CN103060475A

CN103060475A - 一种锦鲤疱疹病毒lamp检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN103060475A
Application number: CN2013100194017A
Authority: CN
Inventors: 曾令兵; 张辉; 周勇; 徐进; 范玉顶
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明公开了一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒及检测方法，一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：10×ThermoPol Reaction缓冲液；Bst DNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl₂，1000×SYBR Green I。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的KHV，能检测KHV感染的病鱼组织，能检测KHV感染的细胞，非常适用于KHV的现场快速检测。

Description

一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，还涉及一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法。

背景技术

1998年5月在以色列的Magan Michael地区首次暴发锦鲤疱疹病毒病，同年成功分离出了病原锦鲤疱疹病毒（Koi herpes virus，KHV），为疱疹病毒科（Herpesviridae），鲤疱疹病毒属（Cyprinid herpesvirus）成员，又称鲤疱疹病毒Ⅲ型（CyHV-Ⅲ）。锦鲤疱疹病毒病迅速扩展至世界各地。2002年首次证实该病已传至我国，近年来给我国框镜鲤、鲤鱼的养殖业造成严重的经济损失。

目前的诊断方法有细胞培养分离技术、电镜技术、PCR、ELISA、原位杂交技术等,聚合酶链式反应(PCR)和细胞培养技术是OIE推荐的诊断方法。但是这些方法都有各自的局限性，为了及早发现和确诊锦鲤疱疹病毒病，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为鲤鱼养殖业的健康发展提供技术保障。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法（国际专利公开号WO00/28082），针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的KHV毒株的TK基因编码区序列(DQ177346)，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplore r.jp/elamp4.0.0/index.html）在线软件设计特异性引物，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对锦鲤疱疹病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的KHV，能检测KHV感染的病鱼组织，能检测KHV感染的细胞（例如Koi-Fin细胞），非常适用于KHV的现场快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：10×ThermoPol Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl₂，1000×SYBR Green I（Invitrogen）。

F3：5'-GCATCGCCGTCAAGCAC-3'；

B3：5'-GCAGCTGCACGACTCC-3'；

FIP：5'-AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACA-3'；

BIP：5'-ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC-3'。

一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其步骤是：

1、病毒DNA的获取：

采用

试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA，模板DNA在95℃5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。

2、LAMP扩增：

采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂2-10mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，去离子水补足余量。选择55-65℃的温度范围和30-120分钟的时间范围进行LAMP反应之后，80℃灭活2分钟。

3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定：

1）发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。

2）每25μl体系的反应管加1000×SYBR Green I（Invitrogen）1-2μl，1-5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。

3）取扩增产物，用2%（w/v）的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。

一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法（最佳条件），其步骤是：

1、病毒DNA的获取:

采用

2、LAMP扩增:

采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂8mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPolReaction Buffer2.5μl。反应管于62℃温育60分钟进行LAMP反应之后，80℃灭活2分钟。

3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定：

3）取扩增产物，用2%（w/v,以下相同）的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、特异性好，能有效检测出锦鲤疱疹病毒；

2、快速高效，检测时间约1小时，非常适用于KHV的现场快速检测；

3、不需要特殊试剂与设备，检测成本低；

4、鉴定简单，通过从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，经肉眼就可判断结果，通过加入1000×SYBR Green I，可提高结果的灵敏度。

附图说明

图1为一种锦鲤疱疹病毒LAMP试剂盒检测结果的特异性的示意图。

从左至右的泳道依次为空白对照（水）、鳗疱疹病毒、鲤疱疹病毒2型、GSIV、KHV、DL2,000Marker。

图2为一种锦鲤疱疹病毒LAMP试剂盒检测结果的灵敏度的示意图。

从左至右的泳道依次为1fg KHV、10fg KHV、100fg KHV、1pg KHV、10pg KHV、100pgKHV、1ng KHV、DL2000DNA Marker。

具体实施方式

下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。若无特别说明，本发明所用试剂均为上海生工生物工程公司生产。

实施例1：

一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒它包括以下成分：10×ThermoPol Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl₂，1000×SYBRGreenI（Invitrogen）。

F3：5'-GCATCGCCGTCAAGCAC-3'；

B3：5'-GCAGCTGCACGACTCC-3'；

FIP：5'-AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACA-3'；

BIP：5'-ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC-3'。

实施例2：

锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒不同浓度的Mg²⁺的优化

一、取待检样品提取病毒DNA:

