CN107937620A - 一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的pcr‑rflp方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR‑RFLP方法，本发明的方法仅需上游引物F和下游引物R（SEQ ID NO.1‑2所示），并仅需常规限制性内切酶Hind III进行RFLP酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程，本发明在禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株快速鉴别诊断检测上快捷准确，解决目前尚未能解决的区别商品化弱毒疫苗毒与野毒株的难题，可以对我国广泛使用疫苗株WF100的养殖场进行禽坦布苏病毒检测与疾病的诊断以及实验研究中这些病毒株的相互鉴别。

Description

一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法

技术领域

本发明涉及兽医传染病快速诊断技术领域，特别涉及一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法。

背景技术

禽坦布苏病毒病是一种禽坦布苏病毒（Tembusu virus, TMUV）引起蛋鸭和种鸭产蛋量骤然下降，甚至绝产的烈性传染性疾病之一。患病的高产蛋率（如95%以上）蛋鸭和种鸭，发病后1周内从产蛋率迅速下降至10%以内，严重的于10天停产，这给我国养鸭业带来了灾难性的打击。目前国内对禽坦布苏病的预防主要是唯一一种商品化的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株（WF100株）。存在的问题是：首先蛋鸭在免疫之后的7天左右才产生良好的细胞免疫和体液免疫应答的能力，而一般情况下蛋鸭免疫完就暴露在可能存在禽坦布苏病毒强毒株的环境里，其次免疫接种不能阻止强毒感染和给鸭提供完全保护，疫苗毒与强毒可以在鸭体内长期共存。禽坦布苏病毒疫苗株（WF100株）的使用给禽坦布苏病毒病的确切诊断带来很大的困难，而目前缺乏区分商品化弱毒疫苗毒株与野毒株的鉴别方法，因此建立区分禽坦布苏病毒疫苗株与野毒株的鉴别方法迫在眉睫。

目前在Genbank里录入的我国分离的禽坦布苏病毒野毒株（含鸭源、鸡源、鹅源和鸽源毒的毒株）在NS5基因中均存在核苷酸AAGCTT（Hind III酶切位点），而疫苗毒株（WF100株）在相对应位置的核苷酸为AAGCCT。同时RFLP（Restriction Fragment LengthPolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）是近年来以基因位点差异而引起内切酶位点不同的一种分子生物学标记技术，已广泛应用于真核细胞基因组种群内、种群间（基因差异往往很小）的分型研究工作中，应用RFLP技术可对DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点进行分析。因此，我们设计1组引物并结合禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒商品化弱毒疫苗株的核苷酸特征，利用HindIII酶进行RFLP酶切分析对禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株进行鉴别诊断。本发明检测方法快捷准确，该PCR-RFLP方法可填补国内外相关领域研究空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法，设计1组引物并结合禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒商品化弱毒疫苗株的核苷酸特征，利用Hind III酶进行RFLP酶切分析对禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株进行鉴别诊断。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP引物，所述的引物为：

上游引物F：5’- TCAAACCAAGAGGCAAAGTTGT -3’，

下游引物R：5’ -CATATTCTCTGGCCAAATTCTTC -3’。

利用所述引物建立的区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法，所述方法包括如下：

（1）RT-PCR扩增反应体系为提取的病毒RNA模板2μL、10 μM上游引物F 1μL、10 μM下游引物R 1μL、2×One-Step Reaction Mix 20μL、Trans ScriptⅡ One-Step Enzyme Mix1μL，补充灭菌去离子水15μL至终体积40μL；RT-PCR扩增反应条件为：50℃反转录30 min后进行PCR扩增，条件为：94℃预变性 4 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，72℃延伸 10 min，4℃保存备用；

（2）将RT-PCR产物经胶回收后，利用RFLP进行Hind III酶切分析；酶切反应体系30 μL，其中RT-PCR胶回收产物20 μL、10×QuickCut Buffer 3 μL、QuickCut Hind III酶1 μL，补充灭菌去离子水6 μL至终体积30 μL；反应条件： 37℃水浴反应10 min。

