CN107034311A - 快速检测鸭瘟病毒lamp试剂盒 - Google Patents

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CN107034311A CN201710065991.5A CN201710065991A CN107034311A CN 107034311 A CN107034311 A CN 107034311A CN 201710065991 A CN201710065991 A CN 201710065991A CN 107034311 A CN107034311 A CN 107034311A
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王婧
余波
史开志
杨莉
吴位珩
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Abstract

本发明公开了一种快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒。本发明构建了一套完整的LAMP体系，LAMP扩增法可使用水浴锅或保温杯进行扩增，结果肉眼可见，操作相对简单，特别适合基层现场检疫，且敏感性高。检测时间(含样品处理时间)由原来的3‑4h缩短为2h，其检测限达1pg/mL，特异性为100％，无假阳性和假阴性出现。利用该试剂盒与DPV病原PCR检测方法(GB/T 22332‑2008)分别检测200个病鸭样品中的鸭瘟病毒，两种方法的符合率达100％。本发明试剂盒具有高效、特异性强和敏感性高等特点，可满足大批量样品快速检测的要求。因此建立的LAMP诊断方可进行现场快速检测，并且结果准确，使用方便。

Description

快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒
技术领域
本发明涉及家畜饲养及疾病防治领域，尤其是一种快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒。
背景技术
鸭瘟(Duck plague，DP)又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis， DVE)，是由疱疹病毒科的鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽类的一种急性、热性、败血性传染病，主要临床特征为体温升高、两腿麻痹、下痢、流泪和部分病鸭头、颈部肿大，故该病在我国有些地方俗称“大头瘟”。鸭瘟自1923年首次在荷兰报道，之后在世界各地许多养鸭国家均报导有该病的发生和流行，我国于1957年在广州首次发现该病。多年来鸭瘟以高达90％的死亡率引起社会广泛关注，另外该病传播速度很快，加上集约化养鸭业鸭群密度高、流动频繁、极易引起流行，而且该病在一个大流行期后常呈地方性流行，长期危害养鸭业，造成巨大的经济损失。
目前对鸭瘟病毒的检测方法主要有病毒分离鉴定、ELISA法、血清中和试验及PCR技术等。但病毒分离鉴定方法在低毒力或非致病性毒株情况下可能不引起临床症状；血清学中和试验虽然结果准确，但程序复杂，耗时费力，不能用于快速诊断及大批量样品的检测；ELISA是目前使用最为广发的一种方法，具有经济、简便、快速的特点，但灵敏度较PCR技术而言稍有差距；传统PCR技术具有灵敏度高、特异性强等特点，但该检测方法成本高，对操作者技术及反应仪器要求较高，扩增反应时间较长，不利于快速检测及在基层实验室的推广应用。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本学者Notomi等建立的一种新的核酸扩增方法，原理是利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA，在1h内能达到 109靶序列拷贝。
发明内容
本发明的目的是：提供一种快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒，它能快速、准确的对鸭瘟病毒进行检测，并且成本低廉，使用方便，以克服现有技术的不足。
本发明是这样实现的：快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒，在 25μL体系DPV-TK LAMP扩增体系中包括，浓度为5mol/L的甜菜碱5μL，浓度为8000U/mL Bst DNA的聚合酶0.8μL，浓度为0.1mol/L 的硫酸镁1.0μL，浓度为0.25mol/L的dNTPs 1.4μL，浓度为 10pmol/μL的外引物F3/B3各0.5μL，浓度为10pmol/μL的内引物 FIP/BIP各4.0μL，DNA模板1μL，1μL BYBRGreenI，其余由无核酸酶ddH2O补足至25μL，其中，外引物F3的序列为 5’-TGCGAACGCTTAATCCGG-3’，外引物B3的序列为5’- TGCTATGTCACCTCGAGCT-3’；内引物FIP的序列为5’- GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTATGCCT-3’，内引物BIP的序列为5’-GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTATGCCT-3’；该体系在62℃扩增60min。
