CN106497855B

CN106497855B - 一种肠炎沙门菌基因敲除减毒突变株及其制备与应用

Info

Publication number: CN106497855B
Application number: CN201610955120.6A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 潘志明; 蔺志杰; 汤佩佩; 焦扬; 李求春; 耿士忠; 陈祥; 黄金林; 殷月兰; 孙林
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2036-11-03
Also published as: CN106497855A

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种肠炎沙门菌基因敲除减毒突变株及其制备与应用。本发明首先提供一种肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株，为sptP基因不表达的肠炎沙门菌。本发明成功研制了一种肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株，本发明通过动物试验发现，所述突变株毒力显著降低，对强毒力肠炎沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。

Description

一种肠炎沙门菌基因敲除减毒突变株及其制备与应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种肠炎沙门菌基因敲除减毒突变株及其制备与应用。

背景技术

沙门菌是人兽共患病原菌，能引起食物中毒、肠胃炎、伤寒和败血症等。沙门菌具有多种不同的血清型，可分为宿主适应血清型和非宿主适应血清型。肠炎沙门菌作为沙门菌一种常见血清型，在禽类中有较高的分离率，极易污染禽肉类、鱼类奶制品和蛋制品等，能引起人类肠胃炎等疾病。

当前，对沙门菌的防治主要是使用抗生素，但是随着抗生素的大量使用，沙门菌的耐药性也逐渐增强。疫苗接种是目前控制人和动物沙门菌病的有效措施之一，其中减毒活疫苗因能产生较高的免疫保护而成为研究热点。近年来，沙门菌已有多个毒力相关基因被鉴应用于构建毒力基因缺失的减毒菌株，这些减毒株对人和动物的致病力显著降低，但其仍保持较好的免疫原性。

现代分子生物学技术的发展使得我们可以通过基因敲除技术构建遗传背景清除的减毒疫苗株。这种方式往往需要对影响细菌生长的某些重要基因或者与细菌致病性有关的毒力基因进行敲除操作。

发明内容

鉴于以上现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种肠炎沙门菌基因敲除减毒突变株及其制备与应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株，为sptP基因不表达的肠炎沙门菌。

优选的，所述肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株，为sptP基因被敲除的肠炎沙门菌。

野生型肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)为现有技术，具体可使用的肠炎沙门菌包括但不限于：野生型肠炎沙门菌C50336。所述野生型肠炎沙门菌C50336来源：中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CMCC(B)50336。

