CN111088392B - 用于检测花生黑腐病菌的lamp检测引物及其检测方法 - Google Patents

用于检测花生黑腐病菌的lamp检测引物及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111088392B
CN111088392B CN202010146746.9A CN202010146746A CN111088392B CN 111088392 B CN111088392 B CN 111088392B CN 202010146746 A CN202010146746 A CN 202010146746A CN 111088392 B CN111088392 B CN 111088392B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lamp
black rot
detection
mul
peanut
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010146746.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111088392A (zh
Inventor
丁雪玲
黄建成
谢世勇
季洁
曾兆华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of FAAS
Original Assignee
Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of FAAS filed Critical Institute of Plant Protection of FAAS
Priority to CN202010146746.9A priority Critical patent/CN111088392B/zh
Publication of CN111088392A publication Critical patent/CN111088392A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111088392B publication Critical patent/CN111088392B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开用于检测花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的LAMP检测引物及其检测方法，可用于花生黑腐病菌的特异性检测。通过设计花生黑腐病菌的LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物，序列如SEQ ID NO.1‑4所示。经恒温扩增，采用SYBR green І显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。所述的LAMP引物及检测方法可用于生产实践中花生黑腐病菌感染的植株或者发病潜伏期时花生黑腐病菌的快速、灵敏、准确的检测及花生种子的检验检疫，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治花生黑腐病菌提供可靠的技术和理论依据。