培养锦鲤鳍条细胞系(Koi-Fin)至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为0.1的剂量，接种1mL经4000r/min离心5min除去细胞碎片的锦鲤疱疹病毒细胞毒材料（朱霞,李新伟,王好,等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报,2011,33(5):340-343.）添加10μL的Polybrene（终浓度10μg/ml），置于26℃培养箱中吸附1h，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附1h后，吸弃病毒液，加入5mL2%胎牛血清（V/V）的培养液，置26℃培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，于-80℃至室温（20-25℃）反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。

二、LAMP扩增的反应体系:

采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPol ReactionBuffer2.5μl，去离子水补足余量。

其中Mg²⁺的浓度分别为2、4、6、8和10mM。

三、LAMP扩增的反应条件:

反应管于62℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。

四、检测结果判定:

取8μl扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示Mg²⁺的浓度为8mM时结果最好。

实施例3：

锦鲤疱疹病毒LAMP检测方法反应温度的优化:

一、取待检样品提取病毒DNA:

待KHV感染的Koi-Fin细胞出现90%病变后收获（制备方法同实施例2），于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。

二、LAMP扩增的反应体系:

采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂8mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPolReaction Buffer2.5μl，去离子水补足余量。

三、LAMP扩增的反应条件:

反应管分别置于60、61、62、63、64、65℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。

四、检测结果判定:

取8μl扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示62℃时结果最好。

实施例4：

锦鲤疱疹病毒LAMP检测方法的特异性

一、取待检样品提取病毒DNA:

GSIV（中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO:V201134）感染的EPC细胞、鳗疱疹病毒（F Rijsewijk,S Pritz-Verschuren,SKerkhoff,A Botter,M Willemsen,T Nieuwstadt,O Haenen.2005.Development of a polymerase chain reaction for the detection of Anguillid herpesvirus DNAin eels based on the herpesvirus DNA polymerase gene.Journal of Virological Methods124:8794.）感染的EPC细胞、KHV感染的Koi-Fin细胞出现90%病变后收获（上述病毒的制备方法同KHV），鲤疱疹病毒2型检测阳性的病鱼组织的PBS匀浆液，于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。

二、LAMP扩增的反应体系:

采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂8mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPolReaction Buffer2.5μl。

三、LAMP扩增的反应条件:

反应管于62℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。

四、检测结果判定:

取8μl扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示针对KHV设计的特异LAMP引物组能保证对KHV的特异性检测，只检测出KHV，而GSIV、鳗疱疹病毒、鲤疱疹病毒2型和空白对照均无法检出（图1）。

实施例5

锦鲤疱疹病毒LAMP检测方法的灵敏度

一、取待检样品提取病毒DNA:

待KHV感染的Koi-Fin细胞出现90%病变后收获（制备方法同实施例2），于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。临用前测定样品浓度，用灭菌水调整并制备10倍稀释的系列模板：0.2ng/μl至0.2fg/μl。

二、LAMP扩增的反应体系:

三、LAMP扩增的反应条件:

反应管于62℃温育60分钟后，80℃灭活2分钟。

四、检测结果判定:

取8μl扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示能够检测到1pg的KHV（图2）。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒及检测方法

<130> 一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒及检测方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 锦鲤疱疹病毒

<400> 1

GCATCGCCGT CAAGCAC 17

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 锦鲤疱疹病毒

<400> 2

GCAGCTGCAC GACTCC 16

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 锦鲤疱疹病毒

<400> 3

AGATGGCCGG GTAGGTCGCT TTTGCCATAG ACCAGCGCTA CA 42

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 锦鲤疱疹病毒

<400> 4

ACCTGTACGA GGTGATGCAG CTTTTAGGTC GGGGAAGAAC TGTC 44

Claims

1.一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：10×ThermoPol Reaction 缓冲液；Bst DNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl₂，1000×SYBR Green I;

F3：5^，- GCATCGCCGTCAAGCAC - 3^，；

B3：5^，- GCAGCTGCACGACTCC -3^，；

FIP：5^，-AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACA - 3^，；

BIP：5^，-ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC - 3^，。

2.利用权利要求1所述的一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其步骤是：

1）、病毒DNA的获取:

采用DNAzol^?试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA；

2）、LAMP扩增:

采用25μl反应体系：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂2-10mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，选择55-65℃和30-120分钟进行LAMP反应之后，80℃灭活2分钟；

3）、检测结果判定，采用下述三种方式之一：

A、发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；

B、每25μl体系的反应管加1000×SYBR Green I 1-2μl，1-5 min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性；

C、取扩增产物，用2%( w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。

3.根据权利要求2所述的一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于：MgCl₂ 的浓度为8mM。

4.根据权利要求2所述的一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于：反应温度为62℃。

5.根据权利要求2所述的一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于：模板DNA在95℃5分钟后置于冰浴中的预处理。