所述的引物在制备区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株试剂盒中的应用。

本发明的优点在于：

其仅需上游引物F和下游引物R，并仅需限制性内切酶Hind III进行RFLP酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程。

禽坦布苏病毒商品化弱毒疫苗株与强毒株的致病性差异很大，但其基因组很相似，疫苗株（WF100株）的使用给禽坦布苏病毒的确切诊断带来很大的困难。本发明所建立的方法能区分禽坦布苏病毒疫苗WF100株与野毒株的鉴别方法。解决目前尚未能解决的区别商品化弱毒疫苗毒与野毒株的难题，可以对我国广泛使用疫苗株WF100的养殖场进行禽坦布苏病毒检测与疾病的诊断以及实验研究中这些病毒株的相互鉴别。这对于调查鸭群出现禽坦布苏病毒病免疫失败的原因、调查鸭群早期感染野毒、疫病的流行病学以及临床减蛋病的确切诊断、环境病毒的检测和禽坦布苏病毒病的预防与控制具有重要的意义及应用价值。

附图说明

图1 NS5基因的RT-PCR检测结果。

图2 限制性内切酶Hind III酶切结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1

1、提取病毒的核酸RNA；

（1）病毒来源：

禽坦布苏病毒野毒株代表株（WR株）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存；鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株为齐鲁动物保健品有限公司生产的鸭坦布苏病毒病活疫苗（WF100株）（批准文号：兽药生字150252276）。

（2）提取病毒RNA：

用常规方法分别提取禽坦布苏病毒野毒株代表株（WR株）和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株（WF100株）的核酸RNA，以备RT-PCR扩增使用。

2、RT-PCR扩增

（1）扩增引物的设计和选择：

根据禽坦布苏病毒野毒株和弱毒疫苗毒株NS5基因特征设计上游引物F和下游引物R，其中，引物的序列如下：

上游引物F：5’- TCAAACCAAGAGGCAAAGTTGT -3’，

下游引物R：5’ -CATATTCTCTGGCCAAATTCTTC -3’。

如图1所示：本发明设计的上下游引物扩增区域对禽坦布苏病毒野毒株和弱毒疫苗毒株NS5基因的扩增区域存在核苷酸差异（我国在Genbank登入的禽坦布苏病毒野毒株基因NS5核苷酸序列均为AAGCTT（Hind III酶切位点）），而鸭坦布苏病毒商品化弱毒疫苗毒株为AAGCCT。

（2）RT-PCR扩增：

用上述设计的特异性引物F和R进行RT-PCR扩增，扩增反应体系如下：

采用Trans ScriptⅡ One-Step RT-PCR SuperMix(购自北京全式金生物技术有限公司)推荐的RT-PCR扩增反应体系（40 μL，见表1）。其中，提取的病毒RNA模板2μL、上游引物F（10 μM）1μL、下游引物R（10 μM）1μL、2×One-Step Reaction Mix 20μL、Trans ScriptⅡOne-Step Enzyme Mix1μL，补充灭菌去离子水15μL至终体积40μL。

表1：RT-PCR反应体系

RT-PCR扩增反应条件为：50℃反转录30 min后进行PCR扩增。条件为：94℃预变性 4min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，72℃延伸 10 min，4℃保存备用。

（3）凝胶电泳检测：

扩增产物用常规的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像，结果如图2所示。

如图2所示：在上述条件下，禽坦布苏病毒野毒株代表株（泳道1）和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株（泳道2）的样品均可以扩增出一条大小为660 bp的片段。

3、RFLP分析

将RT-PCR产物经胶回收后，利用RFLP进行Hind III酶切分析。酶切体系如下：

采用QuickCut Hind III(购自宝生物工程（大连）有限公司)推荐的酶切反应体系（30μL，见表2），其中RT-PCR胶回收产物20 μL、10×QuickCut Buffer 3 μL、QuickCut HindIII酶1 μL，补充灭菌去离子水6 μL至终体积30 μL。

