CN105018400A - 肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株，敲除了ssrA基因689位至ssrB基因63位氨基酸共计915个碱基对的缺失菌株。本发明还公开了肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，步骤包括：(1)获取ssrAB的SN和SC基因，并OverLap？PCR进行上下游同源臂的连接；(2)重组自杀质粒pWM91-ssrAB的构建；(3)细菌的固相接合；(4)G9-2012(ΔssrAB)的筛选和获得。本发明的有益效果在于G9-2012(ΔssrAB)菌株在体内的定殖率减低，毒力明显减弱，可用于研制肠炎沙门氏菌减毒活疫苗或活载体疫苗，进而减低人或动物感染该病原菌的几率，保障人类的健康。
Description
技术领域
本发明涉及肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株及其构建方法，属于基因缺失株研究的技术领域。
背景技术
肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)是重要的食源性人兽共患病原，不仅引起人类胃肠炎等疾病，也是导致禽蛋及其相关产品污染的主要病原。沙门氏菌是一个典型的食物污染源，在被污染的食物或者水中可以非常容易地将其分离并检出。据统计，每年超过一百万的人口被鼠伤寒沙门氏菌或者肠炎沙门氏菌感染，而这些被感染的人群中得到及时有效治疗的不足1％。由肠炎沙门氏菌引起的食物中毒，在世界各国都有发生且数量不断增加，已成为国际公共卫生部门关注的重要问题。目前对于该病原菌的防治缺乏有效的方法，因此有待深入研究该病原菌的致病因子。
沙门氏菌的致病因子主要在于其毒力岛(SPI)上，目前已经报道的毒力岛大约为39个，分别加以编号SPI-1到SPI-39，沙门氏菌利用其毒力岛上的三型分泌系统T3SS向宿主细胞内分泌一些致病因子，目前已知在SPI-1和SPI-2上都有T3SS的存在。而位于这两个毒力岛上的两个T3SS所起的作用却截然不同，SPI-1上T3SS主要在沙门氏菌的入侵宿主细胞过程中起到重要作用，其中的某些蛋白属于沙门氏菌的侵袭素，SPI-2上的T3SS主要在沙门氏菌入侵宿主细胞后的维持中起到重要作用。ssrAB基因是位于SPI-2上的基因，该基因是SPI-2上T3SS的正调节基因，其缺失可以引起整个SPI-2表达水平降低，而SPI-2又与沙门氏菌感染后在宿主细胞内的定殖能力有关，若将该基因进行缺失，理论上可以获得毒力减弱的菌株。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株及其构建方法。
发明主要利用分子生物学方法和基因工程技术对肠炎沙门氏菌SPI-2上的毒力因子ssrAB基因进行缺失，构建肠炎沙门氏菌的ssrAB基因缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)，其微生物保藏号是：CGMCCNO.10422，其分类命名为肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)；保藏时间是：2015年1月22日；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明对该缺失菌株的生物膜，定殖能力及致病性等进行研究，为进一步肠炎沙门氏菌基因缺失活疫苗及活载体疫苗的研发做铺垫，从而降低人与动物感染肠炎沙门氏菌的机率，保障人与动物的健康。
本发明是通过以下技术方案来实现的。
肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株，敲除了ssrA基因689位至ssrB基因63位氨基酸共计915个碱基对的缺失菌株。
肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，步骤包括：
(1)获取ssrAB的SN和SC基因，并OverLap PCR进行上下游同源臂的连接：
根据ssrAB基因序列，设计引物：
ssrAB-NF：5-ATAGCGGCCGCCGCTGAGCGAGCTAACAAAC-3
ssrAB-NR：5-TATCCAGGCCCAACTGCCAGGGTGGTAACA-3
ssrAB-CF：5-CTGGCAGTTGGGCCTGGATATCATTCCTCA-3
ssrAB-CR：5-GCGCTCGAGAGCGCTTGTCGAATATCGTC-3
以G9-2012菌株制备的DNA为模板，分别扩增ssrAB基因5'端上游同源臂序列925bp和3'端下游同源臂序列796bp，其中在ssrAB-NR的5’端加入与ssrAB-CF的5'端互补配对的10个碱基，在ssrAB-CF的5’端加入与ssrAB-NC的5'端互配对的10个碱基，使得ssrAB-NR和ssrAB-CF之间的碱基配对达到20个碱基，ssrAB-NF和ssrAB-CR引物5'端分别加限制性酶切位点NotI和XhoI及保护性碱基，ssrAB-NF的GCGGCCGC以及ssrAB-CR的CTCGAG分别为酶切位点；