Description

用于检测花生黑腐病菌的LAMP检测引物及其检测方法
技术领域
本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及用于检测花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的LAMP检测引物及其检测方法，可用于花生黑腐病菌高灵敏度、快速的特异性分子检测，还可用于花生黑腐病的早期诊断、病原菌的鉴定和监测及花生种子的检验检疫。
背景技术
花生黑腐病（Calonectria ilicicola）1965年首次在美国乔治亚州发现，之后迅速扩散至全美国的花生产地。目前主要分布于美国、日本、印度以及澳大利亚的花生产区。花生黑腐病由寄生柱枝孢菌(Cylindrocladium parasiticum Crous,Wingfield＆Alfenas）引起，有性阶段为冬青丽赤壳菌（Calonectria ilicicola Boedign & Reitsma）。该病原菌可侵染花生的果针、荚果和根系，罹病部位变黑腐烂，并导致植株萎蔫和死亡。花生黑腐病造成的产量损失一般在10％左右，严重的超过50％，是一种毁灭性的病害。花生黑腐病菌还可以侵染大豆、苜蓿等 20多种重要作物和其他植物。花生黑腐病的防治非常困难，没有高抗的花生品种和有效的化学药剂可用，农业防治难以奏效，土壤熏蒸有一定的效果，但费用昂贵且污染环境。2009年花生黑腐病在我国广东省首次发现，该病菌已经被我国列为进境植物检疫性病原菌。因此，开展花生黑腐病菌快速检测方法的研究，对防止病原菌的蔓延传播以及该病害的早期诊断和防治具有十分重要的意义。
目前，花生黑腐病菌的检测方法包括传统分离培养法和分子生物学等方法。黑腐病菌的传统检测方法是采用PDA培养基对病原物进行分离纯化，然后进行一系列的生理生化实验进行诊断。该方法不仅速度慢时间长，还容易受外界因素的影响且灵敏度较低，难以满足花生黑腐病诊断的实际需要。PCR技术为植物病原菌的检测提供了新途径，但是PCR特异性检测技术需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。因此，建立一套快速、灵敏、准确的花生黑腐病菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNApolymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增109–1010倍，其扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，将LAMP方法应用于花生黑腐病菌的检测国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的LAMP检测引物及其检测方法，本方法操作简便、特异性强、灵敏度高，可得到准确可靠的实验结果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
花生黑腐病菌的LAMP检测引物及其检测方法，其具体步骤如下：
1、LAMP引物的设计：根据花生黑腐病菌的translation elongation factor 1-alpha (tef1)基因序列采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物，引物序列如下：
外侧引物TF3：5’-TGACACTGTGCTGACTCTCA-3’；
TB3：5’-GCTGAAGGACAGAAGCTGAG-3’；
内侧引物TFIP：5’-GCTTGTCAAGAACCCAGGCGT-AAACAGGAAGCCGCTGAAC-3’；
TBIP：5’-CCGAGCGTGAGCGTGGTATC-GACGGTGACATCGTACTTGG-3’。
2．花生黑腐病菌快速检测体系的建立：
1）采用NaOH快速裂解法提取花生黑腐病菌的DNA，具体步骤如下：
a. 将花生病茎用清水洗净、晾干；
b. 按1mg病茎加入10µL（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，12000rpm离心5min；
c. 取上清液20µl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合，所得溶液稀释10倍作为LAMP反应的DNA模板。
2）利用所设计的LAMP检测引物进行扩增，LAMP反应体系为25 µl，包括5µM外侧引物TF3和TB3各0.25µl，40µM内侧引物TFIP和TBIP各0.25µl，反应混合液18.0µl，8UBst DNA聚合酶1µl，DNA模板25ng，用灭菌超纯水补足至25 µl；LAMP反应条件为60-63℃温育60min，82℃保温5min；
所述的反应混合液中各组分的浓度为40mM Tris-HCl，20mM (NH4)2SO4，20mM KCl，16 mM MgSO4，0.2% Triton X-100，1.6M Betaine，2.8 mM dNTPs。
3、结果测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，在LAMP反应的最终扩增产物中加入显色剂SYBR green І 1µl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2µl PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
本发明可用于花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）潜伏期、发病期的检测和花生种子的检验检疫。建立针对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）引起病害显症之前的早期监测，及确定病害防治的最佳时期具有重要的意义。
本发明有益效果：
本发明方法适用于花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）感染的植株或发病潜伏期时花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的快速可靠的检测、鉴定，及对花生种子的检验检疫，对于防止农业生产中花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）病害的发生和传播具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
1、特异性强：本发明所设计的LAMP检测引物是针对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的translation elongation factor 1-alpha (tef1)基因序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性强。
2、灵敏度高：本发明所设计出的LAMP引物，对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg。
3、实用性好：本发明所设计出的LAMP引物，可用于花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）感染的植株、发病潜伏期的植株及带菌花生种子高灵敏度快速检测，对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的早期诊断、及时防治和防止病害的传播具有十分重要的意义。
4、操作简便快速：应用本发明检测方法，对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）感染的植株或者发病潜伏期的植株，及带菌的花生种子检测可在3小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。
附图说明
图1为本发明对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的特异性检测结果图，A为琼脂糖凝胶电泳结果，B为荧光染料显色结果。其中：泳道M为2000bp DNA 分子量marker，泳道1为阴性对照，泳道2为花生Calonectria ilicicola，泳道3-11依次为：Calonectria pseudonaviculata，Calonectria ilicicola，Calonectria scoparium，Calonectria henricotiae，Aspergillus niger，Rhizoctonia solani，Rhizopus oryzae，Fusarium solani，Sclerotium rolfsii。
图2为本发明对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的灵敏性检测结果图， A为琼脂糖凝胶电泳结果， B为荧光染料显色结果。其中：泳道M为2000bp DNA分子量marker，泳道1–9为不同浓度的花生Calonectria ilicicola DNA，其浓度依次为10ng/ μl、1ng/ μl、100 pg/ μl、10 pg/ μl、1 pg/ μl、100 fg/ μl、10 fg/ μl、1 fg/ μl和 100ag/ μl泳道10为阴性对照。
图3为本发明对人工接种花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）花生组织的检测结果图， A为琼脂糖凝胶电泳结果， B为荧光染料显色结果。其中：泳道M为2000bp DNA分子量marker，泳道1为阳性对照，泳道2-3为发病植物组织，泳道4-6为发病潜伏期植物组织，泳道7为健康植物组织，泳道8为阴性对照。