sptP基因为现有技术。野生型肠炎沙门菌C50336的sptP基因的阅读框序列如SEQID NO:1所示。具体为：

1 atgctaaagtatgaggagagaaaattgaataatttaacgttgtcttcgttttcaaaagtt

61 ggtgtgtcgaatgatgcccgactttatattgctaaggaaaatactgataaggcatatgtt

121 gcgcctgaaaaattttcgtcaaaagtattaacctggcttggaaaaatgccgttatttaaa

181 aacactgaagtggtgcaaaaacatacggaaaatatcagagtacaggaccaaaagatttta

241 cagacatttctccatgcactaacggaaaaatatggggaaacagcggttaatgacgcactg

301 ttaatgtcccgtataaatatgaacaaaccccttacccaacgtttagcagtgcagatcacg

361 gagtgtgtaaaagctgctgacgaagggtttataaaccttattaagagcaaggataatgtt

421 ggtgtcaggaatgccgctttagtcataaaaggcggcgatacaaaagtggcagaaaaaaat

481 aacgatgttggagcagaaagtaagcaacctttactcgatatcgcgctaaagggacttaaa

541 agaacattaccgcaactggaacaaatggatggaaatagcctgcgagaaaacttccaggag

601 atggcttcaggtaacggcccgctgcgttcattaatgacgaatttacagaatttaaataaa

661 attccagaggctaaacaacttaatgattatgttacaacgttaacaaatattcaggtcggt

721 gtagcccggttctcacaatggggaacctgtggaggagaggttgagaggtgggttgataaa

781 gcctctactcatgaattaacccaggctgtaaaaaaaattcacgttattgctaaagaactg

841 aaaaatgttacagctgaacttgagaaaatagaagccggcgcgccaatgccacagacgatg

901 agcggaccgacactgggcctggcacggtttgcggtcagcagcattccaattaatcagcaa

961 acccaggtgaaactgagcgatggaatgcctgtgccagtgaatacgttaacttttgacggt

1021 aagcctgtggcattagccggttcgtacccaaaaaatacgccggatgcgctggcagcgcat

1081 atgaaaatgcttcttgaaaaagaatgctcatgcctggtggtgttaacgtcggaagatcag

1141 atgcaggcaaaacaattaccaccctatttcagagggagctacacctttggcgaggtgcat

1201 accaacagccaaaaagtgagctcagccagtcagggagaagcgatagaccaatacaatatg

1261 caactgtcctgcggggaaaagcggtatacaatcccggtattgcatgtgaaaaattggcca

1321 gatcaccagccgttaccgtctacggatcagttagaatacctggcggatagggtgaaaaat

1381 agtaaccaaaatggcgcgccggggcgtagttcatcagataagcatttaccgatgattcat

1441 tgtctgggcggagtggggagaaccggaacgatggcggcggcccttgtacttaaggataat

1501 cctcatagtaatctggagcaggtacgtgcagatttccggaattcacggaacaatagaatg

1561 ctggaagacgcctcacagtttgtacaactaaaagcaatgcaagcccagttgcttatgacg

1621 acggcacgctga。

只要将肠炎沙门菌中的sptP基因进行敲除，使得sptP基因不表达，即可获得肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株。

优选地，本发明一实施例中，被敲除的sptP基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述减毒株还可经过其他基因改造。

所述的其他基因改造是指除sptP基因敲除以外的基因改造。所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标基因的改造。理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。

基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增添、缺失引起的改变。所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除等。目标基因的敲入、目标基因的敲除可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成。

优选地，本发明一实施例中，如SEQ ID NO.1所示的sptP基因被敲除并替换为如SEQ ID NO:3所示的序列。如SEQ ID NO:3所示的序列具体为：

GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCATGGCTAATTCCCAT。

本发明的第二方面，提供了前述肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株的构建方法，包括步骤：将肠炎沙门菌中的sptP基因敲除。

可以采用现有的基因编辑方法敲除所述sptP基因。优选地，可采用同源重组的方法敲除sptP基因。在优选的实施例中，采用Red同源重组的方法敲除sptP基因。还可采用其他方法实现基因敲除，并不限于实施例所列举的方式。

基于sptP基因的敲除，sptP基因的完整序列从染色体DNA中去除。

本发明的第三方面，提供了前述肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株在制备肠炎沙门氏菌病的活疫苗上的用途。

本发明的第四方面，提供了一种肠炎沙门氏菌病的活疫苗，含有前述肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株。

进一步的，所述活疫苗中还含有佐剂。

本发明的第五方面，提供了sptP基因作为靶基因在筛选肠炎沙门氏菌感染治疗药物中的用途。

本发明所述肠炎沙门氏菌感染治疗药物为以sptP基因为治疗靶基因，使sptP基因敲除、不表达的药物或者以sptP基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以sptP基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以sptP基因为靶点，筛选使这个基因不表达的药物，用于使肠炎沙门菌毒性减弱，以治疗肠炎沙门菌感染。例如，该肠炎沙门菌感染治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使sptP基因敲除或不表达；或者通过制备sptP蛋白拮抗剂，使sptP基因表达的蛋白不发挥作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明成功研制了一种肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株，本发明通过动物试验发现，所述突变株毒力显著降低，对强毒力肠炎沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。

附图说明

图1：API20E生化鉴定板结果，

1：无菌水空白对照；2：肠炎沙门菌野生株C50336；3：C50336ΔsptP基因敲除株。

图2.是质粒pKD3的图谱。

图3是sptP同源臂+氯霉素抗性基因打靶片段的PCR扩增结果，

M：DL2000marker；1：sptP同源臂+氯霉素抗性基因打靶片段。

图4是质粒pKD46的图谱。

图5是突变株的PCR鉴定，

M：250bp market；1：野生株C50336的PCR扩增片段；2：无Cat突变株C50336ΔsptP的PCR扩增片段；3：有Cat突变株C50336Δspt::cat的PCR扩增片段。

图6细菌在肝脏的持续带菌情况。

图7细菌在脾脏中的持续带菌情况。

图8细菌在肠系膜淋巴结中的持续带菌情况。

图9为血清中特异性IgG抗体水平结果。

图10为血清中特异性IgG抗体亚型检测结果。

图11为脾脏淋巴细胞增殖结果。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株C50336ΔsptP的构建

1.野生型肠炎沙门菌C50336的鉴定

野生型肠炎沙门菌C50336来源：中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CMCC(B)50336。