为了验证本发明的技术效果，进行了以下试验：
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株 本试验的DPV活疫苗(鸡胚化弱毒株)购自南京天邦生物技术有限公司，鸭疫里默氏杆菌标准菌株购自中国兽医微生物保藏管理中心(CVCC)；DPV Gz株由贵州大学动物科技学院惠赠；DPV CHv强毒株、大肠杆菌、鸭疫里默氏巴氏杆菌、鸭沙门氏菌由本实验室分离鉴定后保存。
1.1.2试剂和仪器 Bst 2.0DNA聚合酶购自New England Biolabs公司；Betaine(甜菜碱)、MgSO4购自Sigma公司；dNTPs、无核酸酶ddH2O、DL500DNA Maker、基因组DNA提取试剂DNAiso Reagant、购自宝生物(大连)工程有限公司；Gold view核酸染料、 50×TAEBuffer购自生工生物工程(上海)股份有限公司；梯度PCR仪 (Veriti)，AppliedBiosystems公司；凝胶成像仪(Alpha Imager HP)，美国Alpha Innotech公司。
1.1.3引物 根据Genbank中DPV TK基因序列(NCBI登录号为 DQ640611.1)，通过网址http://primerexplorer.jp/e/index.html设计2对特异性引物，即F3/B3和FIP/BIP，序列如下：
以上引物均委托宝生物(大连)工程有限公司。
1.2方法
1.2.1病毒DNA的提取 根据基因组DNA提取试剂DNAiso Reagant说明书所示提取DPV基因组DNA，提取出的DNA溶解于适量的无核酸酶ddH2O中，-20℃保存备用。
1.2.2阳性对照样品的制备 将外引物PCR扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化后，克隆到载体Pmd 19－T上，经PCR及测序分析后，提取质粒DNA作为阳性对照。
1.2.3 LAMP反应条件优化 根据LAMP反应条件，对Betaine、 Bst DNA聚合酶、MgSO4、dNTPs及内引物(由于外引物对试验结果影响很小)的浓度等条件进行优化。Betaine(5mol/L)在25μL反应体系中的加入量分别为：2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL； Bst DNAPolymerase(8000U/mL)加入量分别为：0.6μL、0.8μL、 1.0μL、1.2μL、1.4μL、1.6μL、1.8μL、2μL；MgSO4(0.1mol/L)加入量分别为：0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL、1.4μL、1.6μL、 1.8μL；dNTPs(0.25mol/L)加入量分别为：1.0μL、1.2μL、1.4μL、 1.6μL、1.8μL、2.0μL、2.2μL、2.4μL；内引物FIP/BIP(10pmol/μL) 加入量分别为：1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL、3.5μL、4.0μL、4.5μL、 5.0μL、5.5μL、6.0μL。逐个对条件进行优化，优化时其他条件不变，以确定最佳反应体系。扩增温度分别为：60℃、61℃、62℃、63℃、 64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃，以确定最适扩增温度。反应时间按15min、30min、45min、60min、90min、120min，以确定最优反应时间。
1.2.4特异性试验 用6株DPV和8株非DPV进行验证。提取其基因组DNA运用试剂盒进行检测，验证试剂盒检测DPV的种属特异性。
1.2.5敏感性试验 按照基因组DNA提取试剂DNAiso Reagant 说明书所示，提取DPV DNA，通过紫外分光光度计检浓度后，通过倍比稀释为：10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL、1pg和 0.1pg/mL，进行LAMP扩增反应，确定试剂盒的检出限。
1.2.6临床样本检测 采集的病鸭样品共80份，使用基因组DNA 提取试剂DNAisoReagant提取基因组DNA，用本研究研制的试剂盒进行检测，并与DPV病原PCR检测技术(GB/T22332-2008)检测结果进行比较。
2结果
2.1重组阳性对照品的克隆测序
构建的试剂盒阳性(质粒)对照经宝生物(大连)工程有限公司测序，序列大小为240bp，与设计一致。将此序列在NCBI中进行 Blast比对分析，结果表明，该序列与Genbank上DPV病毒的TK基因同源性大于99％。
2.2反应体系
经过对反应体系和反应条件的摸索和调整(如图1-7所示)，确定在25μL体系DPV-TK LAMP扩增体系为：Betaine(5mol/L)5μL， Bst DNA聚合酶(8000U/mL)0.8μL，MgSO4(0.1mol/L)1.0μL， dNTPs(0.25mol/L)1.4μL，外引物F3/B3(10pmol/μL)0.5μL，内引物FIP/BIP(10pmol/μL)4.0μL，DNA模板1μL，1μL BYBR Green I，无核酸酶ddH2O补足至25μL，62℃扩增60min。将扩增结束后的反应管置于紫外灯背景下观察。阴性反应管液体为无色，阳性反应管液体发出绿色荧光(图8)。
2.3特异性
