CN105274064A - 一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用。通过将鸭坦布苏病毒强毒在CEF细胞和Vero细胞上的连续传代获得本发明所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株，提高了疫苗株在Vero细胞上的适应能力，更好的提高了该毒株作为疫苗生产毒株的性能；用鸭坦布苏病毒WF120株制备的预防鸭坦布苏病毒病的鸭坦布苏疫苗，相比以往鸭坦布苏病毒病疫苗具有毒株WF120株安全性好、WF120株完全适应Vero细胞后生产成本更低、WF120株免疫效果更好等优势。

Description

一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及一株鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

鸭坦布苏病毒病(DuckTembusuViralDisease)是由鸭坦布苏病毒引起的一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病。其特征是病鸭减料、减蛋，伴有神经症状，出现瘫痪、行走不稳，部分病鸭排绿色粪便；卵巢出血、变形、变性、萎缩、坏死，卵泡破裂等(李玉峰.鸭黄病毒感染研究进展.中国家禽，2011，33(17)：30-31)。

坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属，首次于1970年在马来西亚的库蚊中分离到，不过与坦布苏病毒相关的疫病当时并不清楚。鸭坦布苏病毒病于2010年4月～6月在我国首次大范围爆发，主要集中在种鸭和蛋鸭养殖比较密集的地区。在疫病流行初期，根据卵巢出血、变性、坏死等特征性病变将其命名为鸭出血性卵巢炎。随着病原学研究的深入，2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会将该病名称统一为“鸭坦布苏病毒病”(朱丽萍，颜世敢.鸭坦布苏病毒研究进展.中国预防兽医学报，2012，34(1)：79-82)。

鸭坦布苏病毒可自然感染多种品种的蛋鸭、肉种鸭和野鸭等，感染鸭中以麻鸭多见，其次是樱桃谷种鸭，番鸭最少(刘志刚，孙青松.鸭坦布苏病毒研究进展.中国动物传染病学报，2013，21(1):81-86)。产蛋鸭多以产蛋下降为主要特征，产蛋率一般从70％～90％下降至10％以内，甚至完全停产。发病率为100％，由于饲养管理和后期继发感染的不同，死亡率约为5％～15％不等。商品鸭、育雏育成鸭可在20日龄前后发病，主要表现神经症状，死亡率为10％～30％不等。本病的病程一般为1～1.5个月，可自行恢复，但是产蛋量无法恢复到病前水平。本病的传播途径仍然不完全清楚。

免疫接种是防治该病的最有效手段。本发明人于2013年3月7日提交了一份申请号为201310071963.6的发明专利申请，公开了一种鸭坦布苏病毒病活疫苗，其疫苗株为鸭坦布苏病毒WF100株。实践中，由于WF100株是一株CEF细胞适应毒株，在Vero、BHK₂₁等传代细胞上增殖的时候出现毒价较低、生产效率较低的问题。

发明内容

本发明的目的在于利用本发明人自行分离、保存的一株鸭坦布苏病毒强毒株，在CEF细胞上传一定代次后转接Vero细胞，经Vero细胞连续传代致弱而筛选出增殖水平高、高度适应Vero细胞、具有良好免疫保护效果的弱毒疫苗株WF120株，该弱毒疫苗株安全性好，可用于制备鸭坦布苏病毒病疫苗，有效预防流行鸭坦布苏病毒的攻击。经过试验研究发现，该毒株E蛋白氨基酸序列与已公开的鸭坦布苏病毒E蛋白序列相比有特殊的氨基酸位点差异，并决定了该毒株的安全性及免疫原性，该特征包括：