1.1染色镜检革兰氏法染色后，普通光学显微镜下观察菌体形态、测量细菌大小。革兰氏染色结果显示镜检可观察到散在排列的红色短小直杆菌，大小约为1μm×4μm。

1.2生化试验挑取纯培养的单菌落接种生化鉴定板(API20E生化鉴定板)，37℃培24h后观察结果(见表4及图1)，对照API20E生化鉴定板说明书确定细胞种属的正确。

2.sptP基因敲除减毒株的构建方法

2.1打靶片段的制备

2.1.1带同源臂的Cm^R抗性基因扩增引物的设计

用于Red同源重组的引物由两部分组成，5'端大写的39nt的序列与靶基因两侧序列同源，3'端小写的20nt的序列与pKD3(从美国Yale University,The E.coli geneticresource center购买)质粒上Cm^R抗性基因两侧序列同源，引物序列见表1。

表1扩增打靶片段的引物序列

2.1.2打靶片段的扩增与纯化

以质粒pKD3(图2)作为模板，用表1中的引物进行PCR扩增，50μl PCR扩增体系如下表：

表2sptP打靶片段基因PCR扩增体系

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min,共30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

反应结束后以1％的琼脂糖凝胶电泳检测，以试剂盒回收纯化PCR产物，回收操作按Fragment purification Kit说明书进行，测定DNA浓度。

以质粒pKD3作为模板，用带有39nt同源臂的长引物进行PCR扩增，获得大小为1111bp的打靶片段(图3)。所述打靶片段如SEQ ID NO:2所示，具体为：

tgaatcagcaggaagtgctcaaaaacatactgcaggaatGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTATTCATTAAGCATCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGACAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTAGGCGCGCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCATGGCTAATTCCCATtaaaaacatagcttacttttagaactatcagaaagtaag。

3.电转化感受态细胞的制备

将携带Red重组酶系统的质粒pKD46(从美国Yale University,The E.coligenetic resource center购买)(图4)转化至氯化钙制备的野生株C50336感受态中构建菌株C50336-pKD46，于氨苄青霉素平板上30℃培养过夜，挑取单菌落接种含Amp的LB培养基，30℃振荡培养过夜。取200μL培养物接种到50mL含Amp的LB培养基中，并加入终浓度为30mM的L-阿拉伯糖，30℃振荡培养箱至OD600≈0.4，冰浴10min，4℃、5000rpm离心10min收集细菌沉淀，用预冷的10％甘油洗三遍，用50μL预冷的10％甘油重悬，即为感受态细胞。

4.同源臂打靶片段的电转化

将100ng的打靶片段(PCR产物的体积不能超过感受态细胞的10％)与50μL感受态细胞混合物加入到直径为1mm的电击杯中，冰浴2min，在电压1.8KV，脉冲25μF，电阻200Ω的条件下进行电击。电击完成后，加入预热的1mL SOC培养液于电击杯中，移液器轻轻吹匀后转移至1.5mL EP管中，180rpm，30℃振荡培养2h。取500μL菌液涂布于含氯霉素的LB抗性平板，37℃倒置培养过夜，筛选Cm^R抗性转化子。接种含氯霉素抗性的重组子，42℃培养过夜后，菌液分别接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB平板，37℃培养。选择具有氯霉素抗性但对氨苄青霉素敏感的单菌落，获得只有氯霉素抗性的突变株，并以sptP基因外侧引物e-sptP-F/R引物进行PCR验证，如图5，验证正确的菌株命名为：C50336ΔsptP::cat。

表3突变株的验证引物

5.抗性基因的消除

将携带FLP重组酶的质粒pCP20(从美国Yale University,The E.coli geneticresource center购买)电转至C50336ΔsptP::cat突变株中，电转化方法同上。电转化后取500μL的菌液涂布于同时含有Amp和Cm的LB平板上，30℃培养过夜后，挑取单菌落于LB平板上，42℃培养过夜。以e-sptP-F/R引物进行PCR验证辅助质粒pCP20和Cat抗性基因的消除情况，如图5，从而获得无抗性的基因突变株，经测序正确的菌株命名为：C50336ΔsptP。

6.缺失株生理生化活性鉴定

挑取纯培养的C50336ΔsptP单菌落接种生化鉴定板(API20E生化鉴定板)，并以C50336为对照，37℃培24h后观察结果。结果见图1及表4，与野生株相比，C50336ΔsptP生理生化活性未发生变化。

