CN111676296A - 用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条rpa引物及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物，所述的引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；还公开了该引物和探针的组合，所述的探针由SEQ ID No：3所示的序列组成。此外，还公开包括该引物和探针组合的检测试剂盒。本发明试纸条RPA引物和探针组合对马铃薯腐烂茎线虫的检测特异性强、灵敏度高、对设备和人员素质要求低、操作简单、检测速度快、成本低，适合口岸检疫和基层现场检测。

Description

用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物及其检测试 剂盒

技术领域

本发明属于线虫检测技术领域，具体涉及一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物；还涉及含有该引物的检测试剂盒，以及它们在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

背景技术

马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor；别名：腐烂茎线虫、甘薯茎线虫或马铃薯茎线虫等)是一种迁移性植物内寄生线虫，该线虫主要为害植物地下部，尤其是块根、块茎或球茎等。该线虫不仅对马铃薯为害严重，而且对甘薯为害也十分严重。我国部分地区因该线虫为害造成的甘薯减产一般为10％～30％，重则达50％～60％，甚至绝产无收。此外，该线虫危害范围广，其寄主还包括胡萝卜、人参、小麦、玉米和花生等90多种植物。马铃薯腐烂茎线虫也因此成为重要的检疫性线虫，而对该线虫进行准确、快速的鉴定是对其进行有效防治和口岸检疫的基础。

鉴定马铃薯腐烂茎线虫的传统方法是形态学方法，由于线虫的有效鉴别特征不多，且许多表型特征不稳定，使得此方法鉴定过程繁琐，且鉴定结果常常会带有主观性，所得结果可靠性差。随着分子生物学的发展，在分子水平上鉴定线虫因其准确性强而获得广泛的应用。其中PCR扩增技术因具有灵敏度高、特异性强、准确高效等优点而获得广泛应用，但是该技术对于仪器设备、实验环境以及操作人员的要求较高，另外还存在成本高，耗时长，难以实现现场检测等弊端，使其应用受到很大限制。

恒温扩增技术的开发利用弥补了PCR技术存在的弊端，该技术在恒温下即可完成扩增，相比于PCR技术，其具有对设备仪器要求低，操作简便、检测速度快等优点。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification LAMP)是恒温扩增技术之一，已在马铃薯腐烂茎线虫检测上应用(CN102260746A和CN107988383A以及Ding Shanwen等(EurJ Plant Pathol，2019，153(4)：1165-1175)等，可在65℃恒温50min完成检测。但是，LAMP技术的反应体系需要6条引物，存在引物设计复杂，引物合成比较麻烦，且易出现假阳性，成本相对较高等缺点，使其应用受到限制。因此，为满足口岸检疫和现场快速检测的需要，亟待开发一种准确、快速、操作简单且对仪器设备和人员要求低的马铃薯腐烂茎线虫检测方法。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，简称RPA)仅需一对30bp～35bp的引物，在25～42℃的恒温下扩增反应5～20min，即可完成检测。其具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、反应温度低、操作简便等优点，可以满足口岸检疫和现场检测等快速检测的要求。目前，RPA技术已广泛应用于人、动物或植物上病原菌的快速检测，但在植物寄生线虫检测领域应用还相对较少，如仅有对植物根结线虫和松材线虫检测的报道(Deok Jea Cha等Forest Pathol，2019，49(3)：e12503)，但大多是基于RPA凝胶电泳体系的检测(CN109486960A；CN108559783A；Ju Yuliang等Eur J Plant Pathol，2019，155(4)：1155-1163)。其中实时荧光RPA检测技术是使用最多、最为成熟的RPA技术之一，在马铃薯腐烂茎线虫检测上已有应用(CN110863058A)。但是因实时荧光RPA检测需要荧光检测设备，存在设备成本太高，且对人员素质要求较高等缺陷，仍然难以满足基层农户现场检测的要求。所以亟需一种对设备和人员要求更低的检测体系来满足普通农户的检测需求，试纸条RPA检测体系恰好最接近满足此种需求。

