CN114410802B - 一种检测禾谷孢囊线虫的rpa引物和探针、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针、试剂盒及应用，属于植物寄生线虫的检测领域。所述RPA引物和探针，其包括一对特异性引物HaRPA‑F3和HaRPA‑R3，以及一个探针Ha‑probe，其中，所述HaRPA‑F3和HaRPA‑R3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑2所示，所述Ha‑probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。利用上述RPA引物和探针建立了禾谷孢囊线虫的快速可视化检测方法，且灵敏度高，特异性强，整个检测过程可以在1小时内完成。因此，本发明RPA检测法是一种简单、快速、特异、灵敏度高和直观的方法，可以适用于在田间快速检测禾谷孢囊线虫。

Description

一种检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及植物寄生线虫的检测领域，特别是涉及一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的RPA的引物和探针、试剂盒及应用。

背景技术

禾谷类作物孢囊线虫(Cereal cyst nematodes)是严重影响小麦、大麦、燕麦等禾谷作物的一大类孢囊线虫，在世界主要小麦产区都有发生分布和危害，造成小麦的重大产量损失，其中最为严重的是禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、菲利普孢囊线虫(Heterodera filipjevi)和麦类孢囊线虫(Heterodera latipons)。

孢囊线虫的形态学差异非常小，主要在于孢囊阴门锥的结构，同时孢囊颜色、囊泡，双膜孔的形状也有细微的差异，但是这些差异需要丰富的专业知识才能够区分，在生产实际中很难应用，同时传统的形态学鉴定耗时较多，工作量大，很难满足目前高效快速和轻简化检测的要求。近年来，随着分子生物学的快速发展，PCR等快速检测技术已经广泛的运用到植物线虫的快速检测和鉴定中。目前运用到孢囊线虫的检测技术主要包括ITS-RFLP，PCR，SCAR，RAPD，real time PCR等。在早期，限制性片段长度多态性(RFLP)主要用于区分H.avenae和H.filipjevi，但是禾谷孢囊线虫的核糖体DNA(rDNA)中的ITS(内转录间隔区)显示了种内群体的异质性和遗传多样性。Qi等(2012)和Peng等(2013)分别筛选出H.avenae和H.filipjevi的SCAR标记引物，可以直接从土壤和小麦根部检测出H.avenae和H.filipjevi。Toumi(2012)等人根据线粒体DNA(mtDNA)的COI序列设计了特异性引物，分别检测多个国家和地区的H.avenae和H.filipjevi。彭德良等(2003)扩增了中国小麦禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因的内转录间隔区，用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国禾谷孢囊线虫ITS属于“B型”，Hinf I酶切揭示出中国与摩洛哥禾谷孢囊线虫ITS之间存在明显差异。Yan等(2011)运用rDNA-ITS区域RFLP结合形态学鉴定的方法对美国部分地区的禾谷孢囊线虫进行了检测，该方法通过6种限制性内切酶能够有效的区分禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫。Fu等对中国黄淮海麦区的禾谷孢囊线虫进行了ITS和RFLP分析。以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上弥补了传统形态鉴定上的缺陷。但PCR检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，需要较长的时间，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用，在禾谷孢囊线虫病发生分布调查和田间快速诊断过程中，迫切需要一种简便快捷的检测手段。

上述方法综合特点是反应时间长，操作复杂，需要昂贵的设备。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplificarion，RPA)更是被称为可替代PCR的核酸检测技术。RPA技术是模拟了生物体内DNA复制，基于重组酶和聚合酶介导的扩增原理发展而来。该技术主要依赖于结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。这3种酶的混合物在常温下即具有活性，最佳反应温度在37℃-42℃。目前，虽然已有研究者将该方法应用到植物寄生线虫的检测上，但是使用RPA技术检测土壤中禾谷孢囊线虫的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过设计特异性检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针，可以检测目标线虫，并且操作步骤简单，反应结果能够通过肉眼直接判定，适用于各种条件下检测工作的进行。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的RPA引物和探针，其特征在于，包括一对特异性引物HaRPA-F3和HaRPA-R3，以及一个探针Ha-probe，其中，所述HaRPA-F3和HaRPA-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示，所述Ha-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的是，所述HaRPA-R3的5'末端标记生物素。

优选的是，所述Ha-probe的5'末端标记荧光基团，所述Ha-probe的5'末端和3'末端的中间加入一个四氢呋喃，3'末端标记修饰胺基、磷酸基基团或C3-Spacer亚磷酰胺。