表4野生株C50336及基因缺失株的生化特性鉴定

注：“+”代表阳性，“—”表示阴性。

实施例2

1.安全性试验：

6-8周龄雌性BALB/c小鼠的半数致死率试验，将实施例1中制备的突变株与野生株C50336的毒力比较。

1.1.细菌的培养：细菌在LB平板上37℃培养24h，挑取单接种于液体LB中37℃静置培养12小时，调节菌液浓度调节到1×10⁹CFU/ml。

1.2.小鼠半数致死量的测定

6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为8组，每组4只，将野生株C50336、突变株C50336ΔsptP分别以不同的剂量口服灌胃小鼠。在接种前一天给小鼠口服5％NaHCO₃，100μL/只，连续观察并记录2周内小鼠的死亡情况，计算死亡率。试验结果表明，C50336ΔsptP突变株的毒力显著降低(表5)。

表5野生株和突变株对小鼠的致死率

1.3.免疫小鼠体重变化的测定

比较肠炎沙门菌缺失株C50336ΔsptP口服免疫后对小鼠体重的影响，6-8周龄雌性BALB/c小鼠分别口服免疫1×10⁸CFUC50336ΔsptP。结果显示免疫组与PBS对照组相比，免疫组小鼠体重无明显变化(表6)。同时，每天观察免疫组与对照组小鼠的临床状态，发现免疫组与对照组一样，能正常采食饮水，对外界刺激敏感，并未出现厌食、腹泻、精神萎靡等症状。

表6免疫1×10⁸CFU C50336ΔsptP后小鼠体重变化

实施例3肠炎沙门菌C50336ΔsptP在小鼠体内动态变化分析

以10⁸CFU肠炎沙门菌C50336ΔsptP口服免疫小鼠，分别在免疫后3、5、7、10、14、17、21天剖杀实验小鼠，无菌操作取其肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结，细菌计数。肝脏细菌数变化见图6，脾脏细菌数见图7，细菌在肠系膜淋巴结中的变化规律见图8。在接种后的第3天小鼠的肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结开始分离到细菌且数量达到最高。接种后21天，三只小鼠中的两只脏器已基本不带菌，而仅有一只体内还载有少量细菌。对照组小鼠均未分离到沙门菌。

实施例4

1.肠炎沙门菌C50336ΔsptP免疫后小鼠血清中特异性抗体水平及亚型的测定结果

以肠炎沙门菌可溶性抗原为包被抗原，检测血清中IgG及其亚型的分泌水平。图9显示免疫后12天与26小鼠血清中IgG抗体水平与对照组相比均存在显著高(p＜0.05)。通过IgG亚型的测定可知，缺失株可以诱导IgG1和IgG2a亚型抗体产生，其中高滴度的IgG1抗体暗示C50336ΔsptP能诱导倾向Th2型免疫应答(图10)。ELISA结果表明，C50336ΔsptP可以诱导强烈的体液免疫应答产生。

2.肠炎沙门菌C50336ΔsptP免疫后小鼠脾脏淋巴细胞增殖的结果

制备小鼠脾脏单细胞悬液，分别以ConA(终浓度为10μg/mL)，SEAgP(终浓度为10μg/mL)刺激，阴性对照组只加入培养基。置于37℃含有5％CO₂条件下培养48h后进行观察或检测。完成刺激后使用Roche cell proliferation ELISA,BrdU试剂盒，参照其说明书进行检测，计算刺激指数SI值。

在ConA与SEAgP刺激下，免疫后12天与26天小鼠的脾脏淋巴细胞增殖效果显著高于未免疫对照组(p＜0.05)(图11)。这说明肠炎沙门菌C50336ΔsptP能够诱导小鼠产生较好的细胞免疫应答。

实施例5肠炎沙门菌C50336ΔsptP对小鼠免疫保护测定

1×10⁸CFU C50336ΔsptP免疫后，将肠炎沙门菌野生株C50336以口服感染途径对免疫组与对照组小鼠进行攻毒，记录16天内小鼠死亡情况及临床症状，以评价减毒株的免疫保护作用。表7显示攻毒后16天，1×10⁸CFU免疫组小鼠的存活率达100％，且无不良症状，而对照组的存活率仅为25％，并且在攻毒后第5天开始出现厌食、炸毛、颤抖、精神萎靡等临床表现症状，第6天便开始出现死亡情况。这说明C50336ΔsptP能为小鼠提供较好的免疫保护。