基于侧流层析试纸条的重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification Assay combined with lateral flow dipstick，简写为：LFD-RPA)，简称为试纸条RPA，其在37-42℃恒温下就可进行扩增反应，对设备的要求低，如用水浴锅即可，比较廉价，甚至可以直接用人的体温进行加热，同时通过侧流层析试纸条来读取试验结果，简单可靠，一般人员皆可，对人员的素质要求低。虽然实时荧光RPA和试纸条RPA检测体系在引物的设计原则上是相同的，但其探针的设计原则存在很大不同，这样，两种检测方法的引物并不一定相同；本发明人研究发现，实时荧光RPA的引物(CN110863058A)在试纸条RPA检测中无法应用，因此，还需要重新设计和开发用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA的引物。

目前，尚未发现应用试纸条RPA对马铃薯腐烂茎线虫进行检测的报道。

发明内容

针对现有PCR、LAMP以及实时荧光RPA技术存在对设备、人员素质等要求高、难以满足现场实时检测要求等问题，本发明目的在于利用试纸条RPA技术对马铃薯腐烂茎线虫进行检测。该技术对设备要求简单，并且通过试纸条读取检测结果，对人员素质要求不高，能满足基层农户现场和口岸检疫等实时检测要求。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物，包括一对引物；所述的引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；所述引物包括上游引物Dt-LFITSF2和下游引物Dt-LFITSR1：

Dt-LFITSF2：5′-GCAAAAGTCGTAACAAGGTGGCTGTAGGTG-3′(SEQ ID No：1)，

Dt-LFITSR1：5′-Biotin-AACAAAGCCGTTTTTCGCCCACAAATTAGC-3′(SEQ ID No：2)。

其中，Biotin为在下游引物的5′端引入生物素基团。

本发明还提供了一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物和探针的组合，包括上述一对引物和一个探针；其中所述引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQ ID No：3所示的序列组成；所述探针的序列如下：

Dt-LFITSPs1：5′-FAM-TAGTCCTCAAAGGTGGCATGCTTCTGCCATGC-THF-AGGCACAGGGTAGTTG-C3-Spacer-3′(SEQ ID No：3)；

其中，FAM为在5′端引入荧光素基团；THF为四氢呋喃；C3-Spacer用于在3′末端引入间臂从而阻止链的延伸。

本发明还提供了上述试纸条RPA引物在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

本发明还提供了上述试纸条RPA引物和探针组合在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

本发明还提供了一种用于马铃薯腐烂茎线虫的检测试剂盒，所述的试剂盒包含上述试纸条RPA引物和探针；其中所述的引物所述引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQ ID No：3所示的序列组成。

进一步地，上述检测试剂盒，还包括再水化缓冲液(Rehydration Buffer)、280mM醋酸镁(Magnesium acetate)、RPA冻干酶粉和ddH₂O。

所述RPA冻干酶粉是RPA扩增反应所需要的重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的混合物，以RPA冻干酶粉状态存在于RPA反应管中。

进一步地，所述检测试剂盒包括：RPA冻干酶粉(50μL体系用量)，再水化缓冲液29.5μL，10μM上游引物Dt-LFITSF2 2.1μL，10μM下游引物Dt-LFITSR1 2.1μL，10μM探针Dt-LFITSPs1 0.6μL，DNA模板2μL，ddH₂O 11.2μL，280mM醋酸镁2.5μL。

进一步地，上述检测试剂盒，还包括侧流层析试纸条及其配套试纸条检测缓冲液PBST(1×PBS+0.1％吐温20)。

上述检测试剂盒中除了引物和探针需要单独合成外，其余试剂和测流层析试纸条等皆可于市场上购买。

本发明还提供了上述检测试剂盒在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

本发明还提供了利用上述RPA引物或检测试剂盒检测马铃薯腐烂茎线虫的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品线虫DNA；

