CN105256071A - 一种快速检测鲤疱疹病毒iii型的方法 - Google Patents

一种快速检测鲤疱疹病毒iii型的方法 Download PDF

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周立新
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陈德芳
尹立子
曹成易
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Abstract

本发明涉一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法所述方法通过设计鲤疱疹病毒III型Sphi基因编码区域的特异性扩增引物，采用非致死性方法采样后提取样品DNA进行LAMP反应，通过对扩增产物的检测，从而确定样品中是否存在鲤疱疹病毒III型。本发明在引物设计方面选取了特异性和稳定性很高的Sphi区域作为目的条带设计引物；使用非致死性的拭子采样，操作快速简单；采用了快速DNA提取方法，具有快速、简便的特点；引入一对环状引物，进一步缩短了反应时间；具有极高的检测准确性和效率，不会对采样活体带来伤害，具有极佳的应用前景。

Description

一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法
技术领域
本发明涉及鱼类病毒的快速检测方法，具体涉及一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，尤其是采用非致死性方法采集样品后提取DNA进行LAMP反应检测的方法。
背景技术
锦鲤疱疹病毒病(KoiHerpesvirusDisease，KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(KoiHerpesvirus，KHV)感染引起鲤鱼、锦鲤以及普通变种鳃坏死、间质性肾炎的一种高致病性，高传染性，高死亡率的疾病。该病发病率高、流行范围广，致死率高达80％-100％。自1998年以来，KHVD在世界范围内许多鲤鱼和锦鲤养殖场发生，死亡率极高，该病的爆发给鲤鱼和锦鲤养殖业造成了严重的经济损失。KHVD是OIE(Worldorganizationforanimalhealth)和中国农业部必须要求上报的Ⅱ类动物疫病
目前KHV的检测诊断方法有细胞分离法、电镜观察法、中和实验、ELISA、PCR、组织病理学观察。聚合酶链式反应(PCR)和细胞培养技术是OIE推荐的诊断方法。《一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒及检测方法》中采用的是致死性采样方法，采样步骤繁琐，不适用于活体检测价值昂贵的观赏性锦鲤，并且LAMP扩增反应液的添加复杂，易发生污染，在野外临床检测中存在各种限制，比如仪器、技术等方面。
因此需要设计一种新的快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，以解决现有技术的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，设计一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，在引物设计方面选取了特异性和稳定性很高的Sphi区域作为目的条带设计引物；使用非致死性的拭子采样，操作快速简单；采用了快速DNA提取方法，只需煮沸组织样，静置冷却取上清即可完成，具有快速、简便的特点；引入一对环状引物，进一步缩短了反应时间；反应体系由LAMPmix和模板DNA两部分组成，操作简单，减少了假阳性；具有极高的检测准确性和效率，不会对采样活体带来伤害，具有极佳的应用前景。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，所述方法通过设计鲤疱疹病毒III型Sphi基因编码区域的特异性扩增引物，采用非致死性方法对鲤鱼采样后提取样品DNA进行LAMP反应，通过对扩增产物的检测，从而确定样品中是否存在鲤疱疹病毒III型。
优选的，特异性扩增引物包括以下引物：
(1)上游内部引物(ForwardInnerPrimer，FIP)：
5’-GCTGTGGTAGGTGTTGCTGAGATTTTCACCACATCTGCAAGGAGT-3’
(2)上游外部引物(ForwardOuterPrimer，F3):
5’-GCTGTTTGCCTGCAGGAA-3’
(3)下游内部引物(BackwardInnerPrimer，BIP):
5’-GAGCATCGTGGGGTTCCAGACTTTTAGGCTCTTGTAGCGGTCC-3’
(4)下游外部引物(BackwardOuterPrimer，B3):
5’-TGAACGACTGCGACTGTTG-3’
(5)上游环引物(ForwardLOOPPrimer，LF)：
5’-CAGCTTGTTCGAGC-3’
(6)下游环引物(BackwardLOOPPrimer，LB)：
5’-ATGGACCTCGCATACGC-3’。
优选的，提取样品DNA中采用的DNA提取液包含以下成分：