表7C50336ΔsptP对小鼠的免疫保护效力

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 肠炎沙门菌基因敲除减毒突变株及其制备与应用

<130> 164313

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sptP基因的阅读框序列

<400> 1

atgctaaagt atgaggagag aaaattgaat aatttaacgt tgtcttcgtt ttcaaaagtt 60

ggtgtgtcga atgatgcccg actttatatt gctaaggaaa atactgataa ggcatatgtt 120

gcgcctgaaa aattttcgtc aaaagtatta acctggcttg gaaaaatgcc gttatttaaa 180

aacactgaag tggtgcaaaa acatacggaa aatatcagag tacaggacca aaagatttta 240

cagacatttc tccatgcact aacggaaaaa tatggggaaa cagcggttaa tgacgcactg 300

ttaatgtccc gtataaatat gaacaaaccc cttacccaac gtttagcagt gcagatcacg 360

gagtgtgtaa aagctgctga cgaagggttt ataaacctta ttaagagcaa ggataatgtt 420

ggtgtcagga atgccgcttt agtcataaaa ggcggcgata caaaagtggc agaaaaaaat 480

aacgatgttg gagcagaaag taagcaacct ttactcgata tcgcgctaaa gggacttaaa 540

agaacattac cgcaactgga acaaatggat ggaaatagcc tgcgagaaaa cttccaggag 600

atggcttcag gtaacggccc gctgcgttca ttaatgacga atttacagaa tttaaataaa 660

attccagagg ctaaacaact taatgattat gttacaacgt taacaaatat tcaggtcggt 720

gtagcccggt tctcacaatg gggaacctgt ggaggagagg ttgagaggtg ggttgataaa 780

gcctctactc atgaattaac ccaggctgta aaaaaaattc acgttattgc taaagaactg 840

aaaaatgtta cagctgaact tgagaaaata gaagccggcg cgccaatgcc acagacgatg 900

agcggaccga cactgggcct ggcacggttt gcggtcagca gcattccaat taatcagcaa 960

acccaggtga aactgagcga tggaatgcct gtgccagtga atacgttaac ttttgacggt 1020

aagcctgtgg cattagccgg ttcgtaccca aaaaatacgc cggatgcgct ggcagcgcat 1080

atgaaaatgc ttcttgaaaa agaatgctca tgcctggtgg tgttaacgtc ggaagatcag 1140

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accaacagcc aaaaagtgag ctcagccagt cagggagaag cgatagacca atacaatatg 1260

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<210> 2

<211> 1111

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 打靶片段

<400> 2

tgaatcagca ggaagtgctc aaaaacatac tgcaggaatg tgtaggctgg agctgcttcg 60

aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaacttcatt taaatggcgc 120

gccttacgcc ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt attcattaag catctgccga 180

catggaagcc atcacaaacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt 240

cgccttgcgt ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg 300

ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat 360

tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg 420

aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg 480

tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct 540

caccgtcttt cattgccata cgtaattccg gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt 600

gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa 660

tatccagctg aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat 720

gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca 780

ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg acaactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc 840

ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc 900

aaaagttggc ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt tattctgcga 960

agtgatcttc cgtcacaggt aggcgcgccg aagttcctat actttctaga gaataggaac 1020

ttcggaatag gaactaagga ggatattcat atggaccatg gctaattccc attaaaaaca 1080

tagcttactt ttagaactat cagaaagtaa g 1111

<210> 3

<211> 103

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 替换序列

<400> 3

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 60

ggaactaagg aggatattca tatggaccat ggctaattcc cat 103

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sptp-Cat-F

<400> 4

tgaatcagca ggaagtgctc aaaaacatac tgcaggaatg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sptP-Cat-R

<400> 5

cttactttca gatagttcta aaagtaagct atgtttttaa tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> e-sptP-F

<400> 6

atccgaacta ctttacgc 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> e-sptP-R

<400> 7

tgaatggcta ttctactgg 19

Claims

1.一种肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株，所述肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株为将野生型肠炎沙门菌C50336中的sptP基因敲除后获得,被敲除的sptP基因的序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株，其特征在于，被敲除的sptP基因替换为如SEQ ID NO:3所示的序列。

3.如权利要求1～2任一权利要求所述肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株的构建方法，包括步骤：将野生型肠炎沙门菌C50336中的sptP基因敲除，被敲除的sptP基因的序列如SEQID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用同源重组的方法敲除sptP基因。

5.如权利要求1～2任一权利要求所述肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株在制备肠炎沙门氏菌病的活疫苗中的用途。

6.一种肠炎沙门氏菌病的活疫苗，含有如权利要求1～2任一权利要求所述的肠炎沙门菌sptP基因敲除减毒株。

7.根据权利要求6所述的活疫苗，其特征在于，还含有佐剂。