(2)配制RPA反应体系：在含有RPA冻干酶粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5μL，上游引物Dt-LFITSF2(10μM)2.1μL，10μM下游引物Dt-LFITSR1 2.1μL，10μM探针Dt-LFITSPs1 0.6μL，待测样品DNA 2μL，ddH₂O 11.2μL，280mM醋酸镁2.5μL；充分混合均匀；

(3)RPA扩增：将步骤(2)的反应管置于恒温设备中，在39℃反应12min，反应结束后，将反应产物用PBST缓冲液稀释50倍，然后取稀释的产物10μL加到侧流层析试纸条的样品垫上，再将试纸条样品垫一端插入到PBST缓冲液中，反应2-15min，观察显色反应；

(4)结果的判读：如果试纸条的质控线(C)和检测线(T)均出现红色条带，则判定被检样品为阳性；如果试纸条仅有质控线(C)出现红色条带，则判定被检样品为阴性，如果质控线(C)和检测线(T)两条线均未显色，则说明该试纸条或扩增试剂已损坏、失效或操作有误，结果无效。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)特异性强。本发明RPA引物仅在马铃薯腐烂茎线虫DNA为模板时能得到扩增产物，在其他线虫DNA为模板时中不能扩增出产物，说明本发明RPA引物对马铃薯腐烂茎线虫特异性强。尤其本发明中使用了探针，其检测的特异性更强；而普通PCR和LAMP均没有使用探针，特异性相对较差。因此，用本发明RPA引物对马铃薯腐烂茎线虫鉴定的结果准确、可靠。(2)灵敏度高。本发明RPA引物灵敏度高，仅需1/3125头线虫的DNA量即可检出马铃薯腐烂茎线虫。(3)反应温度低，对设备要求简单。本发明在37～42℃恒温下即可实现扩增反应，即用水浴锅等能保持恒温的设备即可实现，不需要专业的仪器设备；而现有的PCR、LAMP、实时荧光RPA检测等都需要专业的设备，还可能需要不停地变温才能完成检测；因而本发明对设备要求简单，成本低。(4)检测速度快。用本发明方法检测马铃薯腐烂茎线虫最短只需约15min，而用PCR和LAMP技术则至少需要50min，甚至更久。(5)操作简便、便于进行现场检测。本发明方法仅需将几个组分混匀，并置于温控设备进行反应，随后用试纸条对反应产物进行结果判读即可完成检测。另外，所使用的试纸条、RPA冻干酶粉及其它组分均可以在常温下长时间保存，便于携带至现场进行检测。(6)结果判读简单，对人员素质要求低。本发明根据试纸条质控线和检测线的显色情况目测即可对结果做出判定，一般人员均可判读，对人员素质要求不高；而普通PCR、qPCR、LAMP以及实时荧光RPA均需要经过特殊设备读取结果后才可进行判定，且一般人员需要进行培训后才能正确解读结果。(7)检测成本低。本发明中所用到的仪器设备如水浴锅价格最便宜的不到1千元，而PCR或qPCR所用到的设备则需要几十万甚至更贵。总之，与PCR实验相比，RPA实验能在恒定温度下进行全程实验，没有复杂的操作，对仪器及人员的要求不高，适合基层或现场快速诊断。

附图说明

图1.马铃薯腐烂茎线虫试纸条RPA引物组合筛选电泳图谱；其中各泳道对应的引物组合为：1为Dt-LFITSF1/Dt-LFITSR1；2为Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR1,3为Dt-LFITSF3/Dt-LFITSR1；4为Dt-LFITSF4/Dt-LFITSR1；5为Dt-LFITSF5/Dt-LFITSR1；6为Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR1；7为Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR2；8为Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR3；9为Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR4；10为Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR5；11为Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR6。