用建立的LAMP方法对DPV，鸭疫里默氏菌，鸭源性多杀性巴氏杆菌，大肠杆菌、鸭沙门氏菌及健康鸭进行检测，结果显示(图 9)，鸭疫里默氏菌，鸭源性多杀性巴氏杆菌，大肠杆菌、鸭沙门氏菌及健康鸭均未出现条带，只有DPV DNA为模板的第一条泳道扩增出了LAMP反应典型的梯状条带。
2.4敏感性
应用试剂盒对DPV各个稀释度基因组DNA提取液进行检测后，如图9所示，模板DNA稀释度大于1pg/mL时，均可检测出扩增产物，0.1pg/mL及0.01pg/mL DNA模板量下，电泳无法检测出扩增产物。因此，该试剂盒对于DPV DNA量的检出限为1pg/mL。
2.5临床样本检测
应用该试剂盒通过对200份样品进行检测，有33份样品中检出 DPV，检出率为16.5％，与DPV病原PCR检测技术(GB/T 22332-2008) 检测结果完全一致，但比DPV病原PCR检测技术(GB/T 22332-2008) 更快速和简便。
3讨论
DPV属于α疱疹病毒亚科，是一种泛噬性全身性感染的病毒，能够引起鸭、鹅和天鹅的急性败血，感染病鸭以脑、脾、肝、食道、泄殖腔的含毒量最高。该病发病快、传播速度快，成鸭感染后发病率较雏鸭高，死亡率高达90％左右，目前已经成为危害水禽最为严重的疾病之一，给养鸭业造成重大经济损失。基于近几年来鸭瘟的临床症状逐渐不明显，时而伴随细菌性或病毒性疾病的发生，增加了临床诊断的难度。因此，实验室诊断技术包括：病毒的分离鉴定，分子生物学诊断及血清学诊断的需求日趋明显。
LAMP是由Notomi等学者在2000年开发的一项核酸检测新技术，这项技术虽然反应原理复杂，但反应时间为30-60min，只需一个恒温箱或水浴锅即可完成反应，可通过观察白色沉淀的生成或加入染料后颜色的变化、凝胶电泳结果来判断反应是否发生，与传统 PCR技术相比告别了昂贵的PVR仪，操作简单，更加方便快捷，有利于疫病的检测控制，特别适合基层、养殖户及出入境检疫的病原快速诊断。
胸腺激酶(Thymidine kinase,TK)基因属于疱疹病毒的早期基因和主要的毒力基因之一，缺失TK基因的毒株在非分裂细胞中的复制能力极弱，但免疫原性却没有发生改变。因其特有的安全性，使得TK基因成为构建疱疹病毒基因缺失疫苗的首选靶基因。已有研究表明，DPV TK基因与禽类疱疹病毒(α-疱疹病毒)的进化关系最近。本研究首次选用TK基因作为LAMP检测的目的基因，经 Blastn比对分析，理论上保证扩增片段位于TK基因的保守区段，经过对实际菌株样本的进一步检测验证，表明本研究建立的LAMP 试剂盒能够特异性检测和鉴定DPV，并且与养殖生产中产检的病原：鸭疫里默氏杆菌、鸭多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和鸭沙门氏菌无交叉反应，具有很强的特异性，有效避免了假阳性结果的产生。有文献报道，而魏雪涛等[6]研究者建立的鸭瘟病毒PCR检测灵敏度为15pg/mL，而本研究建立的DPVLAMP检测试剂盒检测DPV基因组DNA灵敏度达1pg/mL，检测灵敏度高于常规PCR检测手段。余洋建立的DPV Taqman实时荧光定量PCR方法同样以TK基因作为检测目的基因，灵敏度约为5copies/μL，在3h内实现对DVP诊断的同时，也实现了对病毒的定量检测，但该检测成本高，需要操作者较高的试验操作水平，而目前我国大部分基层动物预控中心及养殖场仍未配备荧光定量PCR仪或普通PCR仪。本研究利用LAMP 技术，能够在不具备荧光定量PCR仪及普通PCR仪的条件下，将检测时间(包括样品处理)缩短至2h以内，检测方法操作简便，扩增完成后无需打开反应管盖，可直接于紫外灯下观察产物颜色的变化来判断病原感染情况，最大程度地避免了假阳性的产生。综上所述，本研究所建立的DPV诊断诊断试剂盒灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作简便，更适用于低污染量样品的检测，通过也满足了基层实验室或养殖场大规模普查需要，具有广阔的推广应用前景。
由于采用了上述技术方案，本发明构建了一套完整的LAMP体系，LAMP扩增法可使用水浴锅或保温杯进行扩增，结果肉眼可见，操作相对简单，特别适合基层现场检疫，且敏感性高。检测时间(含样品处理时间)由原来的3-4h缩短为2h，其检测限达1pg/mL，特异性为100％，无假阳性和假阴性出现。利用该试剂盒与DPV病原 PCR检测方法(GB/T 22332-2008)分别检测200个病鸭样品中的鸭瘟病毒，两种方法的符合率达100％。本发明试剂盒具有高效、特异性强和敏感性高等特点，可满足大批量样品快速检测的要求。因此建立的LAMP诊断方可进行现场快速检测，并且结果准确，使用方便。
附图说明
图1 MgSO4浓度优化；
M:DL500 Marker；1:1.8μL；2:1.6μL；3:1.4μL；4:1.2μL； 5:1.0μL；6:0.8μL；7:0.6μ；8:0.4μL；
图2 Betaine浓度优化；
M:DL500 Marker；1:8μL；2:7μL；3:6μL；4:5μL；5： 4μL；6:3μL；7:2μL；
图3 dNTP浓度优化；
M:DL500 Marker；1:1.0μL；2:1.2μL；3:1.4μL；4:1.6μL； 5:1.8μL；6:2.0μL；7:2.2μL；8:2.4μL
图4 Bst DNA聚合酶浓度优化；
M:DL500 Marker；1:0.6μL；2:0.8μL；3:1.0μL；4:1.2μL； 5:1.4μL；6:1.6μL；7:1.8μL；8:2μL
图5内引物(FIP/BIP)浓度优化；