ssrAB-NF和ssrAB-NR，ssrAB-CF和ssrAB-CR二对引物扩增后获得ssrAB基因的上游同源臂和下游同源臂，目的条带大小分别为925bp和796bp，并用0.8％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入等倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，转移溶解后的液体于微型柱子，室温放置2min后12830g离心1min，弃废液，加入漂洗液PW 600uL，并12830g离心1min，弃液体，重复洗涤，而后空管12830g离心2min，将柱子在室内放置10min,并转移柱子与干净的1.5mL的离心管中，并加入30uL的洗脱液12830g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的上游同源臂925bp片段和下游同源臂796bp片段，命名为SN,SC片段；
以SN和SC为模板，ssrAB-NF和ssrAB-CR为一对引物，通过OverLap PCR扩增并连接获得ssrAB基因两侧同源臂序列1701bp；
ssrAB-NF和ssrAB-CR为一对引物扩增后获得OverLap PCR产物，目的条带大小1701bp，并用0.8％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入等倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，转移溶解后的液体于微型柱子，室温放置2min后12830g离心1min，弃废液，加入漂洗液PW 600uL，并12830g离心1min，弃液体，重复洗涤，而后空管12830g离心2min，将柱子在室内放置10min,并转移柱子与干净的1.5mL的离心管中，并加入30uL的洗脱液12830g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的1701bp片段，命名为sr片段；
(2)重组自杀质粒pWM91-ssrAB的构建：
用NotI和XhoI酶切自杀质粒pWM91体系如下：10×H Buffer10uL,BSA10uL NotI 1uL,XhoI 1uL,质粒pWM9110uL,ddH2O 68uL，37℃水浴6h，同时用NotI和XhoI酶切sr片段，体系如下：10×H Buffer10uL,BSA10uL NotI 1uL,XhoI 1uL,sr片段30uL,ddH2O 48uL，37℃水浴6h，切胶回收并纯化，利用T4DNA连接酶进行酶连，酶连体系为20uL：sr片段酶切产物12uL,质粒pWM91酶切产物5uL，10×T4Ligase Buffer 2uL,T4Ligase 1uL,16℃连接过夜，然后热应激转化入大肠杆菌SM10感受态细胞中，涂布添加有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜，挑取单个菌落于涂布添加有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素LB液体培养中，37℃，180g进行过夜培养，提取质粒进行验证，用NotI和XhoI双酶切验证重组质粒；
(3)细菌的固相接合：
采用固相滤膜杂交方法，将G9-2012四区划线至涂布添加有终浓度为100ug/mL链霉素抗性的LB琼脂平板上，将已转化入pWM91-ssrAB的供体菌SM10四区划线至含100ug/mL氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含有相应抗生素的LB液体培养基，37℃，180g培养过夜，按5％转种至含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养4h，分别取2ml菌液至离心管中，12830g离心5min，弃上清，分别加1mL新鲜LB液体培养基重悬菌液，重复3次后，12830g离心5min，弃上清，加100uL新鲜LB培养基，分别取20uL滴至灭菌滤膜上，剩余菌液混匀后滴至另一滤膜上，将滤膜放置于无抗性的LB琼脂培养基平板上，37℃孵育4h，然后分别用1ml LB液体培养基洗下滤膜上的细菌，各吸取20uL分别涂布与含有终浓度为100ug/mL链霉素和终浓度为100ug/mL氨苄青霉素抗性的双抗LB琼脂板上，37℃培养过夜，筛选接合子；
(4)G9-2012(ΔssrAB)的筛选和获得：
接种上述筛选的接合子于终浓度为100ug/mL链霉素和终浓度为100ug/mL氨苄青霉素抗性的双抗LB液体培养基中，37℃，180g培养过夜，然后四区划线接种于含有25％蔗糖的LB琼脂培养基上，22℃培养44h，挑取单菌落，以此单菌落为PCR模板，设计引物：
ssrAB-F：5-CGATAGCGGTAAAGGGATTG-3
ssrAB-R：5-CCAGGATAGCTTCCCGATTC-3
对该菌落进行PCR扩增验证，以双蒸水为阴性对照，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，出现大小为1562bp目的条带(亲本菌株)和647bp(缺失了ssrAB菌株)的目的条带，筛选出扩增片段大小为647bp的条带为缺失ssrAB基因的缺失菌株，即G9-2012(ΔssrAB)。