图2.试纸条结果判读示意图。

图3.实时荧光RPA引物在LFD-RPA方法中对马铃薯腐烂茎线虫的特异性检测结果照片；其中1为空白对照；2为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)；3为象耳豆根结线虫(Meloidogyne′enterolobii)；4为嗜菌异小杆线虫(Heterorhabditis bacteriophora)；5为夜蛾斯氏线虫(Steinernema feltiae)；6为马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchusdestructor)。

图4.本发明RPA引物对马铃薯腐烂茎线虫的特异性检测结果照片；其中1为空白对照；2为南方根结线虫(M.incognita)；3为为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)；4为象耳豆根结线虫(M.enterolobii)；5为北方根结线虫(M.hapla)；6为夜蛾斯氏线虫(S.feltiae)；7为嗜菌异小杆线虫(H.bacteriophora)；8为马铃薯腐烂茎线虫(D.destructor)。

图5.本发明试纸条RPA引物对马铃薯腐烂茎线虫的特异性检测结果照片；其中1为空白对照；2为南方根结线虫(M.incognita)；3为象耳豆根结线虫(M.enterolobii)；4为菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)；5为玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)；6为矮化线虫(Trichotylenchus changlingensis)；7为土壤中茎线虫属线虫(Ditylenchus spp.)；8为马铃薯腐烂茎线虫(D.destructor)。

图6.本发明试纸条RPA引物对马铃薯腐烂茎线虫的灵敏度检测结果照片；从右到左分别为将提取的单条线虫gDNA浓度稀释至原浓度的1/5，1/5²，1/5³，1/5⁴，1/5⁵，1/5⁶，1/5⁷，CK为空白对照。

图7.病地土壤中马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA检测结果照片；其中1为空白对照，2～7为从病地采集土样的6个重复，8为阳性对照。

图8.非病地土壤中马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA检测结果照片；其中1为空白对照，2～7为从非病地采集土样的6个重复，8为阳性对照。

图9.甘薯茎组织中马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA检测结果照片；其中1为空白对照；2为健康茎组织对照；3、4为加入1头茎线虫的甘薯茎组织；5、6为加入3头茎线虫的甘薯茎组织；7、8为加入5头茎线虫的甘薯茎组织。

具体实施方式

实施例1马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物及探针的设计和筛选试验

(1)根据试纸条RPA引物、探针的设计原则，基于马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchusdestructor)rDNA-ITS序列保守区，设计了如下5个上游引物、6个下游引物和一个探针(均由上海生工合成)(见表1)：

表1.LFD-RPA引物及探针序列设计列表

其中，Biotin为在下游引物的5′端引入生物素基团；FAM为在探针5′端引入荧光素基团；THF为四氢呋喃；C3-Spacer用于在3′末端引入间臂从而阻止链的延伸。

(2)马铃薯腐烂茎线虫DNA的提取：

(a)单条线虫DNA的提取：按照发明专利CN109750034A的方法提取。

(b)大量线虫DNA的提取：使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.0进行提取，并按照说明书进行操作。

(3)RPA反应体系及条件：按照

basic试剂盒的说明书进行操作，在含有RPA冻干粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5μL，10μM上游引物2.1μL，10μM下游引物2.1μL，马铃薯腐烂茎线虫DNA 2μL，ddH₂O 11.8μL，最后加入280mM醋酸镁2.5μL；充分混合均匀后，将已加入各种组分的RPA反应管置于水浴锅中，在39℃反应20min。

(4)将步骤(3)所得RPA扩增产物利用PCR产物纯化试剂盒(市售试剂盒均可以使用)纯化后取5ul于浓度为1％的琼脂糖凝胶中电泳，核酸染料(Gelred)染色后，在凝胶成像仪中进行观察，拍照。如果有条带说明扩增出目的片段。

结果(见图1)：基于交叉配对法以Dt-LFITSR1为下游引物筛选最佳上游引物，结果以Dt-LFITSF2为上游引物时条带最亮，即该引物为最佳上游引物；再以Dt-LFITSF2为上游引物筛选最佳下游引物，结果以Dt-LFITSR1为下游引物时条带最亮，即最佳下游引物为Dt-LFITSR1；由此初步筛选获得最佳引物对Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR1，在该引物扩增片段内设计了探针Dt-LFITSPs1并进行下游测试，筛选出本发明用于对马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物和探针。

具体序列如下：

Dt-LFITSF2：5′-GCAAAAGTCGTAACAAGGTGGCTGTAGGTG-3′(SEQ ID No：1)，

Dt-LFITSR1：5′-Biotin-AACAAAGCCGTTTTTCGCCCACAAATTAGC-3′(SEQ ID No：2)，

Dt-LFITSPs1：5′-FAM-TAGTCCTCAAAGGTGGCATGCTTCTGCCATGC-THF-AGGCACAGGGTAGTTG-C3-Spac er-3′(SEQ ID No：3)。

实施例2试纸条RPA候选引物组合对马铃薯腐烂茎线虫的特异性试验

(一)、本发明人在专利CN110863058A中已公开一组用于检测马铃薯腐烂茎线虫的实时荧光RPA的引物及探针。为验证该引物探针组合是否适用于试纸条RPA，本发明以此引物探针组合的序列为基础，依据试纸条RPA的要求重新进行了碱基修饰(见表2)。

表2碱基修饰后的引物和探针组合

(二)、试验方法：

(1)待测线虫：马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)、象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、菲利普孢囊线虫(Heterodera filipjevi)、禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)、夜蛾斯氏线虫(Steinernemafeltiae)、嗜菌异小杆线虫(Heterorhabditis bacteriophora)、矮化线虫(Trichotylenchus changlingensis)、土壤中茎线虫属线虫(Ditylenchus spp.)，上述线虫均保存于河北省农林科学院植物保护研究所。

(2)DNA制备：

(a)单条线虫DNA的提取：按照发明专利CN109750034A所述方法提取。

(b)大量线虫DNA的提取：使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.5.0进行提取，并按照说明书进行操作。

(3)RPA反应体系：以实施例1筛选获得引物探针组合Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR1、Dt-LFITSPs1，和(一)中修饰所得的引物探针组合：DtLF-F4/DtLF-R1、DtITS-LFPs2进行试验，按照

nfo试剂盒的说明书进行操作，在含有RPA冻干粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5μL，10μM上游引物2.1μL，10μM下游引物2.1μL，10μM探针0.6μL，DNA模板2μL，ddH₂O 11.2μL，最后加入280mM醋酸镁2.5μL；充分混合均匀。

注：醋酸镁加入后会立即启动整个RPA反应，所以如同时对多个样品进行检测，可以将2.5μL醋酸镁依次加到各反应管的管盖内，最后一起通过离心将醋酸镁同时加入到各反应管，从而同时启动多管的RPA反应。

(4)RPA反应条件：将步骤(3)已加入各种组分的RPA反应管置于水浴锅中，在39℃反应12min，反应结束后，将反应产物用PBST稀释50倍，然后取10μL稀释的产物加到侧流层析试纸条的样品垫上，之后将试纸条样品垫一端插入到PBST缓冲液中2-15min，观察试纸条显色反应。

(5)结果的判读：结果判读示意图见图2，如试纸条的质控线(C)和检测线(T)均出现红色条带则判定被检样品为阳性，即待测线虫为马铃薯腐烂茎线虫；如试纸条仅有质控线(C)出现红色条带则判定被检样品为阴性，即待测线虫不是马铃薯腐烂茎线虫；如C和T两条线均未显色则提示该试纸条和扩增试剂可能已损坏、失效或操作有误。

结果：以专利申请CN110863058A中的引物序列为基础进行重新修饰的试纸条RPA引物探针组合DtLF-F4/DtLF-R1,探针DtITS-LFPs2的特异性测试结果显示(见图3)象耳豆根结线虫，夜蛾斯氏线虫和靶标马铃薯腐烂茎线虫的T线均出现色带，即该引物探针组对马铃薯腐烂茎线虫不是特异性的，也即该引物探针组无法直接应用于试纸条RPA的检测中。而以本发明实施例1中筛选获得的引物探针组合Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR1，探针Dt-LFITSPs1的特异性测试结果(见图4和图5)显示象耳豆根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、禾谷孢囊线虫等10种线虫和空白对照CK(水)的T线均未出现色带，即检测结果为阴性，而马铃薯腐烂茎线虫的T线均出现色带，即检测结果为阳性。说明本发明引物Dt-LFITSF2/Dt-LFITSR1和探针Dt-LFITSPs1引物组对马铃薯腐烂茎线虫具有很好的特异性，可用于对马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA检测。

实施例3本发明试纸条RPA引物组的灵敏度试验

按照如下方法进行：

(1)DNA制备：以实施例2步骤(2)所述方法提取马铃薯腐烂茎线虫的单条线虫基因组DNA，体系总10μL，即起始浓度为0.1头/μL，以5倍的梯度稀释法进行稀释，分别稀释为原浓度的：1/5，1/5²，1/5³，1/5⁴，1/5⁵，1/5⁶，1/5⁷。

(2)RPA反应体系和反应条件：分别参见实施例2步骤(3)和(4)，模板相应加入2μL各梯度浓度的基因组DNA。

结果(见图6)在1/5，1/5²，1/5³，1/5⁴的稀释倍数下T线均明显的出现红色条带，说明本发明检测方法的检测底限为0.1头/μL×1/5⁴×2μL＝1/5⁵头，即1/3125头线虫的DNA即可检测出马铃薯腐烂茎线虫；上述结果说明本发明试纸条RPA引物及检测方法的检测灵敏度高，能满足口岸检疫和田间现场实时检测要求。

实施例4利用本发明试纸条RPA引物探针组合对田间土壤中马铃薯腐烂茎线虫的鉴定试验

按照如下方法进行：

(1)待测土壤的采集：采用五点取样法，从病地(甘薯茎线虫病连年发病的地块)采集土样5份，均来自河北省农林科学院植物保护研究所农场，室内从5份土样中分别取100g混匀后备用；非病地(未种过甘薯的地块)采集土样5份，为来自秦皇岛抚宁一块常年种大姜的地块，同样从5份土样中分别取100g进行混匀后备用。

(2)土壤中马铃薯腐烂茎线虫的调查：利用浅盘法从待测土壤中分离出土壤线虫，并在体式显微镜下调查土壤中是否含有马铃薯腐烂茎线虫。

(3)土壤总DNA制备：按照

Spin Kit for Soil试剂盒的说明书进行提取，每个样品6个重复。

(4)RPA反应体系和反应条件：反应体系和条件分别参照实施例2步骤(3)和(4)，模板相应加入步骤(3)中所提取的土壤总DNA，以马铃薯腐烂茎线虫DNA为阳性对照，水为空白对照。

本试验检测结果显示从病地采集的样品6个重复中有5个检测的结果为阳性(见图7)，而从非病地采集样品的6个重复中全部显示为阴性(见图8)，而通过对利用浅盘法从土壤中分离的线虫进行调查发现从病地采集的5份样品中均含有马铃薯腐烂茎线虫，而非病地的5份样品中均未发现马铃薯腐烂茎线虫，与本发明试纸条RPA检测的结果基本一致，说明本发明试纸条RPA引物及其检测方法对马铃薯腐烂茎线虫的检测准确、可靠。而从病地采集的样品中有一个重复NC6未显示阳性，这可能跟本次取样有关系，由于试剂盒每样品提取土壤起始量仅为0.5g，而线虫在土壤中的分布是不均匀的，存在用于单次提取DNA的土壤样品中未能捕捉到靶标线虫的可能，提示我们在实际应用中应设置多个重复，以确保能捕捉到靶标线虫。

实施例5利用本发明方法对甘薯茎组织中马铃薯腐烂茎线虫的鉴定试验

按照如下方法进行：

(1)甘薯茎组织的准备：按0.1g/份切取健康甘薯茎组织7份，取出一份作为阴性对照，另6份分为三组每组两份分别加入马铃薯腐烂茎线虫1头、3头和5头。

(2)甘薯茎组织DNA的提取：利用通用基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，购自大连宝生物)提取基因组DNA，并按照说明书进行操作。

(3)试纸条RPA反应体系和反应条件：分别参照实施例2步骤(3)和(4)，模板相应加入步骤(2)中所提取的茎组织DNA，以健康苗组织DNA为阴性对照，水为空白对照。

结果(见图9)所有6个加入马铃薯腐烂茎线虫的甘薯茎组织均被鉴定为阳性，即获得了扩增产物；而健康甘薯茎组织和水对照的T线均未出现色带，即没有产生扩增产物。说明用本发明试纸条RPA引物和探针组合可以灵敏检测到甘薯茎组织中侵染的马铃薯腐烂茎线虫。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其限制，本领域技术人员依据本发明可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在本发明的权利要求保护范之内。

序列表

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物及其检测试剂盒

<130> 2020S1765IHCY

<141> 2020-06-17

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gcaaaagtcg taacaaggtg gctgtaggtg 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is Biotin

<400> 2

naacaaagcc gtttttcgcc cacaaattag c 31

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(51)

<223> n is FAM；THF；C3-Spacer

<400> 3

ntagtcctca aaggtggcat gcttctgcca tgcnaggcac agggtagttg n 51

Claims (10)

1.一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物，其特征在于，包括一对引物；所述的引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成。

2.权利要求1所述的试纸条RPA引物在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

3.一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物和探针的组合，其特征在于包括一对引物和一个探针；其中所述引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQ ID No：3所示的序列组成。

4.权利要求3所述的纸条RPA引物和探针组合在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

5.一种用于马铃薯腐烂茎线虫的检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含上述试纸条RPA引物和探针；其中所述的引物所述引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQ ID No：3所示的序列组成。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括再水化缓冲液、醋酸镁、RPA冻干酶粉和ddH₂O。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RPA冻干酶粉是重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的混合物。

8.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括：RPA冻干酶粉，再水化缓冲液29.5μL，10μM上游引物2.1μL，10μM下游引物2.1μL，10μM探针0.6μL，DNA模板2μL，ddH₂O 11.2μL，280mM醋酸镁2.5μL；还包括侧流层析试纸条和检测缓冲液PBST。

9.权利要求5～8任一所述的检测试剂盒在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

10.利用权利要求1所述的RPA引物或权利要求5～8任一所述的检测试剂盒检测马铃薯腐烂茎线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品线虫DNA；

(2)配制RPA反应体系：在含有RPA冻干酶粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5μL，10μM上游引物2.1μL，10μM下游引物2.1μL，10μM探针0.6μL，待测样品DNA 2μL，ddH₂O 11.2μL，280mM醋酸镁2.5μL；充分混合均匀；

(3)RPA扩增：将步骤(2)的反应管置于恒温设备中，在39℃反应12min，接着将反应产物用PBST缓冲液稀释50倍，然后取稀释的产物10μL加到侧流层析试纸条的样品垫上，再将试纸条样品垫一端插入到PBST缓冲液中，反应2～15min，观察显色反应；

(4)结果的判读：如果试纸条的质控线(C)和检测线(T)均出现红色条带，则判定被检样品为阳性；如果试纸条仅有质控线(C)出现红色条带，则判定被检样品为阴性，如果质控线(C)和检测线(T)两条线均未显色，则说明该试纸条或扩增试剂已损坏、失效或操作有误，结果无效。

Images