M:DL500 Marker；1:1.5μL；2:2.0μL；3:2.5μL；4:3.0μL； 5:3.5μL；6:4.0μL；7:4.5μL；8:5.0μL；9:5.5μL；10: 6.0μL；
图6扩增温度条件优化；
M:DL500 Marker；1:70℃；2:69℃；3:68℃；4:67℃；5: 66℃；6:65℃；7:64；8：63℃；9:62；10:61℃；11:60℃
图7反应时间优化；
M:DL500 Marker；1:120min；2:90min；3:60min；4:45min； 5:30min；6:15min；
图8LAMP反应染色结果；
A：添加Goldview后，在自然光下，左边为DPV阳性，右边为DPV 阴性；
B：添加Goldview后，在紫外灯下，左边为DPV阳性，右边为 DPV阴性。
具体实施方式
本发明的实施例：快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒，在25μL体系DPV-TK LAMP扩增体系中包括，浓度为5mol/L的甜菜碱5μL，浓度为8000U/mL Bst DNA的聚合酶0.8μL，浓度为0.1mol/L的硫酸镁1.0μL，浓度为0.25mol/L的dNTPs 1.4μL，浓度为10pmol/μL 的外引物F3/B3各0.5μL，浓度为10pmol/μL的内引物FIP/BIP各 4.0μL，DNA模板1μL，1μL BYBRGreenI，其余由无核酸酶ddH2O 补足至25μL，其中，外引物F3的序列为 5’-TGCGAACGCTTAATCCGG-3’，外引物B3的序列为5’- TGCTATGTCACCTCGAGCT-3’；内引物FIP的序列为5’- GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTAT GCCT-3’，内引物BIP的序列为5’- GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTAT GCCT-3’；该体系在62℃扩增60min。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州省畜牧兽医研究所
<120> 快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒
<130> nm:
<160> 4
<170> PatentIn version
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据Genbank中DPV TK 基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计，以用LAMP扩增。
<400> 1
TGCGA ACGCT TAATC CGG 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据Genbank中DPV TK 基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计，以用LAMP扩增。
<400> 2
TGCTA TGTCA CCTCG AGCT 19
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据Genbank中DPV TK 基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计，以用LAMP扩增。
<400> 3
GGTTT TGCCA GTTCC ATACG GCTTT TCCTT CGATG CCAT T ATGCC T 46
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据Genbank中DPV TK 基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计，以用LAMP扩增。
<400> 4
AGCCA CTCTT TATGT TGCCG AGCTT TTCTG TGTTT CGTAT ACGCC CT 47

Claims (1)

1.一种快速检测鸭瘟病毒LAMP试剂盒，其特征在于：在25μL体系DPV-TK LAMP扩增体系中包括，浓度为5mol/L的甜菜碱5μL，浓度为8000U/mL Bst DNA的聚合酶0.8μL，浓度为0.1mol/L的硫酸镁1.0μL，浓度为0.25mol/L的dNTPs 1.4μL，浓度为10p mol/μL的外引物F3/B3各0.5μL，浓度为10pmol/μL的内引物FIP/BIP各4.0μL，DNA模板1μL，1μL BYBR GreenⅠ，其余由无核酸酶ddH2O补足至25μL，其中，外引物F3的序列为5’-TGCGAA CGCTTAATCCGG-3’，外引物B3的序列为5’-TGCTATGTCAC CTCGAGCT-3’；内引物FIP的序列为5’-GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTATGCCT-3’，内引物BIP的序列为5’-GGTTTTGCCAGTTCCATACGGC-TTTT-CCTTCGATGCCATTATGCCT-3’；该体系在62℃扩增60min。
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