反应条件： 37℃水浴反应10 min。

表2：酶切反应体系

反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析禽坦布苏病毒野毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株类型，结果如图1所示，禽坦布苏病毒野毒株（泳道1）和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株（泳道2）条带大小为660bp，与预期结果相符。

如图2所示：禽坦布苏病毒野毒株可被切成2段，大小分别为235 bp和425 bp（泳道1）；而鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株基因NS5的扩增片段中没有Hind III酶切位点，被酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍为660 bp（泳道2）。

如下所示：Hind III酶切位点位于禽坦布苏病毒野毒株（street strain）基因NS5的扩增产物的235-240位（AAGCTT）；鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株(vaccine strain)基因NS5的扩增片段中没有Hind III酶切位点，此处序列为AAGCCT。

禽坦布苏病毒弱毒株和强毒株NS5部分序列的比对结果：

Street strain：ACTGCTGTGTGACATAGGTGAAGCTTCACCCGTCCCAGAAATTGA；

Vaccine strain:GTGGGGTCAATGTCCATTTCAAGCCTACCGAACCATCTGACACAT。

4、临床应用

本发明对217份临床采集的产蛋下降症状或死亡鸭病料进行检测，提取核酸RNA后进行RT-PCR检测，经琼脂糖凝胶电泳进行胶回收后进行Hind III酶切，其中禽坦布苏病毒野毒株23株，阳性率为10.6%（23/147）；鸭坦布苏病毒疫苗毒株2株，阳性率为0.9%（2/217）；检测到禽坦布苏病毒野毒株与疫苗毒株共感染4株，阳性率为1.8%（4/217）。

随机选取检测为禽坦布苏病毒野毒株阳性1个样品、鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株阳性1个样品的RT-PCR产物进行克隆测序，结果符合预期。且禽坦布苏病毒野毒株阳性样品在此处核苷酸序列均为AAGCTT；鸭坦布苏病毒弱毒疫苗毒株阳性样品在此处核苷酸序列均为AAGCCT，均符合引物设计时的基因特征。

本发明的优点在于，其仅需上游引物F和下游引物R，并仅需限制性内切酶HindIII进行RFLP酶切后进行鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法

<130> 2

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcaaaccaag aggcaaagtt gt 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catattctct ggccaaattc ttc 23

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actgctgtgt gacataggtg aagcttcacc cgtcccagaa attga 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtggggtcaa tgtccatttc aagcctaccg aaccatctga cacat 45

Claims (3)

1.一种区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP引物，其特征在于：所述的引物为：

上游引物F：5’- TCAAACCAAGAGGCAAAGTTGT -3’，

下游引物R：5’ -CATATTCTCTGGCCAAATTCTTC -3’。

2.利用权利要求1所述引物建立的区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述方法包括如下：

（1）RT-PCR扩增反应体系为提取的病毒RNA模板2μL、10 μM上游引物F 1μL、10 μM下游引物R 1μL、2×One-Step Reaction Mix 20μL、Trans ScriptⅡ One-Step Enzyme Mix1μL，补充灭菌去离子水15μL至终体积40μL；RT-PCR扩增反应条件为：50℃反转录30 min后进行PCR扩增，条件为：94℃预变性 4 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸45 s，共35个循环，72℃延伸 10 min，4℃保存备用；

（2）将RT-PCR产物经胶回收后，利用RFLP进行Hind III酶切分析；酶切反应体系30 μL，其中RT-PCR胶回收产物20 μL、10×QuickCut Buffer 3 μL、QuickCut Hind III酶1 μL，补充灭菌去离子水6 μL至终体积30 μL；反应条件： 37℃水浴反应10 min。

3.如权利要求1所述的引物在制备区别禽坦布苏病毒弱毒疫苗株和野毒株试剂盒中的应用。