CN101514373B - 实时荧光定量pcr快速检测鸭病毒性肠炎的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了实时荧光定量PCR检测鸭病毒性肠炎病毒的方法，选择鸭病毒性肠炎UL31基因片段，设计引物和探针，对扩增片段的测序结果，同源性均为100％，不发生交叉反应，从而排除了病毒变异和地域因素造成的假阴性问题，提高了检出阳性率和方法的兼容性；构建了定量阳性质控标准品(重组质粒pMD18-T-DEV76bp)，建立了荧光定量检测的标准曲线，最小可检出2.1×10⁰拷贝/μL。组装的标准化试剂盒，在标准化反应条件下反应，准确的质控标准和判定标准进行判定。特异性强、敏感性高、定量阳性质控品安全，而且操作筒单、成本低，适于现场鸭病毒性肠炎的大规模检疫、口岸检疫、流行病学调查及实验室快速诊断。

Description

实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的方法及试剂盒 

技术领域

本发明属分子生物学范畴，确切地说是利用荧光PCR技术快速检测鸭病毒性肠炎的方法及试剂盒。 

背景技术

近十多年来，我国养鸭业获得迅速发展，据2002年根据联合国粮农组织(FAO)统计，我国鸭存栏约6.61亿只，占世界总量的69.7％，可见我国是第一鸭生产大国。而且以每年10％～15％的速度递增，新建的大规模养殖场逐渐增多，鸭产品的年产值已经接近300亿元人民币，而且远销欧盟、东南亚、日本、韩国等地，随着国民经济的进一步发展，鸭产品空间还会不断扩大，所以养鸭业存在巨大的潜力。但由于各地多渠道引进种鸭或蛋，国内禽产品市场交流频繁，集约化饲养缺乏管理经验，防疫工作措施不当，环境污染严重，导致鸭的各种疾病不断发生，而且越来越复杂，但危害较为严重的仍为病毒性传染病，每年引起鸭死亡占到15％～20％，严重制约着我国养鸭业的持续稳定发展。 

鸭病毒性肠炎(duck viral enteritis，DVE或DPV)，俗称“鸭瘟”、“大头瘟”或“烂肠瘟”。是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病。是养鸭场的一种最常见的疾病之一，其流行广泛、传播迅速、发病率与死亡率极高。每年由于该病的发生引起的死亡、淘汰、产蛋下降，给发病地区的商品肉鸭和产蛋鸭造成很大的损失。 

目前针对鸭病毒性肠炎的诊断方法主要有：病毒分离鉴定、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术等。 

近年来，随着现代分子生物学的发展，分子生物学技术已被应用于鸭瘟的快速诊断。国外Plummer等(1998)、Pritchard等(1999)先后应用PCR诊断DPV获得成功。国内谢芝勋等(2000)首次成功应用PCR诊断鸭瘟。郭霄峰等(2002)、陈建君等(2003)、韩先杰等(2003)、马秀丽等(2005)、宋涌等(2005)均在鸭瘟病毒DNA不同位点设计相应引物，扩增特异性片段，能以较强的特异性和较好的敏感性快速地检出鸭瘟病毒。杨发龙(2006)建立了检测鸭瘟病毒的实时荧光定量PCR方法，用来进行快速诊断、致病机理研究及抗病毒药物筛选等。汤承(2006)建立了SYBR Green I实时定量PCR快速检测鸭瘟病毒法，检测鸭瘟标准强毒、疫苗毒及野毒株均为阳性，另外，也根据DPV UL6，UL7基因的保守序列设计引物和Taqman探针，建立了real-time PCR检测鸭瘟病毒方法，来研究DPV在鸭胚中的增殖规律确定合适的收毒部位和收毒时间，并与空斑法定量检测结果进行了相关行比较，探讨了用real-timePCR代替传统的鸡胚法用于疫苗生产中病毒定量检测的可行性。 

发明内容

本发明的目的是根据保守序列DEVUL31基因设计了引物和Taqman探针，提供一种特异性强，敏感性高，具备快速检测鸭病毒性肠炎，并能有效应用于口岸和现场检疫的实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的方法及成本低、可以商品化的检测试剂盒。 