1.DTMUVWF120株E基因与现公开的鸭坦布苏病毒株比较存在特征性氨基酸位点排列；

2.DTMUVWF120株的E基因与国外坦布苏病毒参考株MM-1775株相比，核苷酸序列同源性为90％，编码的氨基酸序列同源性为96.6％；

3.WF120株的E基因与国内鸭坦布苏病毒参考株相比，核苷酸序列同源性为89.5％～90.4％，编码的氨基酸序列同源性为95.2～96.0％。

本发明技术方案

1.一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株，其特征在于该毒株是由鸭坦布苏病毒强毒株首先在CEF细胞上传代，又经过Vero细胞传代获得，该毒株被命名为鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus)WF120株(简称DTMUVWF120株，该毒株已于2015年11月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.11591。

2.如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株，其特征在于该毒株传代后的E蛋白氨基酸序与序列6的同源性为96.6％以上。

3.如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株，其特征在于所述E蛋白氨基酸序列为序列6。

4.如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株的应用，其特征在于该毒株可用于鸭坦布苏活疫苗的制备。

5.如权利要求4所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株的应用，其特征在于所述鸭坦布苏活疫苗的制备过程包括使用CEF细胞或Vero细胞或BHK₂₁细胞作为疫苗抗原制备用细胞。

具体实施方式

1.鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株的培育

使用9～10日龄活力良好的SPF鸡胚制备CEF细胞，待细胞长成单层后，用鸭坦布苏病毒(DTMUV)强毒株按照2％～3％接种量接种CEF细胞，传代以进行适应性增殖。待感染CEF细胞病变稳定后，对传代毒进行纯化。纯化毒继续传一定代次后转接Vero细胞，经Vero细胞连续传至120代，进行安全性评价，试验如下：

将P120代毒接种170日龄左右产蛋鸭(产蛋率85％左右)，每只肌肉注射1ml，并设置生理盐水对照组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸭群的发病情况、采食量和产蛋量。

结果显示P120代毒接种产蛋鸭后，与对照组比较采食量和产蛋量无明显下降。剖检卵巢无出血、变形等病理变化。说明P120代毒已经致弱，对产蛋鸭没有致病性。

将P120代毒在170～200日龄产蛋鸭上连续传代5代，每代均观察、记录接种鸭的临床表现、采食量和产蛋量。结果显示P120代毒经产蛋鸭传至第5代，接种鸭的精神状态、采食、粪便等仍表现正常，与对照组比较产蛋量无明显差异。说明P120代毒无毒力返强。选取P120代毒作为疫苗研制的候选毒株，命名为鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus)WF120株(简称DTMUVWF120株)，该毒株已于2015年11月27日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.11591。

2.鸭坦布苏病毒病活疫苗的制备方法

使用DTMUVWF120株作为疫苗生产用毒种，使用微载体悬浮培养Vero细胞、悬浮培养BHK₂₁细胞和转瓶培养CEF细胞作为抗原制备用材料及方法，将DTMUVWF120株接种生长良好的细胞，连续培养观察72～96小时，当细胞病变达80％左右时，收获感染的病毒悬液，加入耐热冻干保护剂，经真空冷冻干燥，制成鸭坦布苏病毒病活疫苗。

3.病毒株特性研究

(1)鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株的增殖

1)将经CEF细胞传代的病毒液接种Vero细胞连续传代，培养的病毒液病毒含量较高，可达10^8.5TCID₅₀/ml；

2)将DTMUVWF120株病毒按0.5～1％比例接种长成良好单层的Vero细胞，置37℃、5％CO₂培养箱中静置培养，每天观察CPE，72～96小时后，当细胞病变达80％左右时收获，置-70℃保存。病毒含量≥10^8.5TCID₅₀/ml。

(2)免疫原性

取45只160日龄左右健康易感产蛋鸭，随机分为3组，15只/组，第1组肌肉注射DTMUVWF120株病毒液，0.5ml/只(含10^4.0TCID₅₀)，第2、3组肌肉注射等量生理盐水分别作为攻毒对照和空白对照。免疫后21天，第1组和第2组用鸭坦布苏病毒强毒株攻毒，肌肉注射，1.0ml/只。攻毒后观察21日，统计各组的产蛋情况，与攻毒前1周的产蛋率比较，免疫组和空白对照组产蛋无下降，攻毒对照组攻毒后第3周产蛋率下降46％。结果见表1。