图4为本发明对带菌花生种子的检测结果图， A为琼脂糖凝胶电泳结果， B为荧光染料显色结果。其中：泳道M为2000bp DNA分子量marker，泳道1为阳性对照，泳道2-5为带菌花生种子，泳道6为无菌花生种子，泳道7为健康植物组织，泳道8为阴性对照。
具体实施方式
根据花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的translation elongationfactor 1-alpha (tef1)序列设计一种LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物，引物序列如下：
外侧引物TF3：5’-TGACACTGTGCTGACTCTCA-3’；
TB3：5’-GCTGAAGGACAGAAGCTGAG-3’；
内侧引物TFIP：5’-GCTTGTCAAGAACCCAGGCGT-AAACAGGAAGCCGCTGAAC-3’；
TBIP：5’-CCGAGCGTGAGCGTGGTATC-GACGGTGACATCGTACTTGG-3’。
实施例1 本发明对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的特异性检测
1. 花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的LAMP特异性检测
1）以花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）为对象和用筛选获得的LAMP引物对20个供试菌株DNA进行扩增，以健康花生植株DNA为阴性对照，水为空白对照，供试菌株包括丽赤壳属对照菌株4个（C. pseudonaviculata，C. ilicicola，C. scoparium，C. henricotiae）、花生其它病原菌6个（Aspergillus niger，Rhizoctonia solani，Rhizopus oryzae，Fusarium solani，Sclerotium rolfsii，Diplodia gossypina）和不同来源的花生黑腐病菌10个，测定引物的特异性。采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体步骤如下：将花生病茎用清水洗净、晾干；按1mg病茎加入10µl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，12000rpm离心5min；取上清液20µl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合，所得溶液稀释10倍作为LAMP反应的DNA模板；
2）利用所设计的LAMP检测引物进行扩增，LAMP反应体系为25 µl，包括5µM外侧引物TF3和TB3各0.25µl，40µM内侧引物TFIP和TBIP各0.25µl，反应混合液18.0µl，8UBst DNA聚合酶1µl，DNA模板25ng，用灭菌超纯水补足至25 µl；LAMP反应条件为65℃温育60 min，82℃保温10min；
所述的反应混合液中各组分的浓度为40mM Tris-HCl，20mM (NH4)2SO4，20mM KCl，16 mM MgSO4，0.2% Triton X-100，1.6M Betaine，2.8 mM dNTPs；
3）在LAMP反应的最终扩增产物中加入显色剂SYBR green І 1µl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2µl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
2．检测结果
从图1（A）可见，泳道2可观察到花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的特异性绿色荧光；从图1(B)可见泳道2出现LAMP特征性的梯形带，其余25株其他菌株显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳均没有出现扩增条带，说明此引物对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）具有很强的特异性。
实施例2 LAMP引物对花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的灵敏性检测
1．花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的LAMP灵敏性检测
采用10倍浓度系列稀释法将提取的花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）DNA稀释成10ng、1ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1fg 和 100 ag共9个不同浓度梯度。
①按实施例1中的反应体系及条件进行扩增；
②在LAMP反应的最终扩增产物中加入显色剂SYBR green І 1µl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2µl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
2．检测结果：
由图2可见，在泳道1-7上均可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，表明本发明的检测灵敏度可达10fg。
实施例3 本发明对人工接种花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）植物组织的检测
1. 人工接种花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）植物组织的检测
采用浸种法接种花生黑腐病菌。随机选取2株显症植株和3株尚未显症植株进行检测，同时以花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）基因组DNA作为阳性对照，健康花生植株作为阴性对照。采用NaOH快速裂解法提取花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）DNA。
按下述方法进行LAMP检测：
①按实施例1中的反应体系及条件进行扩增；
②在LAMP反应的最终扩增产物中加入显色剂SYBR green І 1µl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2µl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
2．检测结果
由图3可见，泳道2-6均可观察到绿色荧光及LAMP特征性的梯形带，健康组织和阴性对照的显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳均无扩增条带出现。表明本发明可用于花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）潜伏期或者感病初期时的病害检测。
实施例4 本发明对花生种子黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的检测
1. 花生种子黑腐病菌（Calonectria ilicicola）的检测
收集广东省、福建省花生种子18份进行检测，同时以花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola）基因组DNA作为阳性对照，健康花生植株作为阴性对照。采用NaOH快速裂解法提取花生黑腐病菌（Calonectria ilicicola） DNA。
按下述方法进行LAMP检测：
①按实施例1中的反应体系及条件进行扩增；
②在LAMP反应的最终扩增产物中加入显色剂SYBR green І 1µl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2µl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
2．检测结果
由图4可见，泳道2-5均可观察到绿色荧光及LAMP特征性的梯形带，无菌花生种子、健康组织和阴性对照的显色结果为橙色，琼脂糖凝胶电泳均无扩增条带出现。表明本发明可用于检测花生种子的是否带菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院植物保护研究所
<120> 用于检测花生黑腐病菌的LAMP检测引物及其检测方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgacactgtg ctgactctca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgaaggac agaagctgag 20
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcttgtcaag aacccaggcg taaacaggaa gccgctgaac 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgagcgtga gcgtggtatc gacggtgaca tcgtacttgg 40