10mmol·L-1Tris-HCl，1mmol·L-1EDTA，15mmol·L-1氯化钠，0.5％SDS，pH8.0。
优选的，LAMP扩增体系中，每25ul的LAMP扩增体系包含以下成分：
23ulLAMPmix，2ul模板DNA；
其中23ulLAMPmix包含：1μL上游外部引物F3(10μM)，1μL下游外部引物B3(10μM)，1μL上游内部引物FIP(50μM)，1μL下游内部引物BIP(50μM)，1uL下游环引物LB(25uM)，1uL上游环引物LF(25uM)，3.5μLdNTPs(25mM)，3μL10×Thermopolbuffer，8UBstDNA聚合酶，3μLBetaine(8μM)，3μLMgCl2(25mM)和2.5μLddH2O；
其中1×Thermopolbuffer反应缓冲液包含：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mMKCl、2mMMgSO4、0.1％TritonX-100(pH8.8，25℃)。
进一步优选的，该方法的步骤为：
(1)非致死性样品采集：
使用采样拭子或医用棉签采取鲤鱼两侧鳃部的黏液，将采完病料的拭子或棉签置于保存管中保存备用；
(2)样品DNA的提取：
取50ul裂解液于1.5mlEP管中，将采样后的拭子或棉签置于其中搅动1min，煮沸10分钟后室温静置5分钟，取上清液于-20℃保存备用；
或者用ViralDNAKit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于30μL灭菌水，于-20℃保存备用；
(3)环介导等温扩增LAMP：
采用25ul反应体系：23ulLAMPmix和2μL模板DNA；
反应程序为：64℃孵育60min，80℃用灭活酶处理5min终止反应；
(4)检测结果判定：检测步骤(3)制备的反应产物，如果存在环介导等温扩增产物则说明待检测鱼中有鲤疱疹病毒III型。
优选的，检测结果判定的方式为：发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管中出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
可选的，检测结果判定的方式为：每25ul体系的反应管中加入1000xSYBRGreenⅠ1～4ul，反应1～5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
可选的，检测结果判定的方式为：扩增产物用1％(w/v)的琼脂凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
优选的，设计特异性扩增引物是根据GenBank公布的KHV美国毒株(KHV-U，ID:DQ657948.1)、以色列毒株(KHV-I，ID:DQ177346.1)和欧洲毒株(KHV-GZ11，ID:KJ627438.1)的Sphi基因编码区(ORF54)共有序列进行引物设计；应用PrimerExplorerV4在线软件设计特异性扩增引物。
本发明的优点和有益效果在于：
快速检测鲤疱疹病毒III型的方法与现有技术相比，具有以下优点：
1、在引物设计方面选取了特异性和稳定性很高的Sphi区域作为目的条带设计引物，提高了检测的准确性和效率；
2、在采样上使用了拭子和棉签采样(非致死性采样)，操作快速简单，也适用于昂贵的观赏性锦鲤的活体检测；
3、在模板DNA提取方面，采用了快速DNA提取方法，只需煮沸组织样，静置冷却取上清即可完成，具有快速、简便的特点；
4、一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间；
5、反应体系由LAMPmix和模板DNA两部分组成，操作简单，减少了假阳性。
附图说明
图1是一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法特异性检测结果的示意图。
图2是一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法三个月后的LAMPmix体系稳定性检测结果的示意图。
图3是一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法灵敏度检测结果的示意图。
图4是一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法不同加热方式对LAMP扩增效果试验的示意图。
图5为实施例8中采样的具有临床症状的鲤鱼和锦鲤的照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1：采用非致死性法采样：
将样本的鱼置于解剖盘上，使用镊子将鳃盖打开，同时使用拭子或棉签采取左右两侧鳃部的粘液，当拭子或棉签不能再继续采集粘液即可。将采完病料的拭子或棉签置于保存管中保存。
实施例2：组织DNA的提取：
取50ul裂解液在1.5mlEP管中，将采样后的拭子或棉签置于其中混匀，煮沸10分钟，室温静置5分钟，取上清液-20℃保存备用。
也可以用ViralDNAKit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于30μl灭菌水，-20℃保存备用。
实施例3:鲤疱疹病毒Ⅲ型DNA模板制备：
方式一：对锦鲤鳍细胞(KFC)进行细胞培养，待锦鲤鳍细胞(KFC)长满瓶底后，在超净工作台内将瓶内的培养液吸出，并用PBS缓冲液洗涤细胞三次，用移液枪吸取1.5ml锦鲤疱疹病毒的组织液注入细胞瓶，轻轻翻转细胞瓶使病毒充分接触KFC，然后在培养箱中培养1h后弃病毒液，期间每隔10分钟轻轻混匀一次，然后加入100IU/ml双抗与2％的小牛血清于5％CO2，25℃培养。待细胞变大变圆、脱落或融合成片，细胞病变达70％以上，-4℃8000r/min离心10min，收集含有病毒的上清液，反复冻融3次后，5000r/min离心30min，取上清250μl，用ViralDNAKit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用，得到鲤疱疹病毒Ⅲ型DNA模板。
方式二：非致死性鳃拭子采样，组织病毒DNA的提取方法：取50ul裂解液于1.5mlEP管中，将采样后的拭子或棉签置于其中搅动1min，煮沸10分钟后室温静置5分钟，取上清液于-20℃保存备用，或者取20-30mg组织使用组织DNA提取试剂盒提取，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。
实施例4：本发明快速检测鲤疱疹病毒III型的方法与普通PCR方法灵敏度对比检测：
一、不同浓度梯度病毒DNA模板的制备:取实施例3方式二中提取的鲤疱疹病毒Ⅲ型DNA模板，使用紫外分光光度计测得锦鲤疱疹病毒模板DNA(A260＝0.045，A280＝0.028)，按照公式：CDNA＝A260×50×(稀释倍数)ug/ml，计算出模板DNA的拷贝数约为45ug/ml，用双蒸水将将锦鲤疱疹病毒DNA以10倍倍比稀释至4.5×106pg/mL、4.5×105pg/mL、4.5×104pg/mL、4.5×103pg/mL、4.5×102pg/mL、45pg/mL、4.5pg/mL，进行LAMP和普通PCR(以F3、B3为引物)扩增。
二、LAMP扩增的反应体系，包括，23ulLAMPmix和2ul模板DNA；
其中23ulLAMPmix包含：1μL上游外部引物F3(10μM)，1μL下游外部引物B3(10μM)，1μL上游内部引物FIP(50μM)，1μL下游内部引物BIP(50μM)，1uL下游环引物LB(25uM)，1uL上游环引物LF(25uM)，3.5μLdNTPs(25mM)，3μL10×Thermopolbuffer，8UBstDNA聚合酶，3μLBetaine(8μM)，3μLMgCl2(25mM)和2.5μLddH2O；
其中1×Thermopolbuffer反应缓冲液包含：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mMKCl、2mMMgSO4、0.1％TritonX-100(pH8.8，25℃)。
三、LAMP扩增的反应条件：反应管与64℃60min后，80℃灭活5min。
四、普通PCR反应体系为2×TapPCRmastermix12.5ul；B3(10mM)和F3(10mM)各1ul；DNA模板2ul；ddH2O8.5ul。反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性0.5min，52℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。
普通PCR引物为F:5'-GCTGTTTGCCTGCAGGAA-3'R:5'-TGAACGACTGCGACTGTTG-3'
五、检测结果判定：
(1)在LAMP反应管中加入5ul1000SYBRGreenⅠ，观察结果如图3。
(2)取5μlPCR扩增产物和5ul加入1000xSYBRGreenⅠ的LAMP扩增产物，分别用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP方法的检测限至少为4.5pg/mL，普通PCR的检测限为45pg/mL，结果显示如图3。图3中：从上到下表示：A.LAMP产物用1％的琼脂糖凝胶分析；B.LAMP产物用SYBRGreenⅠ染色分析C.普通PCR产物用2％的琼脂糖凝胶分析；从左到右表示：M：DL200DNA标准分子量；泳道1～7：4.5×106pg/mL、4.5×105pg/mL、4.5×104pg/mL、4.5×103pg/mL、4.5×102pg/mL、45pg/mL、4.5pg/mL；泳道8：阴性照组；由此可得出本发明快速检测鲤疱疹病毒III型的方法的灵敏度和准确性更高。
实施例5：一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法中所用LAMPmix稳定性检测:
一、LAMPmix的制备，每23ul体系包括：1μLF3(10μM)，1μLB3(10μM)，1μFIP(50μM)，1μLBIP(50μM)，1ulLB(25uM)，1ulLF(25uM)，3.5μLdNTPs(25mM)，3μL10×Thermopolbuffer，8UBstDNA聚合酶，3μLBetaine(8μM)，3μLMgCl2(25mM)和2.5μLddH2O。
二、将制备的LAMPmix每23ul一管分装到PCR管中，置于-20℃冰箱中储存，每隔一个月检取4管，测一次LAMPmix的稳定性，持续三个月。
三、以实施例3方式二获取的病毒DNA为模板。
四、LAMP扩增的反应体系(25ul)：23ulLAMPmix，模板DNA2ul。阴性对照组处理方式同阳性组；反应条件：反应管于64℃60min后，80℃灭活5min。
五、取5μlPCR扩增产物和5ul加入1000xSYBRGreenⅠ的LAMP扩增产物，分别用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，结果如图2。图2为第三个月的检测结果，从左到右各泳道分别表示：1、2、4为阳性组，3为阴性对照组。由图2所示的结果可知，本发明所用LAMPmix具有较佳的稳定性。
实施例6：一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法的特异性检测：
一、取待测样品提取病毒DNA:将进行细胞培养的鳗疱疹病毒(eelherpesvirus，AngHV)感染的EPC细胞、KHV感染的Koi-Fin细胞、鲤科疱疹病毒Ⅰ型(CyprinidherpesvirusⅠ，CyHV-1)感染的EPC细胞出现细胞变大变圆、脱落或融合成片，细胞病变达70％以上，取发生细胞病变超过75％的EPC和CyHV-2检测阳性的病鱼组织的PBS匀浆液，反复冻融三次，-4℃8000r/min离心10min，收集含有病毒的上清液，于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用ViralDNAKit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50μl灭菌水，-20℃保存备用。
二、LAMP扩增的反应体系(25ul)：23ulLAMPmix，模板DNA2ul。
三、反应条件：反应管与64℃60min后，80℃灭活5min。
四、检测结果判定：取5μl扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示只检测出KHV，而AngHV、CyHV-1、CyHV-2和空白对照均无法检出(图1)。图1中左到右各泳道分别表示：M：DL1500DNAmarker；1:CyHV-3；2:CyHV-2；3:CyHV-1；4:AngHV；5:uninfectedkoitissue。
实施例7：一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法中不同加热方式对LAMP反应影响的对比。
一、使用实施例3方式二方法提取的病毒DNA做为模板。分为3份样品进行操作。
二、LAMP扩增的反应体系(25ul)：23ulLAMPmix，模板DNA2ul。
三、反应条件：反应管与64℃60min后，80℃灭活5min。3份样品的加热方式的反应恒温装置分别为PCR仪、恒温孵育器、恒温水浴锅。
四、检测结果判定：取5μl扩增产物与1ulloadingbuffer混匀，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，结果如图4。图4中从左到右各泳道分别表示：M：DL1500DNA标准分子量；1：PCR仪；2：恒温孵育器；3：恒温水浴锅。由图4可得，采用恒温孵育器的加热方式效果最佳。
实施例8：一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法在临床上的应用
(1)非致死性样品采集：
对四川东部的隆昌、南部的新津、西部的鲁家滩、北部的绵阳和中部的成都等五个方位15个检测点的鲤鱼或锦鲤进行KHVD的分子流行病学调查，采样地点，样品品种见表1。
其中，隆昌A检测点、B检测点的鲤鱼和新津A检测点、B检测点采集的鱼具有可见临床症状，如图5所示。
(2)样品DNA的提取：
取50ul裂解液于1.5mlEP管中，将采样后的拭子或棉签置于其中搅动1min，煮沸10分钟后室温静置5分钟，取上清液于-20℃保存备用；
(3)环介导等温扩增LAMP：
采用25ul反应体系：23ulLAMPmix和2μL模板DNA；
其中23ulLAMPmix包含：1μL上游外部引物F3(10μM)，1μL下游外部引物B3(10μM)，1μL上游内部引物FIP(50μM)，1μL下游内部引物BIP(50μM)，1uL下游环引物LB(25uM)，1uL上游环引物LF(25uM)，3.5μLdNTPs(25mM)，3μL10×Thermopolbuffer，8UBstDNA聚合酶，3μLBetaine(8μM)，3μLMgCl2(25mM)和2.5μLddH2O；
其中1×Thermopolbuffer反应缓冲液包含：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mMKCl、2mMMgSO4、0.1％TritonX-100(pH8.8，25℃)；
反应程序为：64℃孵育60min，80℃用灭活酶处理5min终止反应。
(4)PCR扩增验证：采用同样的步骤(2)中的样品DNA进行PCR扩增验证；常规PCR体系25ul：2×TaqPCRmasterMix12.5ul；DNA模板2ul；上下游引物F1和R1各1ul；ddH2O8.5ul。反应条件：94℃预变性5min，95℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸10min。取5ulPCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳(goldview)进行电泳分析观察。得到PCR扩增验证结果见表1。
上引物F1：5’-GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-3’
下引物R1：5’-CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-3’。
(5)LAMP检测结果判定：取5μl扩增产物与1ulloadingbuffer混匀，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，结果如表1所示。由表1可得出，本实施案例LAMP的检测方法具有准确高效的检测效果。
表1组织样品PCR检测和LAMP检测结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，其特征在于，所述方法通过设计鲤疱疹病毒III型Sphi基因编码区域的特异性扩增引物，采用非致死性方法采样后提取样品DNA进行LAMP反应，通过对扩增产物的检测，从而确定样品中是否存在鲤疱疹病毒III型。
2.如权利要求1所述的快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，其特征在于，特异性扩增引物包括以下引物：
(1)上游内部引物(ForwardInnerPrimer，FIP)：
5’-GCTGTGGTAGGTGTTGCTGAGATTTTCACCACATCTGCAAGGAGT-3’
(2)上游外部引物(ForwardOuterPrimer，F3):
5’-GCTGTTTGCCTGCAGGAA-3’
(3)下游内部引物(BackwardInnerPrimer，BIP):
5’-GAGCATCGTGGGGTTCCAGACTTTTAGGCTCTTGTAGCGGTCC-3’
(4)下游外部引物(BackwardOuterPrimer，B3):
5’-TGAACGACTGCGACTGTTG-3’
(5)上游环引物(ForwardLOOPPrimer，LF)：
5’-CAGCTTGTTCGAGC-3’
(6)下游环引物(BackwardLOOPPrimer，LB)：
5’-ATGGACCTCGCATACGC-3’。
3.如权利要求1所述的快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，其特征在于，提取样品DNA中采用的DNA提取液包含以下成分：
10mmol·L-1Tris-HCl，1mmol·L-1EDTA，15mmol·L-1氯化钠，0.5％SDS，pH8.0。
4.如权利要求1所述的快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，其特征在于，LAMP扩增体系中，每25ul的LAMP扩增体系包含以下成分：
23ulLAMPmix，2ul模板DNA；
其中23ulLAMPmix包含：1μL上游外部引物F3(10μM)，1μL下游外部引物B3(10μM)，1μL上游内部引物FIP(50μM)，1μL下游内部引物BIP(50μM)，1uL下游环引物LB(25uM)，1uL上游环引物LF(25uM)，3.5μLdNTPs(25mM)，3μL10×Thermopolbuffer，8UBstDNA聚合酶，3μLBetaine(8μM)，3μLMgCl2(25mM)和2.5μLddH2O；
其中1×Thermopolbuffer反应缓冲液包含：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mMKCl、2mMMgSO4、0.1％TritonX-100(pH8.8，25℃)。
5.如权利要求1-4任一所述的快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，其特征在于，该方法的步骤为：
(1)非致死性样品采集：
使用采样拭子或医用棉签采取鱼两侧鳃部的黏液，将采完病料的拭子或棉签置于保存管中保存备用；
(2)样品DNA的提取：
取50ul裂解液于1.5mlEP管中，将采样后的拭子或棉签置于其中搅动1min，煮沸10分钟后室温静置5分钟，取上清液于-20℃保存备用；
或者用ViralDNAKit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于30μL灭菌水，于-20℃保存备用；
(3)环介导等温扩增LAMP：
采用25ul反应体系：23ulLAMPmix和2μL模板DNA；
反应程序为：64℃孵育60min，80℃用灭活酶处理5min终止反应；
(4)检测结果判定：检测步骤(3)制备的反应产物，如果存在环介导等温扩增产物则说明待检测鱼中有鲤疱疹病毒III型。
6.如权利要求5所述的快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，其特征在于，检测结果判定的方式为：发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管中出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
7.如权利要求5所述的快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，其特征在于，检测结果判定的方式为：每25ul体系的反应管中加入1000xSYBRGreenⅠ1～4ul，反应1～5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
8.如权利要求5所述的快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，其特征在于，检测结果判定的方式为：扩增产物用1％(w/v)的琼脂凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
9.如权利要求1-4任一所述的快速检测鲤疱疹病毒III型的方法，其特征在于，设计特异性扩增引物是根据GenBank公布的KHV美国毒株(KHV-U，ID:DQ657948.1)、以色列毒株(KHV-I，ID:DQ177346.1)和欧洲毒株(KHV-GZ11，ID:KJ627438.1)的Sphi基因编码区(ORF54)共有序列进行引物设计；应用PrimerExplorerV4在线软件设计特异性扩增引物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755014A (zh) * 2016-03-23 2016-07-13 中国科学院水生生物研究所 CaHV-TNFR特异基因及应用
CN106801049A (zh) * 2017-02-14 2017-06-06 中国水产科学研究院珠江水产研究所 潜伏感染的鲤疱疹病毒3型dna的提取方法、套式pcr检测方法及其试剂盒
CN110592270A (zh) * 2018-06-13 2019-12-20 杭州众测生物科技有限公司 锦鲤疱疹病毒（khv）的raa恒温荧光检测方法及试剂

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060475A (zh) * 2013-01-18 2013-04-24 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种锦鲤疱疹病毒lamp检测试剂盒及检测方法
CN104152580A (zh) * 2014-08-05 2014-11-19 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局 用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用
CN104673934A (zh) * 2015-02-10 2015-06-03 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060475A (zh) * 2013-01-18 2013-04-24 中国水产科学研究院长江水产研究所 一种锦鲤疱疹病毒lamp检测试剂盒及检测方法
CN104152580A (zh) * 2014-08-05 2014-11-19 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局 用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用
CN104673934A (zh) * 2015-02-10 2015-06-03 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KURITA,J.等: "Cyprinid herpesvirus 3 (KHV, CyHV3) DNA, enlarged SphI5 PCR region, genotype/variant: A1, A2", 《GENBANK DATABASE》 *
MANABU YOSHINO等: "Rapid, sensitive and simple detection method for koi herpesvirus using loop-mediated isothermal amplification", 《MICROBIOL IMMUNOL》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755014A (zh) * 2016-03-23 2016-07-13 中国科学院水生生物研究所 CaHV-TNFR特异基因及应用
CN106801049A (zh) * 2017-02-14 2017-06-06 中国水产科学研究院珠江水产研究所 潜伏感染的鲤疱疹病毒3型dna的提取方法、套式pcr检测方法及其试剂盒
CN110592270A (zh) * 2018-06-13 2019-12-20 杭州众测生物科技有限公司 锦鲤疱疹病毒（khv）的raa恒温荧光检测方法及试剂

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