本发明实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的方法引物序列： 

FP  (37421-37440)5′-ACGCTGTCCACGTCAGTTTG-3′ 

RP  (37475-37496)5′-TGGCTCATGTTTGGCATTCTAC-3′； 

本发明实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的方法探针序列： 

probe(37448-37470)5′-FCGGTCGCGCCTCACGACAAGTAP-3； 

所述的探针序列的5′端以FAM(用F表示)标记，3′端以TAQMAN(P表示)标记。 

本发明实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的方法包括以下步骤： 

A、常规方法提取待检样品DNA； 

B、将上述的引物和探针与PCR混合液加入PCR反应管中混合后加入待检样品DNA； 

C、放入荧光PCR检测仪中进行反应； 

D、有扩增曲线为阳性，无扩增曲线为阴性； 

步骤B所述的引物FP、RP终浓度均为100nmol/L，探针终浓度为200nmol/L步骤B所述的PCR混合液包括：缓冲液、dNTP和rTaq酶；其终浓度分别为1mmol/L(1×)、0.5mmol/L和rTaq酶为0.05U/μL，待检样品DNA溶液占总反应液的10％； 

终浓度是指该物质在PCR总反应液中的含量； 

步骤C按第一阶段94℃、5min，1个循环；第二阶段94℃、30s，58℃、30s，72℃，30s，各40个循环； 

在第二阶段延伸时即72℃、30s，收集荧光信号观察扩增曲线，记录Ct值，按线性公式：Ct值Y＝-2.229X+30.877，计算X值，样品的鸭病毒性肠炎病毒拷贝数为2.1×10^X个/uL； 

本发明实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的方法的定量阳性质控标准品为重组质粒pMD18-T-DEV76bp，DEV76bp的核苷酸序如序列表SEQ ID NO.4； 

定量阳性质控标准品为重组质粒pMD18-T-DEV76bp浓度选自2.1×10¹～2.1×10⁹拷贝/μL，9个浓度水平。 

实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的试剂盒它包括： 

溶液1：2μmol/L引物SEQ ID NO.1和2μmol/L引物SEQ ID NO.2的1∶1混合液； 

溶液2：2μmol/L探针，核苷酸序如序列表SEQ ID NO.3，5′端以FAM(用F表示)标记，3′端以TAQMAN(P表示)标记； 

溶液3：PCR混合液； 

所述的试剂盒还包括选自浓度为2.1×10¹～2.1×10⁹拷贝/μL定量阳性质控标准品重组质粒pMD18-T-DEV76bp做为阳性对照；正常鸭组织基因提取物做阴性对照。 

所述的溶液3、PCR混合液是由缓冲液为10mmol/L(10×)、dNTP为2.5mmol/L和rTaq酶为5U/μL，按2∶4∶0.2比例配制的。 

实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的试剂盒的使用方法： 

A、将所述的溶液1：2μL、溶液2：2μL和溶液3：14μL加入PCR反管内混合后，分别加入待检样品DNA溶液、阳性对照及阳性对照，加入量为2μL； 

B、将加好样品的荧光PCR反应管按顺序放入荧光PCR检测仪中，按第一阶段94℃、5min，1个循环；第二阶段94℃、30s，58℃、30s，72℃，30s，各40个循环；设定反应条件； 

C、在第二阶段延伸时即72℃、30s，收集荧光信号观察扩增曲线，记录Ct值，按线性公式：Ct值Y＝-2.229X+30.877，计算X值，样品的鸭病毒性肠炎病毒拷贝数即为：2.1×10^X个/uL； 

质控标准：只有①、②均符合试验成立，否则试验不成立，应重新进行； 

①阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线； 

②阳性对照的Ct值应＜30，并且出现典型的扩增曲线； 

判定标准： 

①当被检测样品无扩增曲线，表明样品中无鸭瘟病；。 

②当被检测样品有扩增曲线，且Ct值≤30，表示样品中有鸭瘟病毒； 

③当30≤Ct≤35，样品需重新测定，重新测定无Ct值判为阴性，仍出现30≤Ct≤35，则判为阳性。 

本发明实时荧光定量PCR检测鸭病毒性肠炎病毒的方法，利用GenBank(登录号：EF417996)中鸭病毒性肠炎病毒UL31基因高度保守序列，设计引物和探针，对扩增片段的测序结果显示，扩增片段核苷酸序列与GenBank中登记号为EF417996的UL31 like基因片段序列的同源性为100％，对本实验室保存的已知鸭病毒性肠炎病毒和购买的疫苗毒株以及各地的临床样品进行检测，均观察到扩增曲线，对扩增片段的测序结果，同源性均为100％，说明该片段高度保守，从而排除了由于病毒变异和地域因素造成的假阴性问题，提高了检出阳性率和方法的兼容性。 

利用本发明实时荧光定量PCR检测鸭病毒性肠炎病毒的方法，对DPV-F37、疫苗株C-KCE为模板进行荧光PCR检测，扩增曲线均为阳性，拷贝数、Ct值(Y轴)和起始模板拷贝数的对数值(X轴)，符合本发明建立的荧光定量检测的标准曲线。 

对感染鸭抗凝血、粪、脑、心、肝、脾、肺、肾、肠等组织的检测结果一致，更适用于鸭病毒性肠炎的临床诊断。 

对鸭易感的病毒性肝炎病毒、鸭巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌、鹅源禽流感H5毒株、新城疫、小鹅瘟模板DNA进行荧光PCR检测，均未见扩增曲线，CT值为Undet。说明不与非鸭病毒性肠炎病原DNA发生交叉反应，充分证明了其检测鸭病毒性肠炎病毒的高度特异性，因而该方法检测的结果具有良好的可靠性。定性检测，通过实时监测荧光扩增曲线的生成，对于样品含毒量高的样品可在几个或十几个循环后就能得到阳性结果，大大缩短检测时间。定量检测从样本核酸提取到报告结果耗时不超4h，最小可检出2.1×10⁰拷贝/μL。 

对不同的临床DEV阳性组织样品和不同厂家生产的活疫苗毒株进行重复检测，并对检测结果进行统计学分析，变异系数(CV)均小于2.5％。 

本发明鸭病毒性肠炎病毒定量阳性质控标准品(重组质粒pMD18-T-DEV76bp)，各浓度呈现良好的线性关系相关系数(r＝0.95)，选择高、中、低浓度的质粒样本每一浓度，进行批间重复性试验，测得的Ct值进行统计学处理，三种浓度的变异系数均小于5％。并且克服了采用病毒做为模板存在感染性的缺点，生物学特性稳定，符合生物安全的要求。 

本发明实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的试剂盒及其使用方法，是经过本发明人，利用本发明实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的方法，对大量的标准毒株以及各地的临床样品进行检测，总结、优选出的试剂组装的标准化试剂盒，在标准化反应条件下反应，严格的质控标准和准确的判定标准进行定性及定量判定。特异性强、敏感性高、定量阳性质控品安全，具备快速检测鸭病毒性肠炎，而且操作筒单、成本低，适于现场鸭病毒性肠炎的大规模检疫、口岸检疫、流行病学调查及实验室快速诊断。 

附图说明

图1 PCR验证引物特异性和反应条件扩增后电泳鉴定图，其中：1，阴性对照；2：PCR扩增产物；M：marker。 

图2重组质粒pMD18-T-DEV76bp经Hind III/EcoR I双酶切电泳结果，其中：M：marker1～2：酶切产物。 

图3 PCR扩增目的序列电泳图，其中1：阴性对照；2：PCR扩增产物；M：marker。 

图4每个阶梯浓度定量阳性质控标准品荧光PCR产物电冰结果，其中1-10：2.1×10⁹～ 2.1×10⁰拷贝；11：2.1X10^-1拷贝；12：阴性对照；M：DNA Marker DL2000。 

图5每个阶梯浓度定量阳性质控标准品动力学扩增曲线。 

具体实施方式

实施例1  实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎阳性质控标准品-重组质粒pMD18-T-DEV76bp的制备 

根据保守序列DEVUL31基因设计了引物和Taqman探针 

引物FP   (37421-37440)5′-ACGCTGTCCACGTCAGTTTG-3′ 

引物RP   (37475-37496)5′-TGGCTCATGTTTGGCATTCTAC-3′ 

探针probe(37448-37470)5′-FCGGTCGCGCCTCACGACAAGTAP-3 

探针序列的5′端以FAM(用F表示)标记，3′端以TAQMAN(P表示)标记； 

鸭病毒性肠炎鸡胚化弱毒疫苗株，购自中国兽医药品监察所，用宝生物工程(大连)有限公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA； 

按下表： 

的反应体系； 

反应条件为：94℃ 2min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 35s，35个循环；72℃ 7min；4℃保存；同时取6.0μL扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到与预期大小(76bp)相符的一条目的带(见图1)； 

上述的PCR产物用大连宝生物工程有限公司的DNA凝胶回收试剂盒进行的回收DEV76bpDNA，将DNA贮存于-20℃； 

按下表： 

连接反应体系 

的连接反应体系，置于16℃连接4h，将回收的PCR产物DEV76bp连接到pMD18-T上； 

上述连接产物pMD18-T-DEV76bp转化至感受态细胞DH5α中)，置-20℃冰箱中保存备用。 

提取的质粒经Hind III/EcoR I双酶切鉴定为阳性质粒(见图2)，由大连宝生物工程有限公司完成测序，其核苷酸序列见SEQ ID NO.4，将所得序列与GenBank(登录号：EF417996)已发表的序列比较，二者的同源性为100％。 

实施例2用重组质粒pMD18-T-DEV76bp做模板，常规PCR验证引物特异性试验 

用重组质粒pMD18-T-DEV76bp做模板，用下列引物： 

FP    (37421-37440)5′-ACGCTGTCCACGTCAGTTTG-3′ 

RP    (37475-37496)5′-TGGCTCATGTTTGGCATTCTAC-3′ 

按反应体系： 

常规PCR验证引物特异性试验目的基因扩增体系 

按下表PCR反应程序 

进行常规PCR扩增；得到与预期大小(76bp)相符的一条目的带，条带具有特异性，引物没有二聚体，如图3； 

将PCR扩增的产物在1％低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳，切下目的条带；按微量凝胶回收试剂盒的使用说明回收目的DNA；将纯化的目的DNA 4.5μL、T载体0.5μL和连接液5.0μL混匀，16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，挑取白色菌落接种5mL LB液体培养基，37℃水浴中摇振培养12h；经碱裂解法提取质粒，Hind III/EcoR I双酶切鉴定为阳性质粒，由大连宝生物工程有限公司完成测序，与标准阳性质粒，NCBI库发表的相关序列进行比较，测序的PCR产物与NCBI公开发表的核酸序列具有100％的同源性； 

说明该片段具有高度的保守性，可以在其中设计荧光探针，将设计的探针序列同GeneBanK数据库序列文件进行BLAST比对，探针序列具有特异性。该重组质粒pMD8-T-DEV76bp可作为荧光定量PCR阳性质控标准品。 

实施例3定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp的制备 

将实施例2冻存的含有重组质粒pMD18-T-DEV76bp的大肠杆菌感受态细胞DH5α转种于含Amp⁺60μg/ml的LB液体培养基，250r/min震荡增菌培养过夜，将培养过夜的菌液转种于LB液体培养基，250r/min震荡增菌培养2～3小时，然后用TaKaRa公司质粒提取试剂盒提取质粒；取质粒样品10μL，用1990μL双蒸水稀释，取70μL转到1.0cm石英比色杯中，在紫外分光光度计上测定A260；根据A260的吸光度值可计算出样品中DNA的含量，即1个OD值相当于50ug/ml双链DNA；然后， 

按照公式： 

计算质粒浓度， 

按照公式： 计算质粒拷贝数： 

将提取的质粒用超纯水10倍比稀释，制成2.1×10^-1～2.1×10⁹定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp，-20℃保存备用。 

实例4荧光定量PCR检测鸭病毒性肠炎的标准曲线的确定 

按下表的反应系： 

荧光PCR反应体系 

加样顺序为：先加入水再依次加入10×buffer、dNTP、引物、荧光探针、rTaq，将所有成分充分预混，最后加入模板DNA——2.1×10^-1～2.1×10⁹定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp；按下表： 

的扩增程序，进行荧光定量PCR反应；在第2阶段的延伸时(72℃，30s)收集荧光信号； 

每个阶梯浓度定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp进行三次检测，各阶梯浓度电泳结果见图4；动力学扩增曲线见图5；各阶梯浓度Ct值见下表； 

各阶梯浓度Ct值 

浓度2.1×10^-1定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp，没有电泳条带和动力学扩增曲线，也没检测Ct值；最低检测浓度为2.1×10⁰个拷贝的定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp； 

以起始模板拷贝数的对数为X轴，将2.1×10¹、2.1×10²、2.1×10³、2.1×10⁴、2.1×10⁵、2.1×10⁶、2.1×10⁷、2.1×10⁸、2.1×10⁹9个浓度水平的阳性质控标准品拷贝数的的对数为X轴，Ct值为Y轴作回归曲线，经对数拟合作图形成标准曲线，定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp在标准曲线上的数据点与曲线结拟合良好；在较低的模板拷贝数时(2.1×10 ¹)仍然具有很好的线性关系，相关系数达到0.95，线性关系式为：Y＝-2.229 X+30.877。 

实施例5  特异性试验 

对购自中国兽医药品监察所的鸭病毒性肠炎鸡胚化弱毒疫苗株C-KCE、标准强毒DPV-F37(DEV)、购自中国兽医药品监察所的鸭病毒性肝炎DHV-I型以及由本中心实验室分离并保存的鸭巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌、鹅源禽流感H5毒株、新城疫、小鹅瘟，DNA提取试剂盒提取病毒DNA(模板DNA)，2.1×10⁵个拷贝的定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp做定量阳性对照，按下表的反应系： 

荧光PCR反应体系 

加样顺序为：先加入水再依次加入10×buffer、dNTP、引物、荧光探针、rTaq，将所有成分充分预混，最后加入模板DNA；按下表： 

的扩增程序，进行荧光定量PCR反应；在第2阶段的延伸时(72℃，30s)收集荧光信号； 

鸭病毒性肠炎标准强毒DPV-F37、鸭病毒性肠炎鸡胚化弱毒疫苗株C-KCE，2.1×10⁵个拷贝的定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp为模板进行的荧光PCR检测，有扩增曲线均为阳性，CT值(Y)分别为：20.12、21.43、22.10，代入线性关系式：Y＝-2.229X+30.877，浓度为分别为： 

鸭病毒性肠炎标准强毒DPV-F37： 

20.12＝-2.229X+30.877 

X＝(30.877-20.12)/2.229≈5 

浓度：2.1×10⁵个拷贝 

鸭病毒性肠炎鸡胚化弱毒疫苗株C-KCE： 

20.43＝-2.229X+30.877 

X＝(30.877-20.43)/2.229≈5 

浓度：2.1×10⁵个拷贝 

2.1×10⁵个拷贝的定量阳性质控标准品pMD18-T-DEV76bp： 

20.10＝-2.229X+30.877 

X＝(30.877-20.10)/2.229≈5 

浓度：2.1×10⁵个拷贝 

鸭易感的病毒性肝炎病毒、鸭巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭沙门氏菌、鹅源禽流感H5毒株、新城疫、小鹅瘟模板DNA进行荧光PCR检测，均未见扩增曲线，CT值为Undet.。 

实施例6  批内重复性试验 

用实施例5荧光定量PCR法对3份不同的临床DEV阳性组织样品和3个不同厂家生产的活疫苗毒株进行重复检测，并对检测结果进行统计学分析，变异系数(CV)均小于2.5％。 

表10  已知样品重复性检验 

注：平均数和变异系数CV(％)的计算采用Excel表格中相关公式进行计算 

实施例7  对已知病毒检测结果 

用实施例5荧光定量PCR法，对本实验室保存的2株已知鸭病毒性肠炎病毒和购买的3株疫苗毒株DNA提取试剂盒的提取病毒DNA，进行检测，结果5个样品均观察对扩增曲线。 

实施例8  对攻毒鸭病料检测结果 

将鸭病毒性肠炎强毒DPV-F371000倍稀释后，按每只0.2mL剂量给健康鸭肌肉注射，共注射4只；另设2只对照，肌肉注射灭菌生理盐水，每只0.2mL。疑似鸭病毒性肠炎病毒感染的病死鸭4只，分别采集抗凝血0.5mL，分别收集粪便、脑、心、肝、脾、肺、肾、肠0.5g，加入10倍量灭菌PBS，研磨，反复冻融3次，分别以3000r/min离心15min后取上清，DNA提取试剂盒提取病毒DNA，按实施例5荧光PCR方法分别对4只攻毒鸭各组织器官样品进行检测，每份进行3个重复，观察扩增曲线，结果见下表。 

鸭组织病料荧光PCR检测结果 

以上结果表明，本发明荧光PCR方法对患病鸭各组织器官均可采样进行检测，只要各组织样本中含有病毒核酸，即可被检测到。 

实施例9  实际样品调查结果 

利用实施例5荧光PCR方法对两家大型养鸭场和本实验室近3年来保存的样品进行试验，并用阳性样品做对照，观察各样品的扩增曲线与CT值，进行结果判定，结果显示(见下表)，两家大型鸭场无鸭病毒性肠炎感染，近3年来吉林进境的种鸭均为鸭病毒性肠炎荧光PCR阴性(曾用病毒中和试验判定也为阴性)。 

表13  实际样品的检测结果 

实施例10与其它方法进行比较 

分别对攻毒的4只鸭与全省各地送检的疑似鸭病毒性肠炎的病料6份，分别采用实例5荧光PCR方法、PCR方法、病毒分离方法进行病原学检查，并对各方法的检测结果进行比对。 结果见下表； 

实际样品检测结果 

结果表明，荧光PCR方法与PCR方法的敏感性均优于病毒分离方法(14号、15号样品)，而且组织需要并不苛刻(1～9号样品)。比如12号样品(血液)，采用病毒分离，主要是其本身毒性将影响到细胞的生长，因而无法判定其是否可以感染特异性细胞。 

SEQUENCE LISTING 

<110>吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 

<120>检测鸭病毒性肠炎的PCR方法及试剂盒 

<160>4 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工 

<400>1 

ACGCTGTCCA CGTCAGTTTG              20 

<210>2 

<211>22 

<212>DNA 

<213>人工 

<400>2 

TGGCTCATGT TTGGCATTCT AC           22 

<210>3 

<211>24 

<212>DNA 

<213>人工 

<400>3 

FCGGTCGCGC CTCACGACAA GTAP    24 

<210>4 

<211>76 

<212>DNA 

<213>鸭病毒性肠炎病毒 

<400>4 

ACGCTGTCCA CGTCAGTTTG CCGTTCGCGG TCGCGCCTCA CGACAAGTAC GAATGTAGAA    60 

TGCCAAACAT GAGCCA                                                    76 

Claims (4)

1.实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的试剂盒，它包括：引物如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针如序列表SEQ ID NO.3所示；所述的探针序列的5′端以FAM标记，用F表示，3′端以TAQMAN标记，用P表示。

2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的试剂盒，其特征在于，它包括：

溶液1：浓度2μmol/L引物SEQ ID NO.1和浓度2μmol/L引物SEQ ID NO.2的1∶1混合液；

溶液2：浓度2μmol/L探针SEQ ID NO.3；

溶液3：PCR混合液。

3.根据权利要求2所述的实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的试剂盒，其特征在于：所述的PCR混合液是由缓冲液为10mmol/L(10×)、dNTP为2.5mmol/L和rTaq酶为5U/μL，按2∶4∶0.2比例配制的。

4.根据权利要求1、2或3所述的实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎的试剂盒，其特征在于：它还包括选自浓度为2.1×10¹～2.1×10⁹拷贝/μL定量阳性质控标准品重组质粒pMD18-T-DEV76bp做为阳性对照；正常鸭组织基因提取物做阴性对照。

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