc cgcgacactg ccgttcccca g 41

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaactcgagc accctttatg ccagacaaat gcca 34

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaactcgagc aaattcgctc acaaccacat ccg 33

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaagaattcg tcgacggatc cgctgcagta atcacagata gcagcc 46

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accggtggtc caggcggaat 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctttcctcc agttgcctgt tgc 23

<210> 15

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttggcagcag gcgttgtaaa tgcagccgag gtagtgtagg ctggagctgc ttc 53

<210> 16

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

actttagccg ctttggtgaa gtcgctgtcg tccagatggg aattagccat ggtcc 55

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgataacgg aagtgatggt g 21

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttgcttacga catcggcg 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccgctgtacc ttgacactct 20

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggtcgggt ggaatagc 18

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtgaagaagg tgaaagatat catgga 26

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gctttgcgct ggattctca 19

<210> 23

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gctcgccggc ttcga 15

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggtaggtctg aaaggcgaac ag 22

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gctctacatg tcgtgtgtga tgag 24

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgtcgatgtc ccgcatga 18

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccagtgcata gagactcatt ccaaa 25

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tgccatcttt cagagtagct atgact 26

Claims

1.一种肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的构建方法，所述肠炎沙门菌减毒疫苗候选株为将我国禽源肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis)CZ14-1的spiC基因及nmpC基因敲除后获得，所述肠炎沙门菌CZ14-1于2019年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为：CCTCC NO:M 2019813；

所述方法包括下列步骤：

(1)以禽源肠炎沙门菌CZ14-1为亲本株，用重组自杀质粒方法敲除亲本株CZ14-1的spiC基因，获得突变株CZ14-1ΔspiC；将野生型肠炎沙门菌CZ14-1的spiC基因中序列为SEQID NO:5的多核苷酸片段替换成了序列为SEQ ID NO:3的多核苷酸片段；

(2)采用λ-Red同源重组法，将突变株CZ14-1ΔspiC的nmpC基因中序列为SEQ ID NO:2的多核苷酸片段恰好重组替换为序列为SEQ ID NO:6的氯霉素抗性基因，获得双基因缺失株CZ14-1ΔspiCΔnmpC即为所述肠炎沙门菌减毒疫苗候选株；

步骤(2)具体包括下列步骤：

a)从肠炎沙门菌CZ14-1基因组中扩增出spiC基因的上下游同源臂spiC12和spiC34片段；将获得的spiC12和spiC34片段分别T克隆构建到pMD20T载体，得到pMD-spiC12和pMD-spiC34；

b)将步骤a)获得的pMD-spiC12和pMD-spiC34用HindIII和XhoI分别双酶切，回收pMD-spiC12和spiC34，将两回收产物连接，构建质粒pMD-ΔspiC；

c)将步骤b)获得的重组质粒的spiC12和spiC34片段之间插入Cm抗性基因，构建质粒pMD-ΔspiC/Cm，用BamHI单酶切酶切获得两端分别为spiC基因的上下游同源臂spiC12和spiC34片段，中间为Cm抗性基因的重组片段；

d)将步骤c)获得的重组片段克隆入自杀性质粒pGMB152，获得重组自杀性质粒pGMB152ΔspiC/Cm；

e)将步骤d)获得的重组自杀性质粒转化入合适的宿主E.coliχ7213作为供体菌，野生株CZ14-1为受体菌进行接合转移与重组，利用抗性和蔗糖敏感性筛选获得突变株CZ14-1ΔspiC；

PCR方法扩增spiC的引物为：

spiC基因敲除引物为：

扩增nmpC基因上下游序列的引物为：

2.一种禽源肠炎沙门菌减毒疫苗候选株，其特征在于，由权利要求1所述方法构建而成。

3.如权利要求2所述的肠炎沙门菌减毒疫苗候选株在制备禽类肠炎沙门菌病的活疫苗上的用途。

4.一种鸡肠炎沙门菌病疫苗，包括权利要求2所述的肠炎沙门菌减毒疫苗候选株。