进一步地，(1)：上游同源臂PCR扩增体系为50uL:10×PCR Buffer5uL,25M MgCL23uL,dNTP mix 4uL,ssrAB-NF和ssrAB-NR各1uL，菌液DNA模板1uL，rTaq 0.2uL，PrimeSTAR 0.8uL,ddH2O 34uL,PCR反应条件为：95℃预变性5min,95℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，以ddH2O为阴性对照。
进一步地，(1)：下游同源臂PCR扩增体系为50uL:10×PCR Buffer5uL,25M MgCL23uL,dNTP mix 4uL,ssrAB-CF和ssrAB-CR各1uL，菌液DNA模板1uL，rTaq 0.2uL,PrimeSTAR 0.8uL,ddH2O 34uL,PCR反应条件为：95℃预变性5min,95℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，以ddH2O为阴性对照。
进一步地，(1)：上下游同源臂OverLap PCR扩增体系为50uL:10×PCR Buffer 5uL,25M MgCL23uL,dNTP mix 4uL,ssrAB-NF和ssrAB-CR各1uL，SN,SC片段各2uL作为模板，rTaq 0.2uL PrimeSTAR0.8uL,ddH2O 31uL,PCR反应条件为：95℃预变性5min,94℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸5min，以ddH2O为阴性对照。
进一步地，(2)：酶切体系为30uL:10×H Buffer 3uL,BSA3uL，质粒10uL，NotI 0.5uL，XhoI 0.5uL，ddH2O 13uL，37℃水浴4h，0.8％琼脂糖电泳鉴定，可以看到一条1701bp目的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，筛选获得转化的重组质粒，命名为pWM91-ssrAB。
进一步地，(4)：PCR体系为:2×mix 10uL,ssrAB-F和ssrAB-R各0.5uL,菌落模板，ddH2O 8uL,PCR条件：94℃预变性3min,94℃30s，55℃30s，72℃90s，共25个循环。
本发明的有益效果：
1、本发明针对人畜共患的肠炎沙门氏菌的毒力因子ssrAB基因，构建了G9-2012(ΔssrAB)菌株，利用PCR技术获得SN,SC片段，利用重组PCR技术将SN,SC片段连接，最后克隆入自杀质粒pWM91，成功构建出pWM91-SN-SC基因重组质粒，即pWM91-ssrAB。
2、本发明成功获得G9-2012(ΔssrAB)菌株。将含有pWM91-ssrAB的供体菌SM10与G9-2012固相结合，通过同源重组方法替换掉ssrAB基因，通过基因水平筛选和鉴定，成功获得缺失ssrAB的G9-2012的缺失菌株，即G9-2012(ΔssrAB)菌株。
3、本发明对G9-2012(ΔssrAB)菌株的培养特性，在体内的定殖率及致病性进行研究表明，G9-2012(ΔssrAB)具有良好的抗原性。G9-2012(ΔssrAB)菌株在体内的定殖率减低，毒力明显减弱，可用于研制肠炎沙门氏菌减毒活疫苗或活载体疫苗，进而减低人或动物感染该病原菌的几率，保障人类的健康。
附图说明
图1：G9-2012(ΔssrAB)缺失菌株的构建图谱
ssrAB基因两侧片段N-flanking，C-flanking通过OverLap PCR链接后插入自杀质粒pWM91,用质粒上的片段与G9-2012基因组上相应片段做同源重组，获得ssrAB基因缺失菌株。secB为重组自杀质粒上的蔗糖致死基因，bla为β内酰胺酶抗性基因，空白箭头部分为重组PCR的产物Sr序列片段，黑色加粗线条代表ssrAB基因两侧序列。
图2：SN和SC基因PCR扩增片段
泳道1，DL-2000Marker；泳道2、3分别为SC和SN的PCR片段；泳道4为阴性对照。
图3：SN和SC基因重组PCR片段sr序列
泳道1，DL-2000Marker；泳道2、3为sr的PCR片段。
图4：pWM91-ssrAB的NotI和XhoI双酶切鉴定图谱
泳道1和4，DL-2000Marker；泳道2、3为pWM91-ssrAB。
图5:G9-2012(ΔssrAB)的鉴定图谱
泳道1和6，DL-2000Marker；泳道2、3为G9-2012(ΔssrAB)菌株；泳道4、5为亲本菌株。
图6：缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)和亲本菌株生长曲线观察结果；每隔1h，取样一次，进行平板计数，缺失菌株和亲本株无明显差异。
图7：缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)和亲本菌株生物膜测定结果；检测570nm处吸光度A570，缺失菌株的生物膜形成能力显著低于亲本菌株(P<0.05)。
图8：缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)和亲本菌株定殖率测定结果；结果表明缺失菌株的定殖率显著小于亲本菌株。
具体实施方式
下面根据附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实例1
一种基因缺失的肠炎沙门氏菌，构建方法如下：
1)实验菌株G9-2012的选择：从安徽地区宠物犬体内分离得到的菌株中选择侵袭能力较强的菌株，经菌株耐药性测定，菌株G9-2012对氨苄青霉素敏感，其最小杀菌浓度小于5ug/mL，后经连续培养，获得一株对链霉素抗性且对氨苄青霉素敏感的G9-2012菌株，其最小杀菌浓度大于500ug/mL，并将此对氨苄青霉素敏感，对链霉素耐药的肠炎沙门氏菌G9-2012作为亲本菌株。
2)G9-2012的增殖及总基因组DNA的提取：取1)筛选的肠炎沙门氏菌G9-2012接种于液体LB培养基中，37℃培养，至其OD600值达到3以上(12h)，取3mL该培养物，放置于Eppendorf离心管中，12830g离心5min，弃去上清，加入1.5mL PBS缓冲液，12830g离心2min，弃去上清，加入240uL TE，将菌体重新悬浮均匀，加入15uL溶菌酶，0℃冰浴30min，再加入15uL 10％SDS溶液，混合均匀，加入蛋白酶K(pK)，65℃水浴30min，加入200uL 5M NaCl溶液，剧烈震荡，加入500uL酚/氯仿/异戊醇(1：24：25)(此溶液由于易被氧化故水封，所以应取水面以下的部分)溶液，混合均匀，12830g离心10min，取上清至离心管中，记录其体积V，并加入400uLTE溶液和500uL的异丙醇溶液，放置于-80℃冰箱冷冻10min，12830g离心10min，弃上清弃，自然风干，加入30uL ddH2O溶解，放入于-20℃冰箱保存，用于PCR反应的模板。
3)自杀质粒pWM91的制备：在液体LB培养基中接入大肠杆菌SM10，并加入氨苄青霉素100ug/mL，在37℃培养12h，至其OD600值达到3以上，取1.5mL菌液至离心管中，12830g离心2min沉淀菌体，弃上清，向上述离心管中加入100uL溶液Solution I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl,10mM EDTA pH＝8.0)，于0℃冰浴10min,加入100uL溶液SolutionⅡ(0.2M NaOH 1％SDS,现配现用)，并于0℃冰浴10min,加入100uL溶液SolutionⅢ(3M醋酸钾2M醋酸),并于0℃冰浴10min,加入一滴氯仿，12830g离心10min，取上清,加入到另一离心管中，加入200uL 7.5M NH4OAC(醋酸氨溶液)，12830g离心10min，取上清，加入另一离心管中，加入1mL乙醇(100％乙醇)，放置于-80℃冰箱冷冻10min，12830g离心10min，弃上清，沉淀即为质粒DNA，加入75％酒精，轻轻洗去总DNA表面上的少量蛋白，自然风干，并用20uL ddH2O溶解，于-20℃冰箱保存，用于重组质粒的构建。
3)大肠杆菌SM10感受态细胞的制备：将SM10四区划线到LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落于液体LB中，37℃培养过夜，至OD600大于3.0，按5％转接至新鲜LB培养基，37℃，180g培养至OD600＝0.8，将培养的菌液于0℃中预冷30min 4℃下12830g离心5min，弃去上清，加入30mL的0℃预冷的灭菌0.1M CaCl2溶液，并反复操作前一步骤3次，弃上清，加入0.1M CaCl2溶液的0℃预冷的灭菌30％甘油混合溶液后，每100uL分为一个离心管并且于-80℃保存,以备转化用。
4)菌株G9-2012前后同源臂的克隆：根据GeneBank上登录的ssrAB基因序列，序列号为Z95891.1，设计2对特异性引物，以G9-2012菌株制备的DNA为模板，分别扩增ssrAB基因5'端上游同源臂序列925bp(SEQ ID NO:1)和3'端下游同源臂序列796bp(SEQ ID NO:2)，其中在ssrAB-NR的5’端加入与ssrAB-CF的5'端互补配对的10个碱基，在ssrAB-CF的5’端加入与ssrAB-NC的5'端互配对的10个碱基，使得ssrAB-NR和ssrAB-CF之间的碱基配对达到20个碱基：
ssrAB-NF：5-ATAGCGGCCGCCGCTGAGCGAGCTAACAAAC-3(SEQ ID NO:3)
ssrAB-NR：5-TATCCAGGCCCAACTGCCAGGGTGGTAACA-3(SEQID NO:4)
ssrAB-CF：5-CTGGCAGTTGGGCCTGGATATCATTCCTCA-3(SEQID NO:5)
ssrAB-CR：5-GCGCTCGAGAGCGCTTGTCGAATATCGTC-3(SEQ IDNO:6)
ssrAB-NF和ssrAB-CR引物5'端分别加限制性酶切位点NotI和XhoI及保护性碱基，下划线部分为酶切位点，上游同源臂PCR扩增体系为50uL:10×PCR Buffer 5uL,25M MgCL23uL,dNTP mix4uL,ssrAB-NF和ssrAB-NR各1uL，菌液DNA模板1uL，rTaq 0.2uLPrimeSTAR 0.8uL,ddH2O 34uL,PCR反应条件为：95℃预变性5min,95℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸10min，以ddH2O为阴性对照，下游同源臂PCR扩增体系为50uL:10×PCRBuffer 5uL,25M MgCL23uL,dNTP mix 4uL,ssrAB-CF和ssrAB-CR各1uL，菌液DNA模板1uL，rTaq 0.2uL,PrimeSTAR 0.8uL,ddH2O34uL,PCR反应条件为：95℃预变性5min,95℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸10min，以ddH2O为阴性对照(如图2所示)
ssrAB-NF和ssrAB-NR，ssrAB-CF和ssrAB-CR二对引物扩增后获得ssrAB基因的上游同源臂和下游同源臂，目的条带大小分别为925bp和796bp，并用0.8％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入等倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，转移溶解后的液体于微型柱子，室温放置2min后12830g离心1min，弃废液，加入漂洗液PW 600uL，并12830g离心1min，弃液体，重复洗涤，而后空管12830g离心2min，将柱子在室内放置10min,并转移柱子与干净的1.5mL的离心管中，并加入30uL的洗脱液12830g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的上游同源臂925bp片段和下游同源臂796bp片段，命名为SN,SC片段，纯化后的片段，进行重组PCR连接SN与SC片段，上下游同源臂连接PCR扩增体系为50uL:10×PCR Buffer 5uL,25M MgCL23uL,dNTPmix 4uL,ssrAB-NF和ssrAB-CR各1uL，上游同源臂和下游同源臂各2uL作为模板，rTaq 0.2uL PrimeSTAR 0.8uL,ddH2O 31uL,PCR反应条件为：95℃预变性5min,94℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸5min，以ddH2O为阴性对照，连接片段大小为1701bp,PCR连接的产物回收并纯化G9-2012ssrAB基因上下游连接产物基因序列片段SEQ ID NO:7(如图3所示)，以备重组质粒的构建。
5)重组自杀质粒pWM91-ssrAB的构建
用NotI和XhoI酶切自杀质粒pWM91体系如下：10×H Buffer10uL,BSA10uL NotI 1uL,XhoI 1uL,质粒pWM9110uL,ddH2O 68uL，37℃水浴6h，同时用NotI和XhoI酶切sr片段(SEQ ID NO:7)，体系如下：10×H Buffer 10uL,BSA10uL NotI 1uL,XhoI 1uL,sr片段30uL,ddH2O 48uL，37℃水浴6h，切胶回收并纯化，利用T4DNA连接酶进行酶连，酶连体系为20uL：sr片段酶切产物12uL,质粒pWM91酶切产物5uL，10×T4Ligase Buffer 2uL,T4Ligase 1uL,16℃连接过夜，然后热应激转化入大肠杆菌SM10感受态细胞中，涂布添加有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜，挑取单个菌落于涂布添加有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素LB液体培养中，37℃，180g进行过夜培养，提取质粒进行验证，用NotI和XhoI双酶切验证重组质粒，酶切体系为30uL:10×H Buffer 3uL,BSA3uL，质粒10uL，NotI 0.5uL，XhoI 0.5uL，ddH2O 13uL，37℃水浴4h，0.8％琼脂糖电泳鉴定，可以看到一条1701bp(SEQ ID NO:7)目的条带出现(如图4所示)，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，筛选获得转化的重组质粒，命名为pWM91-ssrAB；
6)将重组质粒转化入大肠杆菌SM10感受态细胞的具体步骤
取一支3)制备的SM10感受态细胞，放于冰盒上融化，吸取重组载体20uL与SM10感受态细胞混匀后，放于冰盒上，冰浴30min，42℃热激90s,冰浴3min，加入1mL LB液体培养基，37℃180g培养1h，12830g离心3min,弃上清，用100uL重悬液体后，涂布于氨苄青霉素和链霉素双抗LB固体培养基上，37℃培养过夜。
7)细菌的固相接合
采用固相滤膜杂交方法，将G9-2012四区划线至涂布添加有终浓度为100ug/mL链霉素抗性的LB琼脂平板上，将已转化入pWM91-ssrAB的供体菌SM10四区划线至含100ug/mL氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含有相应抗生素的LB液体培养基，37℃，180g培养过夜，按5％转种至含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养4h，分别取2ml菌液至eppendorf管中，12830g离心5min，弃上清，分别加1mL新鲜LB液体培养基重悬菌液，重复3次后，12830g离心5min，弃上清，加100uL新鲜LB培养基，分别取20uL滴至灭菌滤膜上，剩余菌液混匀后滴至另一滤膜上，将滤膜放置于无抗性的LB琼脂培养基平板上，37℃孵育4h，然后分别用1mL LB液体培养基洗下滤膜上的细菌，各吸取20uL分别涂布与含有终浓度为100ug/mL链霉素和终浓度为100ug/mL氨苄青霉素抗性的双抗LB琼脂板上，37℃培养过夜，筛选接合子；
8)G9-2012(ΔssrAB)的筛选和获得
接种上述筛选的接合子于终浓度为100ug/mL链霉素和终浓度为100ug/mL氨苄青霉素抗性的双抗LB液体培养基中，37℃，180g培养过夜，然后四区划线接种于含有25％蔗糖的LB琼脂培养基上，22℃培养44h，挑取单菌落，以此单菌落为PCR模板，根据GeneBank上登录的ssrAB基因序列，序列号为Z95891.1，设计一对引物
ssrAB-F：5-CGATAGCGGTAAAGGGATTG-3(SEQ ID NO:8)
ssrAB-R：5-CCAGGATAGCTTCCCGATTC-3(SEQ ID NO:9)
对该菌落进行PCR扩增验证，PCR体系为:2×mix 10uL,ssrAB-F和ssrAB-R各0.5uL,菌落模板，ddH2O 8uL,PCR条件：94℃预变性3min,94℃30s，55℃30s，72℃90s，共25个循环，以ddH2O为阴性对照，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，出现大小为1562bp(SEQ ID NO:10)目的条带(亲本型菌株)和647bp(缺失了ssrAB菌株)的目的条带(如图5所示)，筛选出扩增片段大小为647bp(SEQ ID NO:11)的条带为缺失ssrAB基因的缺失菌株，即G9-2012(ΔssrAB)；
实例2
肠炎沙门氏菌缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)生长特性的研究
将实例1制备的缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)和亲本型G9-2012菌株(WT)复苏后，四区划线到LB固体培养基平皿上进行纯化菌株，37℃培养过夜，挑取单菌落，分别接种至LB液体培养基中，37℃培养，培养2h后每隔1h，各取0.1mL缺失菌株和野生型菌株的菌液，进行平板计数，以菌落总数(CFU×106)为纵坐标，培养时间(h)为横坐标，将缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)和亲本菌株G9-2012(WT)的计数结果绘制成生曲线，分析鉴定缺失菌株的生长特性。如下图所示，缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)和亲本菌株生长特性无显著差异。
实例3
肠炎沙门氏菌缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)生物膜的测定
将实例1制备的缺失菌株G9-2012(ΔssrAB)和亲本型G9-2012菌株(WT)复苏后，四区划线到LB固体培养基平皿上进行纯化菌株，37℃培养过夜，挑取单菌落，分别接种至LB液体培养基，37℃培养过夜，分别接种于指形小试管内，每只试管接种0.8mL LB培养基，37℃静置培养，并于培养18h后轻轻弃去菌液，加入1mL蒸馏水洗涤3次，用0.2％结晶紫染色5min，弃去结晶紫，于流水下冲洗3次，自然风干后拍照，加入1mL DMSO溶解2h后，在紫外可见分光光度计下检测570nm处吸光度A570并将结果绘制成图如下图所示，经统计分析，缺失菌株的生物膜形成能力显著低于亲本菌株(P<0.05)。
实例4
肠炎沙门氏菌缺失菌株G9-2012(△ssrAB)在小鼠体内的定殖率的研究
将实例1中构建的缺失菌株和亲本菌株复苏后，于LB液体培养基中，37℃过夜培养，分别取0.1mL菌液进行菌落总数计数，记录菌落数为A，口腔攻毒18～20g的雌性小鼠，48h后，解剖小鼠，取小鼠肠道研磨，10倍梯度稀释后凃布于含有终浓度为100ug/mL链霉素的LB琼脂培养基中，37℃培养过夜，计数菌落总数，记录菌落总数为B，根据A和B的值计算出亲本菌株和缺失菌株在小鼠体内的定殖率I，将计算结果绘制成如下点状图，根据结果算出亲本菌株平均定殖率为15000/8.4×108＝5.6×10-4,缺失菌株的平均定殖率为600/8.4×108＝1.4×10-5，结果表明缺失菌株的定殖率显著小于亲本菌株(P<0.05)。
实例5
肠炎沙门氏菌缺失菌株G9-2012(△ssrAB)对小鼠小鼠致病性的研究
本实验选择18～20g的雌性小鼠，分别将G9-2012菌株和G9-2012(△ssrAB)菌株进行腹腔和口腔两种攻毒方式攻毒实验小鼠，将实验小鼠分成18组(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q和R)，10只/组。A、B、C、D和E分别腹腔注射8.4×1010CFU、8.4×108CFU、8.4×106CFU、8.4×104CFU、8.4×102CFU的G9-2012。F、J、H、I和J分别腹腔注射6.4×1010CFU、6.4×108CFU、6.4×106CFU、6.4×104CFU、6.4×102CFU的G9-2012(△ssrAB)观察并记录小鼠的精神状态，死亡情况，统计(表3)和(表4)的半数致死量，并进行比较，结果表明G9-2012的LD50为8.4×107CFU/mL，G9-2012(ΔssrAB)的LD50为6.4×107CFU/mL，说明采用腹腔攻毒方式，野生型菌株和ssrAB缺失菌株的毒力没有显著差异(P>0.05)。K、L、M和N分别口腔注射1.7×1012CFU、1.7×1011CFU、1.7×1010CFU、1.7×109CFU的G9-2012。O、P、Q和R分别口腔注射2.1×1012CFU、2.1×1011CFU、2.1×1010CFU、2.1×109CFU的G9-2012(ΔssrAB)观察并记录小鼠的精神状态，死亡情况，统计(表5)和(表6)的半数致死量并进行比较结果表明亲本株的LD50为2.14×1010CFU/mL，G9-2012(ΔssrAB)的LD50为1.33×1012CFU/mL，说明通过口腔攻毒方式，G9-2012(△ssrAB)缺失菌株比亲本菌株的毒力弱(P＜0.05)。
表3：G9-2012腹腔攻毒小鼠的致病性
表4：G9-2012(△ssrAB)腹腔攻毒小鼠的致病性
表5：G9-2012口腔攻毒小鼠的致病性
表6：G9-2012(△ssrAB)口腔攻毒小鼠的致病性
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株，其特征在于，敲除了ssrA基因689位至ssrB基因63位氨基酸共计915个碱基对的缺失菌株。
2.肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，步骤包括：
(1)获取ssrAB的SN和SC基因，并OverLap PCR进行上下游同源臂的连接：
根据ssrAB基因序列，设计引物：
ssrAB-NF：5-ATAGCGGCCGCCGCTGAGCGAGCTAACAAAC-3
ssrAB-NR：5-TATCCAGGCCCAACTGCCAGGGTGGTAACA-3
ssrAB-CF：5-CTGGCAGTTGGGCCTGGATATCATTCCTCA-3
ssrAB-CR：5-GCGCTCGAGAGCGCTTGTCGAATATCGTC-3
以G9-2012菌株制备的DNA为模板，分别扩增ssrAB基因5'端上游同源臂序列925bp和3'端下游同源臂序列796bp，其中在ssrAB-NR的5’端加入与ssrAB-CF的5'端互补配对的10个碱基，在ssrAB-CF的5’端加入与ssrAB-NC的5'端互配对的10个碱基，使得ssrAB-NR和ssrAB-CF之间的碱基配对达到20个碱基，ssrAB-NF和ssrAB-CR引物5'端分别加限制性酶切位点NotI和XhoI及保护性碱基，ssrAB-NF的GCGGCCGC以及ssrAB-CR的CTCGAG分别为酶切位点；
ssrAB-NF和ssrAB-NR，ssrAB-CF和ssrAB-CR二对引物扩增后获得ssrAB基因的上游同源臂和下游同源臂，目的条带大小分别为925bp和796bp，并用0.8％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入等倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，转移溶解后的液体于微型柱子，室温放置2min后12830g离心1min，弃废液，加入漂洗液PW 600uL，并12830g离心1min，弃液体，重复洗涤，而后空管12830g离心2min，将柱子在室内放置10min,并转移柱子与干净的1.5mL的离心管中，并加入30uL的洗脱液12830g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的上游同源臂925bp片段和下游同源臂796bp片段，命名为SN,SC片段；
以SN和SC为模板，ssrAB-NF和ssrAB-CR为一对引物，通过OverLap PCR扩增并连接获得ssrAB基因两侧同源臂序列1701bp；
ssrAB-NF和ssrAB-CR为一对引物扩增后获得OverLap PCR产物，目的条带大小1701bp，并用0.8％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入等倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，转移溶解后的液体于微型柱子，室温放置2min后12830g离心1min，弃废液，加入漂洗液PW 600uL，并12830g离心1min，弃液体，重复洗涤，而后空管12830g离心2min，将柱子在室内放置10min,并转移柱子与干净的1.5mL的离心管中，并加入30uL的洗脱液12830g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的1701bp片段，命名为sr片段；
(2)重组自杀质粒pWM91-ssrAB的构建：
用NotI和XhoI酶切自杀质粒pWM91体系如下：10×H Buffer10uL,BSA 10uL NotI 1uL,XhoI 1uL,质粒pWM91 10uL,ddH2O 68uL，37℃水浴6h，同时用NotI和XhoI酶切sr片段，体系如下：10×H Buffer10uL,BSA 10uL NotI 1uL,XhoI 1uL,sr片段30uL,ddH2O 48uL，37℃水浴6h，切胶回收并纯化，利用T4DNA连接酶进行酶连，酶连体系为20uL：sr片段酶切产物12uL,质粒pWM91酶切产物5uL，10×T4Ligase Buffer 2uL,T4Ligase 1uL,16℃连接过夜，然后热应激转化入大肠杆菌SM10感受态细胞中，涂布添加有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜，挑取单个菌落于涂布添加有终浓度为100ug/mL氨苄青霉素LB液体培养中，37℃，180g进行过夜培养，提取质粒进行验证，用NotI和XhoI双酶切验证重组质粒；
(3)细菌的固相接合：
采用固相滤膜杂交方法，将G9-2012四区划线至涂布添加有终浓度为100ug/mL链霉素抗性的LB琼脂平板上，将已转化入pWM91-ssrAB的供体菌SM10四区划线至含100ug/mL氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落至含有相应抗生素的LB液体培养基，37℃，180g培养过夜，按5％转种至含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养4h，分别取2mL菌液至离心管中，12830g离心5min，弃上清，分别加1mL新鲜LB液体培养基重悬菌液，重复3次后，12830g离心5min，弃上清，加100uL新鲜LB培养基，分别取20uL滴至灭菌滤膜上，剩余菌液混匀后滴至另一滤膜上，将滤膜放置于无抗性的LB琼脂培养基平板上，37℃孵育4h，然后分别用1mL LB液体培养基洗下滤膜上的细菌，各吸取20uL分别涂布与含有终浓度为100ug/mL链霉素和终浓度为100ug/mL氨苄青霉素抗性的双抗LB琼脂板上，37℃培养过夜，筛选接合子；
(4)G9-2012(ΔssrAB)的筛选和获得：
接种上述筛选的接合子于终浓度为100ug/mL链霉素和终浓度为100ug/mL氨苄青霉素抗性的双抗LB液体培养基中，37℃，180g培养过夜，然后四区划线接种于含有25％蔗糖的LB琼脂培养基上，22℃培养44h，挑取单菌落，以此单菌落为PCR模板，设计引物：
ssrAB-F：5-CGATAGCGGTAAAGGGATTG-3
ssrAB-R：5-CCAGGATAGCTTCCCGATTC-3
对该菌落进行PCR扩增验证，以双蒸水为阴性对照，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，出现大小为1562bp目的条带(亲本菌株)和647bp(缺失了ssrAB菌株)的目的条带，筛选出扩增片段大小为647bp的条带为缺失ssrAB基因的缺失菌株，即G9-2012(ΔssrAB)。
3.根据权利要求2所述的肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，(1)：上游同源臂PCR扩增体系为50uL:10×PCRBuffer 5uL,25M MgCL23uL,dNTP mix 4uL,ssrAB-NF和ssrAB-NR各1uL，菌液DNA模板1uL，rTaq 0.2uL，PrimeSTAR 0.8uL,ddH2O34uL,PCR反应条件为：95℃预变性5min,95℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，以ddH2O为阴性对照。
4.根据权利要求2所述的肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，(1)：下游同源臂PCR扩增体系为50uL:10×PCRBuffer 5uL,25M MgCL23uL,dNTP mix 4uL,ssrAB-CF和ssrAB-CR各1uL，菌液DNA模板1uL，rTaq 0.2uL,PrimeSTAR 0.8uL,ddH2O34uL,PCR反应条件为：95℃预变性5min,95℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸10min，以ddH2O为阴性对照。
5.根据权利要求2所述的肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，(1)：上下游同源臂OverLap PCR扩增体系为50uL:10×PCR Buffer 5uL,25M MgCL23uL,dNTP mix 4uL,ssrAB-NF和ssrAB-CR各1uL，SN,SC片段各2uL作为模板，rTaq 0.2uL PrimeSTAR0.8uL,ddH2O 31uL,PCR反应条件为：95℃预变性5min,94℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸5min，以ddH2O为阴性对照。
6.根据权利要求2所述的肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，(2)：酶切体系为30uL:10×H Buffer 3uL,BSA 3uL，质粒10uL，NotI 0.5uL，XhoI 0.5uL，ddH2O 13uL，37℃水浴4h，0.8％琼脂糖电泳鉴定，可以看到一条1701bp目的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，筛选获得转化的重组质粒，命名为pWM91-ssrAB。
7.根据权利要求2所述的肠炎沙门氏菌ssrAB基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，(4)：PCR体系为:2×mix 10uL,ssrAB-F和ssrAB-R各0.5uL,菌落模板，ddH2O 8uL,PCR条件：94℃预变性3min,94℃30s，55℃30s，72℃90s，共25个循环。
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