Claims (2)

1.用于检测花生黑腐病菌的LAMP检测引物，其特征在于：所述LAMP检测引物，包括一对外引物和一对内引物；
外侧引物：
TF3：TGACACTGTGCTGACTCTCA，
TB3：GCTGAAGGACAGAAGCTGAG；
内侧引物：
TFIP：GCTTGTCAAGAACCCAGGCGT-AAACAGGAAGCCGCTGAAC，
TBIP：CCGAGCGTGAGCGTGGTATC-GACGGTGACATCGTACTTGG。
2.利用权利要求1所述的LAMP检测引物用于检测花生黑腐病菌的方法，其特征在于：利用所述LAMP检测引物进行扩增，LAMP反应体系为25µl，包括5µM外侧引物TF3和TB3各0.25µl，40µM内侧引物TFIP和TBIP各0.25µl，反应混合液18.0µl，8UBst DNA 聚合酶1µl，DNA模板25ng，用灭菌超纯水补足至25 µl；LAMP反应条件为60-63℃温育60 min，82℃保温5min；所述的反应混合液中各组分的浓度为40mM Tris-HCl，20mM (NH4)2SO4，20mM KCl，16mMMgSO4，0.2% Triton X-100，1.6M Betaine，2.8 mM dNTPs；
在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green І 1µl，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；取2µl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。
CN202010146746.9A 2020-03-05 2020-03-05 用于检测花生黑腐病菌的lamp检测引物及其检测方法 Active CN111088392B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010146746.9A CN111088392B (zh) 2020-03-05 2020-03-05 用于检测花生黑腐病菌的lamp检测引物及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010146746.9A CN111088392B (zh) 2020-03-05 2020-03-05 用于检测花生黑腐病菌的lamp检测引物及其检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111088392A CN111088392A (zh) 2020-05-01
CN111088392B true CN111088392B (zh) 2022-11-22

Family

ID=70398868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010146746.9A Active CN111088392B (zh) 2020-03-05 2020-03-05 用于检测花生黑腐病菌的lamp检测引物及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111088392B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112143825B (zh) * 2020-09-28 2021-08-03 华南农业大学 一种区分检测花生黑腐病菌和花生基腐病菌的双重pcr检测引物及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4806749B2 (ja) * 2005-11-07 2011-11-02 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 Ｌａｍｐ法を用いた百日咳菌遺伝子検出方法およびこの方法に用いるプライマーセット
CN103614474B (zh) * 2013-11-27 2015-06-17 福建省农业科学院植物保护研究所 花生青枯病菌环介导等温扩增检测引物及检测方法
CN107723381A (zh) * 2017-11-30 2018-02-23 福建省农业科学院植物保护研究所 香蕉冠腐病菌lamp检测引物及其检测方法
CN109280715B (zh) * 2018-07-31 2022-02-08 仲恺农业工程学院 一种检测花生黑腐病菌的lamp引物组及其快速检测方法和试剂盒
CN109609683A (zh) * 2019-01-25 2019-04-12 福建省农业科学院果树研究所 一种检测橄榄组织中胶孢炭疽菌的lamp检测引物

Also Published As

Publication number Publication date
CN111088392A (zh) 2020-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106987653B (zh) 一种马铃薯晚疫病菌lamp检测引物及其可视化检测方法
CN108676910A (zh) 一种层出镰刀菌的lamp检测引物及其应用
CN108220474A (zh) 一种禾谷镰刀菌的lamp检测引物及其应用
Zhou et al. Development of a loop‐mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Venturia carpophila on peach
CN109652586A (zh) 一种鉴别四种镰刀菌的方法
CN108796118B (zh) 一种马铃薯早疫病菌环介导扩增检测引物及其检测方法
CN111088392B (zh) 用于检测花生黑腐病菌的lamp检测引物及其检测方法
CN106755339B (zh) 黄瓜炭疽病菌lamp检测引物及其应用
CN104745698A (zh) 瓜类蔓枯病菌的环介导等温扩增引物组合物
Shu et al. Detection and control of Pantoea agglomerans causing plum bacterial shot-hole disease by loop-mediated isothermal amplification technique
KR101642772B1 (ko) 고추 탄저병 검출용 조성물 및 이를 이용한 고추 탄저병 검출 방법
CN103614474A (zh) 花生青枯病菌环介导等温扩增检测引物及检测方法
CN103436623A (zh) 一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法
CN104293957B (zh) 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法
CN103451294B (zh) 黄曲霉菌lamp检测引物及其可视化检测方法
CN116334275A (zh) 桃疮痂病菌MBCs杀菌剂抗药性快速检测试剂
CN106701976B (zh) 一种鸡常见细菌病的病原多重pcr检测试剂盒
KR101836741B1 (ko) 잿빛곰팡이병균 진단 방법
CN105219868A (zh) 金线莲炭疽病lamp检测引物及其可视化检测方法
Raj et al. A highly sensitive nested-PCR method using a single closed tube for the detection of Colletotrichum gloeosporioides causing greater yam anthracnose
CN104195254A (zh) 基于环介导等温扩增技术检测木贼镰孢菌的方法和引物组合物
KR101385200B1 (ko) 종특이적 프라이머를 포함하는 병진단 키트와 이를 이용한 인삼뿌리썩음병균의 검출 및 병진단 기술
CN105349541A (zh) 用于检测唐菖蒲伯克霍尔德菌的实时荧光pcr引物和探针
CN111485014A (zh) 一种检测大肠杆菌活菌的方法
CN114395617A (zh) 一种草莓白粉病菌lamp可视化快速检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant