CN112143825B - 一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重pcr检测引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测引物及应用，所述引物包括一对针对花生黑腐病菌的特异性引物CC‑F和CC‑R，以及一对针对花生基腐病菌的特异性引物NC‑F和NC‑R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示。本发明所提供的双重PCR引物特异性强，建立的双重PCR体系能够从花生黑腐病菌及花生基腐病菌中扩增到相应的单一目的条带。本发明所建立的双重PCR方法可稳定、快速、特异、简便地检测花生植株中是否有引致症状难以区分的黑腐病/基腐病的单一/混合的相应病原菌，具有很好的应用前景和推广价值。

Description

一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测 引物及应用

技术领域

本发明涉及植物病菌检测技术领域，更具体地，涉及一种区分检测花生黑腐病菌和基腐病菌的双重PCR引物及其快速检测方法和试剂盒。

背景技术

花生黑腐病是由进境检疫性有害生物-冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola，无性态为寄生帚梗柱孢霉Cylindrocladium parasiticum)引起的一种真菌性病害，该病害为害花生的果针、荚果和根系，造成受害部位变黑腐烂，植株萎蔫死亡，是威胁花生健康生产的重要病害。花生黑腐病最早于1965年在美国乔治亚州首次报道，该病害传播迅速且难以防治，目前包括日本、韩国和澳大利亚等30多个国家均有发生。2009年，在我国的广东省首次发现花生黑腐病，随后该病害迅速蔓延至我国的江西省和福建省等地区，对我国的花生生产造成严重威胁(Pan et a l，2012；Gai et al，2012)。此外，黑腐病菌还可以侵染大豆引致红冠腐病，以及为害中华猕猴桃和紫花苜蓿等20多种植物(Guan et al，2010)。花生黑腐病菌属于高度风险性有害生物，对我国花生和大豆等作物的安全生产造成严重威胁(潘汝谦等，2012)。2007年，花生黑腐病菌(C.parasiticum)被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》；2010年，被增列入《广东省农业植物检疫性有害生物补充名单》。

花生基腐病由侵管新赤壳菌(Fusarium neocosmosporiellum)引起。花生基腐病菌及黑腐病菌为害花生所引致的田间症状类似，均造成植株茎基部和根系变黑腐烂，在病株茎基部均可产生成簇的(橘)红色子囊壳。花生黑腐病和基腐病都是典型的土传和种传病害，这两种病害一旦发生，生产上防控极为困难，病害的早期诊断对防止病害传播蔓延和病害防控尤为重要。花生黑腐病菌的传统检测方法包括传统分离培养法和分子生物学等方法，这些方法检测时间长，需要一定的专业鉴定知识支撑。此外，在田间，病害往往是由多种病原菌复合侵染引致，这增加了检测的复杂度。目前，针对花生黑腐病菌的LAMP分子检测技术虽已有报道，但是该研究方法只限于检测1种病菌，对症状类似的花生黑腐病及花生基腐病尤其难以区分和准确诊断，不能够满足检疫口岸和田间基层的快速、准确诊断的迫切需求。因此，非常有必要建立一套能够快速、灵敏、准确的同时区分花生黑腐病菌及花生基腐病菌的检测诊断技术，为病害的早期诊断提供技术支持。

多重PCR(polymerase chain reaction)是在同一个反应体系对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术，能够一次实现对多种病原菌的检测，其特点是耗时短的同时提高准确性和灵敏度。多重PCR技术具有节省时间、降低成本和提高效率的优势，在植物病原菌的鉴定和检测，尤其是对症状类似或病原菌复合侵染的检测中具有广泛的应用前景。但是目前还未见有同步区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的报道。因此，本领域亟需建立一种简单快速、特异性好、灵敏度高的用于区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR技术。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测引物及其检测方法，所述方法具有快速、准确、灵敏度强等特点。

本发明的第一个目的是提供一种用于区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测引物。

本发明的第二个目的是提供所述双重PCR检测引物在检测花生黑腐病菌和/或花生基腐病菌中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述双重PCR检测引物在制备用于检测花生黑腐病菌和/或花生基腐病菌的试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种用于检测花生黑腐病菌和/或花生基腐病菌的双重PCR检测试剂盒。

本发明的第五个目的是提供一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种用于区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR引物，由引物对CC-F和CC-R以及NC-F和NC-R组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示：

CC-F(SEQ ID NO:1)：5′-GGACCCGACCTGCTCAGAACCG-3′；

CC-R(SEQ ID NO:2)：5′-CGCAGCTGTGTTAGATCGCAGTGGT-3′；

NC-F(SEQ ID NO:3)：5′-CGCTGCTCTGAGCGGCCATCT-3′；

NC-R(SEQ ID NO:4)：5′-GGAACTCTTGACACTAATGTCAGTCTTGT-3′。

其中，引物对CC-F和CC-R用于检测花生黑腐病菌，引物对NC-F和NC-R用于检测花生基腐病菌。

利用上述的双重PCR引物进行双重PCR扩增；检测双重PCR扩增产物，扩增获得274bp单一目的条带说明待测样本含有花生黑腐病菌，扩增获得409bp单一目的条带则说明待测样本含有花生基腐病菌，扩增获得2条分别为274bp和409bp目的条带说明待测样本同时含有花生黑腐病菌和花生基腐病菌。

本发明的双重PCR检测引物可用于检测待测的花生植株病组织中是否含有引致症状难以区分的花生黑腐病/基腐病的单一/混合的相应病原菌。

因此，本发明要求保护上述双重PCR引物在检测花生黑腐病菌和/或花生基腐病菌中的应用。

本发明要求保护上述双重PCR引物在制备用于检测花生黑腐病菌和/或花生基腐病菌的试剂盒中的应用。

本发明要求保护上述双重PCR引物在区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌中的应用。

同时，本发明还要求保护一种用于检测花生黑腐病菌和/或花生基腐病菌的双重PCR检测试剂盒，该试剂盒中包含以上所述的双重PCR引物。

优选地，该试剂盒可用于区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌

优选地，还包括PCR反应缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶。

优选地，所述检测试剂盒，PCR的扩增反应体系为：DNA模板1μL，10×PCR Buffer4.5μL，2.5mmol/L dNTP s混合液3.6μL，5U/μL rTaq聚合酶0.225μL，0.2μM引物4条各0.25μL，灭菌超纯水补足25μL。

更优选地，所述检测试剂盒，PCR的扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，共37个循环，72℃延伸7min。

最优选地，一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示的双重PCR引物，还包括PCR反应缓冲液、dNTP和TaqDNA聚合酶。

优选地，一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测方法，其步骤为：利用上述的双重PCR引物进行双重PCR扩增；检测双重PCR扩增产物，扩增获得274bp单一目的条带说明待测样本含有花生黑腐病菌，扩增获得409bp单一目的条带则说明待测样本含有花生基腐病菌，扩增获得2条分别为274bp和409bp目的条带说明待测样本同时含有花生黑腐病菌和花生基腐病菌。

优选地，PCR的扩增反应体系为：DNA模板1μL，10×PCR Buffer 4.5μL，2.5mmol/LdNTP s混合液3.6μL，5U/μL rTaq聚合酶0.225μL，0.2μM引物4条各0.25μL，灭菌超纯水补足25μL；

优选地，PCR的扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，共37个循环，72℃延伸7min。

因此，本发明要求保护以上任一所述试剂盒在检测花生黑腐病菌和/或花生基腐病菌中的应用

同时，以上任一所述双重PCR检测试剂盒在区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌中的应用也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR引物及检测方法能够一次性快速、准确地区分检测出花生黑腐病菌和花生基腐病菌。

(2)本发明的双重PCR引物及检测方法特异性强，灵敏度高，可区分检测检测花生植株中是否有引致黑腐病和基腐病的单一或混合的病原菌，最低检测灵敏度为10pg/μL。

(3)本发明的双重PCR检测方法与传统症状识别、病原菌形态鉴定以及普通单引物PCR或LAMP相比，建立的双重PCR检测经济简便，节约成本，耗时短，可稳定、快速、特异区分检测引致花生田间症状相似的黑腐病菌及基腐病菌，可应用于检疫快速通关及田间花生病害的及时准确诊断和防控。

附图说明

图1为双重PCR的反应体系的浓度的优化结果。其中，M为DNA marker(DL1000)；1～5依次分别为不同的反应体系浓度：1×、1.2×、1.5×、1.8×、2×；6为空白对照。

图2为双重PCR引物浓度的优化结果。其中，M为DNA marker(DL1000)；1～6依次分别为不同的引物稀释浓度：0.25μL、0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL；7为空白对照。

图3为双重PCR的退火温度的优化结果。其中，M为DNA marker(DL1000)；1～6依次分别为不同的退火温度：58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃；7为空白对照。

图4为双重PCR的反应循环数的优化结果。其中，M为DNA marker(DL1000)；1～6依次分别为不同的反应循环数：31、33、35、37、39、41；7为空白对照。

图5为双重PCR特异性检测的测定结果。其中，M为DNA marker(DL1000)；1为花生黑腐病菌和花生基腐病菌；2为花生基腐病菌；3为花生黑腐病菌；4为花生根腐病菌(Fusariumsolani)，5为花生纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，6为花生白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)，7为大豆茎溃疡病菌(Diaporthe pha seolorum)，8为花生茎腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)，9为花生炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)，10为大豆炭腐病菌(Macrophomina pha seolina)；11为空白对照。

图6为双重PCR的灵敏性检测的测定结果。其中，M为DNA marker(DL1000)；1～7依次分别为不同的DNA的质量浓度：1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL；8为空白对照。

图7为人工接种病样的双重PCR检测的测定结果。其中，M为DNA marker(DL1000)；1为阳性对照；2～6依次分别为接种病菌后不同天数：第3天、第6天、第9天、第15天、第21天；7为阴性对照；8为空白对照。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR方法的建立

1、双重PCR引物的设计及合成

以花生黑腐病菌(C.ilicicola)和花生基腐病菌(F.neocosmosporiellum)为靶标菌，以花生生产中常见真菌性病害(尤其是为害根、茎基部)的病原真菌为参考菌，选择保守的calmodulin<cmdA>基因序列，通过比对分析，获取差异序列，设计引物，最后筛选获得2组特异性引物组，其核苷酸序列如下：

CC-F(SEQ ID NO:1)：5′-GGACCCGACCTGCTCAGAACCG-3′；

CC-R(SEQ ID NO:2)：5′-CGCAGCTGTGTTAGATCGCAGTGGT-3′；

NC-F(SEQ ID NO:3)：5′-CGCTGCTCTGAGCGGCCATCT-3′；

NC-R(SEQ ID NO:4)：5′-GGAACTCTTGACACTAATGTCAGTCTTGT-3′。

其中，引物对CC-F/R用于检测花生黑腐病菌，引物对NC-F/R用于检测花生基腐病菌。花生黑腐病菌的预期扩增目的片段的大小为274bp，花生基腐病菌的预期扩增目的片段的大小为409bp，2对引物组合成双重PCR引物。引物由华大基因有限公司合成。

2、菌株DNA的提取

供试菌株为花生黑腐病菌菌株GDMZ6和花生基腐病菌菌株GDHY24，由华南农业大学杀菌剂研究室分离、纯化并保存。

将供试菌株在PDA上培养3d后，切取菌落边缘菌丝块转接于PDB培养液中，28℃、120rpm摇床培养3～5d，真空抽滤收集菌丝体，置于研钵液氮研磨。采用OMEGA Fungal DNAKit提取真菌菌丝DNA，-20℃保存备用。

3、双重PCR反应体系的优化

(1)实验方法

双重PCR反应体系见表1。以花生黑腐病菌和花生黑腐病菌的混合DNA为模板，反应体系的浓度分别配制为：1×、1.2×、1.5×、1.8×和2×，以水为空白对照，以确定进行双重PCR反应的最佳体系浓度。

表1双重PCR体系浓度优化

PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，送至华大基因有限公司测序，将测序结果在GenBank中进行BLAST分析。

(2)实验结果

结果如图1所示，在所设定的反应体系浓度下，均能够扩增到花生黑腐病菌的目的条带(274bp)和花生基腐病菌的目的条带(409bp)，但反应体系浓度为1.8×时，两条目的条带最清晰明亮，为获得稳定扩增，故确定双重PCR的最适反应体系浓度为1.8×。

4、双重PCR引物的浓度的优化

(1)实验方法

以花生黑腐病菌和花生黑腐病菌的混合DNA为模板，选用1.8×PCR反应体系，将引物浓度依次设为：0.1μM(0.25μL)、0.2μM(0.5μL)、0.3μM(0.75μL)、0.4μM(1μL)、0.5μM(1.25μL)和0.6μM(1.5μL)进行梯度优化，以水为空白对照，以确定双重PCR反应的最佳引物浓度。

PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，送至华大基因有限公司测序，将测序结果在GenBank中进行BLA ST分析。

(2)实验结果

结果如图2所示，在引物浓度为0.25、0.5、0.75、1、1.25和1.5μL的条件下，均能扩增获得两条目的条带，但引物浓度为0.5μL时，两条目的条带最清晰明亮，为获得稳定扩增，故确定双重PCR引物的最适浓度为0.5μL。

5、双重PCR引物的反应退火温度的优化

(1)实验方法

以花生黑腐病菌和花生黑腐病菌的混合DNA为模板(两者均稀释至20ng/μL)，反应体系选用1.8×，引物浓度选用0.2μM(0.5μL)。将反应温度依次设为：58℃、60℃、62℃、64℃、66℃和68℃进行梯度实验，以确定双重PCR反应的最佳退火温度。

PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，送至华大基因有限公司测序，将测序结果在GenBank中进行BLA ST分析。

(2)实验结果

结果如图3所示，在退火温度为58、60、62、64、66和68℃的条件下，均能扩增获得两条目的条带，但在退火温度为62℃条件下两条目的条带最清晰明亮，而在退火温度为64、66和68℃的条件下扩增条带较暗淡。为获得稳定扩增，确定双重PCR引物的最佳反应退火温度为62℃。

6、双重PCR引物反应循环数的优化

(1)实验方法

以花生黑腐病菌和花生黑腐病菌的混合DNA为模板(两者均稀释至20ng/μL)，PCR反应体系选用1.8×，引物浓度选用0.2μM(0.5μL)，退火温度选用62℃，将反应循环数依次设为：31、33、35、37、39和41进行梯度试验，以确定双重PCR反应的最佳循环数。

PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，送至华大基因有限公司测序，将测序结果在GenBank中进行BLA ST分析。

(2)实验结果

结果如图4所示，在循环数31～41的条件下均有两条目的条带产生，在循环数为37的条件下两条目的条带最清晰明亮，而在循环数为39和41的条件下花生黑腐病菌的目的条带较暗淡(274bp)。为获得稳定扩增，确定双重PCR引物的最佳循环数为37个循环。

实施例2一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测试剂盒

一、组成

包含实施例1中所述的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示；还包括PCR反应缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶。

二、使用方法

1、菌株DNA的提取

供试菌株为花生黑腐病菌菌株GDMZ6和花生基腐病菌菌株GDHY24，由华南农业大学杀菌剂研究室分离、纯化并保存。花生黑腐病菌和花生基腐病菌的菌株DNA提取方法同实施例1中的2。

2、双重PCR扩增

以花生黑腐病菌和花生黑腐病菌的混合DNA为模板进行双重PCR扩增。

双重PCR的扩增反应体系为：DNA模板1μL，10×PCR Buffer 4.5μL，2.5mmol/LdNTP s混合液3.6μL，5U/μL rTaq聚合酶0.225μL，0.2μM引物4条各0.25μL，灭菌超纯水补足25μL；

双重PCR的扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，共37个循环，72℃延伸7min。

3、结果判定

双重PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，扩增获得274bp单一目的条带说明待测样本含有花生黑腐病菌，扩增获得409bp单一目的条带则说明待测样本含有花生基腐病菌。扩增获得2条分别为274bp和409bp目的条带说明待测样本同时含有花生黑腐病菌和花生基腐病菌。

实施例3双重PCR特异性检测

一、实验方法

供试菌株为花生黑腐病菌菌株GDMZ6和花生基腐病菌菌株GDHY24，由华南农业大学杀菌剂研究室分离、纯化并保存。花生黑腐病菌和花生基腐病菌的菌株DNA提取方法同实施例1中的2。

以花生生产中常见的真菌性病害(尤其是为害根、茎基部)的病原真菌为参考真菌，包括：花生根腐病菌(Fusarium solani)，花生纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，花生白绢病菌(Sclerotium rolfsii)，大豆茎溃疡病菌(Diaporthe pha seolorum)，花生茎腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)，花生炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)，大豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)，由华南农业大学植物病理学系杀菌剂研究室提供。水为空白对照，采用实施例2所述的双重PCR检测试剂盒及方法进行双重PCR的特异性检测。

二、实验结果

结果如图5所示，以花生黑腐病菌和花生基腐病菌的混合DNA为模板，扩增获得两条目标条带(泳道1，274bp和409bp)，条带清晰，容易区分，无杂带干扰；分别以两种病菌的DNA为模板，则分别扩增到花生基腐病菌的的单一目的条带(泳道2，409bp)及花生黑腐病菌的单一目的条带(泳道3，274bp)；而以其它7种参考菌DNA为模板(泳道4～10)和空白对照(泳道11)中均没有目的片段，表明实施例1设计筛选获得的双重PCR引物组CC-F和CC-R以及NC-F和NC-R特异性强，所建立的双重PCR反应体系能够特异性的同时区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌，且能够特异性的单独检测花生黑腐病菌或花生基腐病菌。

实施例4双重PCR灵敏度检测

一、实验方法

供试菌株为花生黑腐病菌菌株GDMZ6和花生基腐病菌菌株GDHY24，由华南农业大学杀菌剂研究室分离、纯化并保存。花生黑腐病菌和花生基腐病菌的菌株DNA提取方法同实施例1中的2。

对花生黑腐病菌和花生基腐病菌的混合DNA以10倍浓度梯度比进行稀释(从1ng/μL到1fg/μL)后，用实施例2所述双重PCR检测试剂盒及方法进行双重PCR的灵敏度检测。

二、实验结果

结果如图6所示，以两种病菌DNA等量混样模板浓度为1ng/μL～10pg/μL时均可稳定扩增出花生黑腐病菌和基腐病菌的两条目的条带，但DNA浓度为1pg/μL时则无条带产生，表明建立的双重PCR反应能够同时检测到花生黑腐病菌及花生基腐病菌的灵敏度最低限度为10pg/μL。

实施例5双重PCR检测体系对人工接种发病的花生组织DNA的检测

一、实验方法

1、人工接种花生及取样

供试花生品种为“天府3号”，取生长6周长势良好、健壮的花生植株，以打取PDA培养基上培养7天的花生黑腐病菌和花生基腐病菌的菌饼(6mm)为接种体拌入营养钵里花生植株的根部土壤中，共3个接种处理：单独接种花生黑腐病菌处理；单独接种花生基腐病菌处理；以及同时接种花生黑腐病菌和花生基腐病菌处理。以PDA培养基块(6mm)拌土接种为健康对照，以水为空白对照，在病原菌接种后第3、6、9、15和21天进行花生茎基部组织的取样。

2、植物DNA提取

液氮研磨，利用OMEGA HP Plant DNA Kit试剂盒提取花生植株样本DNA，以花生黑腐病菌菌株GDMZ6及花生基腐病菌菌株GDMZ95的混合DNA模板为阳性对照，以PDA培养基块拌土接种的花生植株样本DNA为阴性对照，水为空白对照，用实施例2所述双重PCR检测试剂盒及方法进行双重PCR检测。

二、实验结果

结果如图7所示，两种病菌复合接种花生第3和第6天时植株长势良好，双重PCR检测中没有目的条带；接种第9天时，植株上部叶片发黄，茎基部稍褐色，利用双重PCR检测能够扩增到花生基腐病菌的单一目的条带(409bp)；接种第15天时，植株长势不良，叶黄化，茎基部褐色，利用双重PCR检测能够扩增到两条目的条带(274bp和409bp)；第21天时，植株长势差，有的枯死，利用双重PCR检测可扩增到两条目标条带(274bp和409bp)。利用双重PCR检测接种PDA培养基块的花生植株样本及水对照，均无目的条带。以上结果表明本发明建立的双重PCR检测方法能够同时区分检测到花生黑腐病菌和花生基腐病菌复合侵染的植株样本，且对花生黑腐病菌/基腐病菌单独侵染的植株样本均能够检测到相应病菌，可用于田间花生黑腐病菌及基腐病菌的诊断检测。

序列表

<110> 华南农业大学，广州海关技术中心

<120> 一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测引物及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> SIPOSequenceListing 1.0

<400> 1

ggacccgacc tgctcagaac cg 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> SIPOSequenceListing 1.0

<400> 2

cgcagctgtg ttagatcgca gtggt 25

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> SIPOSequenceListing 1.0

<400> 3

cgctgctctg agcggccatc t 21

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> SIPOSequenceListing 1.0

<400> 4

ggaactcttg acactaatgt cagtcttgt 29

Claims (7)

1.一种用于区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示。

2.权利要求1所述双重PCR引物在检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌中的应用。

3.权利要求1所述双重PCR引物在制备用于检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的试剂盒中的应用。

4.一种用于检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述双重PCR引物。

5.根据权利要求4所述双重PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应缓冲液、dNTP和Taq DNA聚合酶。

6.权利要求4或5所述双重PCR检测试剂盒在区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌中的应用。

7.一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述双重PCR引物进行双重PCR扩增；检测双重PCR扩增产物，扩增获得274 bp单一目的条带说明待测样本含有花生黑腐病菌，扩增获得409 bp单一目的条带则说明待测样本含有花生基腐病菌，扩增获得2条分别为274 bp和409 bp目的条带说明待测样本同时含有花生黑腐病菌和花生基腐病菌；

双重PCR反应体系为：DNA模板1 μL，10×PCR Buffer 4.5 μL，2.5 mmol/L dNTP s混合液3.6 μL，5U/μL Taq聚合酶0.225 μL，0.2 μM权利要求1所述双重PCR引物4条各0.25 μL，无菌水补足25 μL；

双重PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共37个循环，72℃延伸7 min。

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