本发明还提供一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的试剂盒，包括所述的RPA引物和探针。

本发明还提供一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的方法，包括以待测样品中提取的DNA为模板，利用所述的RPA引物和探针扩增，电泳检测或侧流层析试纸条检测判定是否含有禾谷孢囊线虫H.avenae。

优选的是，扩增反应体系为A buffer 29.4μL，引物HaRPA-F3和HaRPA-R3各2μL，探针Ha-probe 0.6μL，模板DNA 2μL，11.5μL dd H₂O，2.5μL B buffer；

扩增条件为：40℃保温12min，4℃保存。

优选的是，采用侧流层析试纸条检测时，若所述试纸条的质控线和检测线全部出现条带，则所述待测样品为或含有禾谷孢囊线虫；若所述试纸条的质控线出现条带且检测线不出现条带，则所述待测样品不为或不含有禾谷孢囊线虫。

本发明还提供所述的RPA引物和探针，或所述的方法在制备检测禾谷孢囊线虫H.avenae试剂盒中的应用。

本发明还提供所述的RPA引物和探针，或所述的方法在制备诊断禾谷孢囊线虫感染情况的试剂盒中的应用。

优选的是，所述试剂盒中包括凝胶电泳相关试剂或侧流层析试纸条。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用RPA技术，获得了基于禾谷孢囊线虫基因组DNA的特异性序列设计出其特异性引物和探针，检测出目标线虫。利用设计上述的特异性引物和探针建立的禾谷孢囊线虫检测方法灵敏度高，特异性非常强，灵敏度结果显示RPA检测方法的检测阈值为10^-3个二龄幼虫DNA，10^-4个单孢囊DNA和0.01ng基因组DNA，灵敏度是普通PCR检测的100倍。与常见的密切相关的植物寄生线虫之间没有交叉反应，表明该检测技术和方法的特异性强。本发明的RPA检测方法可以快速检测出天然土壤中的禾谷孢囊线虫，整个检测过程可以在1小时内完成。这些结果表明，本发明公开的RPA检测法是一种简单、快速、特异、灵敏度高和直观的方法，可以适用于在田间快速检测禾谷孢囊线虫。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明RPA扩增技术的温度和时间体系优化结果；A：禾谷孢囊线虫RPA温度优化筛选结果(15-50℃)；B：禾谷孢囊线虫RPA温度优化筛选结果(35-42℃)；C：禾谷孢囊线虫RPA时间优化筛选结果(1-30min)；

图2为本发明RPA扩增技术特异性检测结果图；A：禾谷孢囊线虫特异性检测电泳结果图；B：禾谷孢囊线虫特异性检测侧流层析试纸条结果图；

图3为本发明禾谷孢囊线虫不同稀释浓度的100ng/μL gDNA灵敏度检测结果；A：RPA-LFD灵敏度检测结果；B：普通PCR灵敏度检测结果；

图4为本发明禾谷孢囊线虫不同稀释浓度的二龄幼虫和单孢囊DNA灵敏度检测结果；A：不同稀释浓度的二龄幼虫RPA-LFD灵敏度检测结果；B：不同稀释浓度的单孢囊RPA-LFD灵敏度检测结果；

图5为禾谷孢囊线虫的田间自然土壤RPA检测结果；A：RPA-LFD田间样品检测结果；B：常规PCR特异性引物检测结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中所述试剂均为市售，所用禾谷孢囊线虫样本申请人实验室均有保存，可以免费向公众发放。

主要试剂：DNeasy Blood&Tissue Kit、

土壤DNA分离试剂盒和PCR酶KODFX购自天根公司；DNA marker购自TaKaRa公司；引物、探针、gRNA和ssDNA均由上海生工生物技术有限公司合成；胶体金试条型DNA恒温快速扩增试剂盒和蛋白酶K购自全式金有限公司。PCRD试剂盒是从英国的ABINGDON公司购买的。

本发明的实验选用的材料：

本发明共收集并使用了菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)和禾谷孢囊线虫(H.avenae)的各3个种群以及其他12个线虫物种和14份小麦根际土壤样品(见表1)。这些线虫通过形态学和ITS-rDNA序列被鉴定。菲利普孢囊线虫(H.filipjevi)和禾谷孢囊线虫(H.avenae)的孢囊在4℃下保存40天，然后在16℃的消毒水中保存以进行孵化。二龄幼虫(J2s)每天用筛子收集，并储存在4℃。

表1供试孢囊线虫群体样品代码及来源

实施例1禾谷孢囊线虫DNA的提取

将单个二龄幼虫或孢囊挑入0.2mL PCR管中，加入20μL DNA分离缓冲液，包括10μL双蒸水(ddH₂O)，7μL PCR缓冲液[100mM Tris-HCl(pH8.9)，500mM KCl和15mM MgCl₂](Takara-Bio，日本滋贺)和3μL Protein K[600ng/mL](Solarbio，中国北京)，DNA分离方法如Peng等人(Peng H,Qi X,Peng D,et al.Sensitive and Direct Detection ofHeterodera filipjevi in Soil and Wheat Roots by Species-Specific SCAR-PCRAssays.[J].Plant Disease,2013,2(23):1-28)所述，使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,Hilden,Germany)，按照制造商的说明，从5000个二龄幼虫中分离出纯基因组DNA。根据商品使用说明，使用

土壤DNA分离试剂盒(No.12988-10，Qiagen)从人工接种的土壤和野外自然土壤中提取土壤DNA(sDNA)。使用Nano Drop ND-2000分光光度计对DNA进行量化。

实施例2RPA技术检测禾谷孢囊线虫方法的建立

按照DNA恒温快速扩增试剂盒说明书来设计RPA引物和探针(见表2)。

引物设计：根据禾谷孢囊线虫基因组的特异性SCAR序列(JQ405270.1)设计一段序列在100bp-300bp的长度，下游引物的5’端标记一个修饰基因(常用生物素)。荧光探针设计：在上下游引物中间，设计一段长度为46-52bp与目的片段互补的序列。5'末端标记荧光基团，5’端和3’端末端的中部位置标记一个dSpacer(THF)，作为nfo的识别位点；3’末端标记一个修饰基因(胺基、磷酸基基团或C3-Spacer亚磷酰胺)。

表2引物、探针及扩增产物序列

利用表1的特异性引物和探针，扩增H.avenae特异性基因组片段(SEQ ID NO:4)。RPA的反应体系为：A buffer 29.4μL，引物HaRPA-F3F/HaRPA-R3(10μmol/L)各2μL，0.6μLHa-probe(探针)(10μM)，2μL模板DNA，11.5μL ddH₂O，2.5μL B buffer，总计50μL。扩增条件为：40℃保温12min，4℃保存。

反应结束后，将扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳(120V)，30分钟后记录结果。或使用侧流层析试纸条检测扩增产物，若试纸条的质控线和检测线全部出现条带，则待测线虫为或包含禾谷孢囊线虫(H.avenae)；若试纸条的质控线出现条带且检测线不出现条带，则待测线虫不为或不包含禾谷孢囊线虫。

实施例3RPA-LFD体系的建立和优化

在实施例2的基础上，评估了8个不同的反应温度(15、20、25、30、35、40、45和50℃)和7个反应时间(1、5、10、15、20、25和30min)。为了进一步确定最佳反应温度，以禾谷孢囊线虫H.avenae的单条二龄幼虫为模板，分别在35、36、37、38、39、40、41和42℃8个不同温度下进行RPA扩增。

结果如图1所示，电泳检测时可以在15℃至50℃的宽温度范围内观察到条带(图1A)。在35℃和40℃之间，条带的亮度没有明显增强(图1B)。此外，在40℃下进行了7次不同时间的RPA反应，结果显示，当反应时间为5至30分钟时，都可以看到条带(图1C)，最佳反应时间为10至30分钟。

实施例5禾谷孢囊线虫RPA特异性检测

收集中国的禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的各3个种群以及中国的大豆孢囊线虫、甜菜孢囊线虫、大麦孢囊线虫、马铃薯金线虫、玉米孢囊线虫、南方根结线虫等12个植物寄生线虫群体(见表1)，分别提取其DNA作为模板一起进行RPA检测，以检测禾谷孢囊线虫的特异性。在无模板对照(NTC)反应中使用蒸馏水。

结果如图2所示，在侧流层析试纸条上含有禾谷孢囊线虫H.avenae的gDNA的反应中，观察到包括测试线和对照线的两条条带，而在其他非目标线虫物种和阴性对照中则没有测试线(图2A)。这些结果通过使用已公布的引物进行传统的PCR检测得到了证实(图2B)。

上述的禾谷孢囊线虫普通PCR检测，其扩增反应体系中还含有的特异性引物，分别为：

HaF1：TGACGAGAACATATGATGGGGATGAT

HaR1：GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT

普通PCR检测：PCR扩增反应在25μL反应混合物中进行，该反应混合物含有1μL10mM正向和反向引物HaF1/HaR1，12.5μL 2×PCR buffer for KOD FX(TOYOBO)，5μL 2mMdNTPs，2μL DNA模板，0.5μL 1U KOD FX DNA polymerase和4.5μL dd H₂O。反应条件如下：94℃初始变性4分钟，然后94℃变性30秒，55℃退火35个循环30秒，72℃延伸30秒，最后72℃延伸5分钟。PCR产物在用SYBR Green I核酸凝胶染料(Life Technologies，Eugene，Oregon，USA)染色的2％琼脂糖凝胶上分离，然后使用Quantum ST5成像系统(VilberLourmat，法国)拍照。

实施例6鉴定禾谷孢囊线虫灵敏度试验

为了确定RPA-LFD的灵敏度，从单条二龄幼虫和单个孢囊提取gDNA，同时以100ng/μL纯的禾谷孢囊线虫基因组DNA为模板，用无菌蒸馏水以10倍的增量连续稀释成10¹～1.0×10^-6 8个浓度。以其为DNA模板进行上述RPA-LFD(实施例2)检测。

结果如图3和图4所示：当使用RPA-LFD检测时，禾谷孢囊线虫的DNA浓度在100ng、10ng、1ng、10^-1ng、10^-2ng都观察到了测试线(图3A)。比常规PCR的灵敏度高100倍(图3B)。此外，结果显示，RPA-LFD试纸可以检测出低至10^-3稀释度的单个二龄幼虫的gDNA和10^-4稀释度的单个孢囊(图4A，B)。

实施例7检测田间土壤样本中的禾谷孢囊线虫。

在河南、湖北、安徽、山东、河北、北京等省市采集了14个田间小麦土壤样品(见表1)。每个样品从15个采样点采集，选择约500克混合均匀的土壤，并在2-5℃下保存，从每个完全混合的样品中取10克土壤样品。提取基因组DNA的PCR检测如上所述。在提取后用贝尔曼漏斗和漂浮法分别计算100克土壤中二龄幼虫和孢囊的数量。使用先前开发的特异性SCAR引物对结果进行验证。从灭菌的土壤中提取的DNA被用作RPA和普通PCR检测的对照模板，每个样品重复三次。

结果如图5所示，在5个样品(ZZHN，XYHB，SZAH，QDSD和HDHB)中检测到了禾谷孢囊线虫H.avenae(图5A)。LFD-RPA检测结果与常规PCR检测结果100％吻合(图5B)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针、试剂盒及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatggtgg tggtgggcag cggtcggcaa gc 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgatccaaca cgcctatttt ccctcctcac ag 32

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgccgaactg ggtggtcccg tttcccaagg gcgaacagga gaagattaga 50

<210> 4

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgatggtgg tggtgggcag cggtcggcaa gccaagcgga ttttggaaca tcagtgccaa 60

cgcggtgacc gcttggagtt ggtcctgtga ggagggaaaa taggcgtgtt ggatcg 116

Claims (6)

1.一种RPA引物和探针制备诊断禾谷孢囊线虫感染情况的试剂盒中的应用，其特征在于，所述RPA引物和探针包括一对特异性引物HaRPA-F3和HaRPA-R3，以及一个探针Ha-probe，其中，所述HaRPA-F3和HaRPA-R3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示，所述Ha-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述HaRPA-R3的5'末端标记生物素；

所述Ha-probe的5'末端标记荧光基团，所述Ha-probe的5'末端和3'末端的中间加入一个四氢呋喃，3'末端标记修饰胺基、磷酸基基团或C3-Spacer亚磷酰胺。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中包括凝胶电泳相关试剂或侧流层析试纸条。

3.一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的方法，其特征在于，包括以待测样品中提取的DNA为模板，利用权利要求1或2中所述的RPA引物和探针扩增，电泳检测或侧流层析试纸条检测判定是否含有禾谷孢囊线虫H.avenae。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增反应体系为A buffer29.4μL，引物HaRPA-F3和HaRPA-R3各2μL，探针Ha-probe 0.6μL，模板DNA 2μL，11.5μL dd H₂O，2.5μL Bbuffer；扩增条件为：40℃保温12min，4℃保存。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用侧流层析试纸条检测时，如果待测样品为或者包含禾谷孢囊线虫样品，在试纸条上呈现质量控制线和特异检测线两个条带，反之，则只有质控线一条带。

6.根据权利要求1或2中所述的RPA引物和探针在制备检测和/或鉴定禾谷孢囊线虫H.avenae试剂盒中的应用。

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