表1WF120株毒种对产蛋鸭的免疫攻毒试验结果

时间	免疫组	空白对照	攻毒对照
				攻毒前1周产蛋率	81％	80％	80％
攻毒后第1周产蛋率	82％	83％	67％
				攻毒后第2周产蛋率	86％	85％	40％
攻毒后第3周产蛋率	85％	85％	34％
				与攻毒前1周比较产蛋率下降数	-4％	-5％	46％

(3)纯净性

按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部.中国农业出版社，2011)附录进行，DTMUVWF120株毒种无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

(4)特异性

将DTMUVWF120株毒种用MEM液稀释至400TCID₅₀/0.1ml，与等量抗鸭坦布苏病毒特异性血清混合后，37℃中和1小时，接种已长成单层的CEF细胞96孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.2ml。另设病毒对照和正常细胞对照，各接种6孔，每孔0.2ml。将细胞培养板置37℃、含5％CO₂培养箱中培养，连续观察120小时。中和组和正常细胞对照组未出现细胞病变效应(CPE)。病毒对照孔全部出现CPE。

4.DTMUVWFG36C株和WF120株的基因特征序列

(1)DTMUV强毒株WFG36C株E基因和疫苗株WF120株E基因序列

1)设计一对引物(序列1和序列2)，用于扩增DTMUV强毒株WFG36C株E基因(序列3和序列4)和疫苗株WF120株E基因(序列5和序列6)。引物的核苷酸序列如下：

上游引物EP1：5’-AACGACGAGAGGCCAGAAGATAAT-3’24(序列1)

下游引物EP2：5’-ACCGCCAGAAAGAGTAAAAT-3’20(序列2)。

2)DTMUVWFG36C株E基因的核苷酸序列为(序列3)：

3)DTMUVWFG36C株E基因的氨基酸系列为(序列4)：

4)DTMUVWF120株E基因的核苷酸序列为(序列5)：

5)DTMUVWF120株E基因的氨基酸序列为(序列6)：

(2)DTMUVWF120株E基因序列的特征

1)疫苗株(120代)的E基因与强毒WFG36C株(5代)相比发生了多个氨基酸位点的变异，具体结果见表2。

表2DTMUVWF120株及强毒WFG36C株E基因氨基酸序列的比较

2)疫苗株的E基因与国外坦布苏病毒参考株MM-1775株、Sitiavan株及来源于GenBank的国内鸭坦布苏病毒参考株相比，氨基酸序列存在多个位点的差异。具体结果见表3

表3疫苗株与不同来源鸭坦布苏病毒参考株的E蛋白氨基酸位点差异

以上比较结果显示：

①DTMUVWF120株E基因的测序结果显示，E基因核苷酸序列总长度为1503bp，编码氨基酸序列大小为501aa，与现公开的鸭坦布苏病毒株比较存在特征性氨基酸位点排列(如表3所示)；

②将DTMUVWF120株的E基因与国外坦布苏病毒参考株MM-1775株相比，核苷酸序列同源性为90％，所推导的氨基酸序列同源性为96.6％；

③将WF120株的E基因与国内鸭坦布苏病毒参考株相比，核苷酸序列同源性为89.5％～90.4％，所推导的氨基酸序列同源性为95.2～96.0％。

由此推测，WF120株传代后的E蛋白氨基酸序列与序列6的同源性在96.6％以上。

5.鸭坦布苏病毒病活疫苗的制备

将DTMUVWF120株接种良好细胞单层，连续观察72～96小时，当细胞病变达80％左右时，收获感染的细胞病毒液，加入耐热保护剂，用最适合此毒株的冻干曲线进行冻干，制备鸭坦布苏病毒病活疫苗。

具体有以下制备步骤：

(1)选择DTMUVWF120株作为疫苗生产用毒种。

(2)抗原的制备，可通过以下3种途径实现

1)选择CEF细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料

将DTMUVWF120株生产用毒种用DMEM稀释后，按1～2％接种到单层CEF细胞，放置于转瓶机上培养；接毒后每12h观察一次，当细胞典型病变时，继续培养至72～96h，至细胞病变达到80％左右，收获毒液，置于-20℃保存。

2)选择微载体培养Vero细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料

将微载体和生物反应器灭菌后，加入细胞生长液。其中，微载体为Cytodex系列微载体(GE公司生产)，使用密度为2～25g/L，接种制苗用细胞进行悬浮培养，待微载体上的细胞形成致密单层后，接种鸭坦布苏病毒生产毒种，病毒接种量为0.05～1.0MOI，并继续培养，培养过程中每天观察细胞病变情况，待细胞病变达到80％以上(即培养72～96h)时，收获病毒液，置于-20℃保存。

制苗用细胞采用5L～30L或5L～30L～150L逐级放大的培养模式，于30L或150L生物反应器培养鸭坦布苏病毒。生物反应器设定参数为：pH：7.0～7.4、温度：36.5～37℃、溶氧：30％～60％、搅拌速度：30～90r/min。

3)选择纯悬浮培养BHK₂₁细胞作为病毒繁殖及抗原制备用材料

在灭菌的生物反应器内加入细胞生长液，接入制苗用细胞进行悬浮培养，待细胞密度达到3×10⁶个细胞/ml，细胞活力在93％以上时，接种鸭坦布苏病毒生产毒种，病毒接种量为0.05～1.0MOI，并继续培养，培养过程中每天观察细胞活力变化情况，待细胞活力下降到20％以下时，收获全悬浮病毒液，置于-20℃保存。

制苗用细胞采用5L～30L或5L～30L～150L逐级放大的培养模式，于30L或150L生物反应器培养鸭坦布苏病毒。生物反应器设定参数为：pH：7.0～7.4、温度：36.5～37℃、溶氧：30～60％、搅拌速度：30～90r/min。

(3)制备的抗原(收获的病毒液)，应按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2010，本发明简称《中国兽药典》)附录逐瓶作无菌检验，并抽样1份测定病毒含量(TCID₅₀)，应无菌生长，每ml病毒含量应≥10^8.5TCID₅₀。

(4)耐热冻干保护剂的配制

以注射用水为溶剂，对耐高压组分NZ-AmineAS、胰蛋白胨、硫脲、明胶按照各自比例溶解后混匀，121℃高压灭菌15min；对不耐高压组分海藻糖、甘氨酸按照各自比例溶解后混匀，0.22μm过滤除菌；然后将两种溶液混合，即为耐热冻干保护剂。

(5)疫苗制备

经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒液与耐热冻干保护剂按1:1配苗。配苗过程中应使耐热冻干保护剂和病毒液充分混匀。疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。

6.鸭坦布苏病毒病活疫苗的检验

(1)性状：疫苗呈微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(3)支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。

(4)鉴别检验：将疫苗用含1％新生牛血清的维持液稀释，与等量抗鸭坦布苏病毒特异性血清混合后，37℃中和1小时，接种已长成单层的CEF细胞96孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.2ml。同时设不中和对照组和正常细胞对照组。将细胞培养板置37℃、含5％CO₂培养箱中培养，观察120～144小时。中和组和细胞对照组应不出现细胞病变效应(CPE)，不中和对照组应全部出现CPE。

(5)外源病毒检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。

(6)安全检验：取1～2周龄SPF鸭10只，分别肌肉注射疫苗10羽份，观察14天，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。

(7)效力检验：将疫苗用灭菌生理盐水稀释至每0.5ml含1羽份，肌肉注射接种180日龄左右健康易感产蛋鸭10只，每只0.5ml，同时设对照鸭10只。免疫后21日每只肌肉注射1.0ml鸭坦布苏病毒强毒。攻毒观察5日后，剖杀，取卵泡膜进行病毒分离。对照组应至少8只病毒分离阳性，免疫组应至少7只病毒分离阴性。

本发明涉及的微生物

鸭坦布苏病毒(DuckTembusuVirus)病毒株WF120株，该病毒株已于2015年11月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.11591。

鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus)病毒株WFG36C株，该病毒是本发明人自行分离、保存的一株鸭坦布苏病毒强毒株。

鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus)病毒株WF100株(CGMCCNo.7306)，该病毒株已于2013年02月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

本发明的积极意义

本发明涉及一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用，用于预防鸭坦布苏病毒病，其积极意义在于：通过将鸭坦布苏病毒强毒在CEF细胞和Vero细胞上的连续传代获得本发明所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株，提高了疫苗株在Vero细胞上的适应能力，更好的提高了该毒株作为疫苗生产毒株的性能；用鸭坦布苏病毒WF120株制备的预防鸭坦布苏病毒病的鸭坦布苏疫苗，相比以往鸭坦布苏病毒病疫苗具有毒株WF120株安全性好、WF120株完全适应Vero细胞后生产成本更低、WF120株免疫效果更好等优势。

实施例

本实施例为进一步说明本发明，对本发明不构成限制。

实施例1

——鸭坦布苏病毒WF120株与WF100株的比较

1.病毒培养特性

WF100株是经CEF细胞传代后选育的弱毒疫苗株，WF120株是经过CEF细胞和Vero细胞传代后选育的弱毒疫苗株。WF120株培养后病毒含量(可高达10^8.5TCID₅₀/ml)是WF100株(可达10^6.5TCID₅₀/ml)的100倍以上，生产效率高。

2.病毒稳定性

WF100株和WF120株作为生产用毒种，均可以使用CEF细胞、BHK细胞和Vero细胞制备病毒液抗原，但WF100株是CEF细胞适应毒，使用BHK细胞和Vero细胞制备抗原时不仅病毒含量较低，而且可能会改变病毒的遗传稳定性。WF120株是CEF细胞和Vero细胞适应毒，使用上述细胞制备抗原时不仅病毒含量高，而且安全、稳定。

实施例2

——生产用毒种制备

取生长良好的Vero细胞单层，弃去生长液，按维持液量1～2％的比例，将DTMUVWF120株毒种加入到细胞瓶中，置37℃培养，待80％的细胞出现病变时收获，定量分装，冷冻保存，注明收获日期，毒种代数等。病毒含量稳定维持在10^8.5TCID₅₀/ml以上。

实施例3

——鸭坦布苏病毒病活疫苗的制备

1.细胞培养罐灭菌及微载体平衡将清洗干净的细胞培养罐于121℃灭菌30min。将灭菌完全的微载体打入细胞培养罐中，加入MEM培养液至最小体积进行平衡。

2.细胞培养和接毒选择生长良好的Vero细胞单层，用胰酶消化后，接种细胞培养罐，接种密度不低于4.5×10⁵个细胞/ml，连续培养2～3日。当细胞密度达到2.0×10⁶～2.5×10⁶个细胞/ml时，换以细胞维持液，按0.05～1.0MOI接种DTMUVWF120株生产用毒种，继续培养。

3.观察与收获接毒后每12h取样观察细胞状态，当细胞出现典型病变时，继续培养至72～96h，即细胞病变达到80％左右，收获毒液，置于-20℃。按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2010，本发明简称《中国兽药典》)附录逐瓶作无菌检验，并抽样1份测定病毒含量(TCID₅₀)。经测定，均无菌生长。

将毒液用含1％新生牛血清的维持液作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-84个稀释度，分别接种长成良好单层的CEF细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100μl，同时设不接毒对照孔。置37℃、含5％CO₂培养箱中培养，观察120小时，记录细胞病变(CPE)孔数。按Reed-Muench法计算TCID₅₀，每毫升病毒含量不低于10^8.5TCID₅₀。

4.冻干以注射用水为溶剂，对耐高压组分NZ-AmineAS、胰蛋白胨、硫脲、明胶按照各自比例溶解后混匀，121℃高压灭菌15min；对不耐高压组分海藻糖、甘氨酸按照各自比例溶解后混匀，0.22μm过滤除菌；然后将两种溶液混合，即为耐热冻干保护剂。

用耐热冻干保护剂与病毒液按体积比1:1混合，分装后，按照设计好的冻干曲线进行冻干，即：-45℃，维持2小时使疫苗迅速冻结，然后抽真空，当真空度达13.3Pa时，开始升温干燥，升华阶段产品温度为-20～-10℃，搁板温度为-8℃，升华时间为15个小时；解析干燥阶段，板层温度5℃保持2小时，升温至28℃保持3小时。

5、疫苗批次按上述方法连续制备3批疫苗，批号分别为1303001、1303002、1303003。

实施例4

——疫苗成品检验

性状微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。

鉴别检验将疫苗用含1％新生牛血清的维持液稀释，与等量抗鸭坦布苏病毒特异性血清混合后，37℃中和1小时，接种已长成单层的Vero细胞96孔细胞培养板，共接种12孔，每孔0.2ml。同时设不中和对照组和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔0.2ml。将细胞培养板置37℃、含5％CO₂培养箱中培养，观察120小时。中和组和细胞对照组均不出现CPE，不中和对照组全部出现了CPE。

外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无外源病毒污染。用PCR法进行检测，无鸭瘟病毒污染。用RT-PCR法进行检测，无鸭肝炎病毒污染。

实施例5

——鸭坦布苏病毒病活疫苗安全性试验

1.雏鸭超剂量接种安全性试验按照0.5ml/只的接种量接种健康易感雏鸭，结果显示接种三批疫苗的雏鸭均未出现局部或全身不良反应，精神、饮食、粪便均正常，剖解结果均正常。

2.产蛋鸭超剂量接种安全性试验按照0.5ml/只的接种量接种180日龄左右的产蛋鸭，结果显示接种三批疫苗的雏鸭均未出现局部或全身不良反应，精神、饮食、粪便均正常，剖解结果均正常，产蛋率未出现下降的情况。

安全性试验说明疫苗对雏鸭和产蛋鸭安全性好。

实施例6

——鸭坦布苏病毒病活疫苗效力试验

1.雏鸭主动免疫效力试验取7日龄左右健康易感雏鸭，免疫鸭坦布苏病毒病活疫苗后二次免疫，二次免疫14日后，用强毒攻毒，结果显示疫苗免疫后的雏鸭均未出现临床症状，并且没有剖检病变。病毒分离率在20％以下，攻毒保护率均在80％以上。

2.雏鸭被动免疫效力试验免疫种鸭21日后，收集种蛋，雏鸭出壳后用强毒攻毒，结果显示免疫接受被动免疫的雏鸭均未出现临床症状，并且没有剖检病变。病毒分离率在20％以下，攻毒保护率均在80％以上。

3.产蛋鸭效力试验免疫产蛋鸭21日后用强毒攻毒，结果显示疫苗免疫后的产蛋鸭均未出现临床症状、没有剖检病变。鸡胚病毒分离率在20％以下，攻毒保护率均在80％以上。

序列表

Claims (5)

1.一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株，其特征在于该毒株是由鸭坦布苏病毒强毒株首先在CEF细胞上传代，又经过Vero细胞传代获得，该毒株被命名为鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus)WF120株(简称DTMUVWF120株，该毒株已于2015年11月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.11591。

2.如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株，其特征在于该毒株传代后的E蛋白氨基酸序与序列6的同源性为96.6％以上。

3.如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株，其特征在于所述E蛋白氨基酸序列为序列6。

4.如权利要求1所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株的应用，其特征在于该毒株可用于鸭坦布苏活疫苗的制备。

5.如权利要求4所述的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株的应用，其特征在于所述鸭坦布苏活疫苗的制备过程包括使用CEF细胞或Vero细胞或BHK₂₁细胞作为疫苗抗原制备用细胞。