CN104293957B - 一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法 - Google Patents

一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其步骤：（1）运用2对特异性引物对待鉴定菌株的基因组DNA进行LAMP扩增，所述的2对特异性引物的序列是：BC‑F3；BC‑B3；BC‑FIP；BC‑BIP；（2）利用上述引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，取琼脂糖凝胶电泳分析或用染料法进行观察；（3）进行结果判断，观察电泳结果是否有梯形条带出现或加入染料后产物是否为绿色，如果有梯形条带出现或产物为绿色，说明DNA来源为灰葡萄孢，如果没有梯形条带出现或产物不变色，说明DNA来源不是灰葡萄孢。实现了对灰霉病发病早期的快速检测，准确的预测预报。检测灰霉病，具有操作简单易行、耗时短、灵敏度高、特异性强，结果判断简单可靠，具有广泛的实际应用价值。

Description

一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法
技术领域
本发明属于植物病害的分子检测领域，具体涉及一种灰葡萄孢的早期快速分子的检测方法，可用于植物灰霉病的早期快速诊断及流行预测。
背景技术
由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一种在全世界广泛分布的重要植物病害。它可以侵染包括茄科、豆科和蔷薇科等数百种植物，在多种蔬菜的生产种植过程中也常造成严重的危害，可使蔬菜的产量减少20%以上，严重时可达60%以上。随着作物种植面积的不断增加，塑料大棚的使用也越来越多，而在大棚中灰葡萄孢的生长繁殖速度更快，这导致灰霉病的发生更加严重，而且灰霉病一旦发生，可迅速产生大量的分生孢子进行传播扩散，难以有效防治，从而造成更大的经济损失。因此灰霉病是限制多种作物和蔬菜品质和产量提高的主要因素之一。
对于多种植物病害来说，在病害发生的早期进行针对性防治效果较好，因此针对特定病害发展快速特异的早期分子检测手段至关重要。这种早期检测技术有基于PCR的快速检测技术，也有基于环介导恒温扩增技术（LAMP）而建立起来的快速特异检测技术，LAMP技术的引物设计比普通PCR要复杂得多，它是针对目标基因的6个不同区域设计出来4条特异性引物，其中包括一对外引物及一对内引物，但LAMP技术相对于PCR技术具有灵敏度高和特异性强的特点；LAMP技术对扩增设备要求简单、反应时间短，通常在60分钟内可完成整个扩增反应，反应过程中不需要专业的 PCR仪，只需要简单的水浴锅即可，易于农户操作，而且扩增所需费用低；同时LAMP的扩增结果通过添加燃料的方法可直接用肉眼观察，方便快捷。目前对于大多数的重要植物病害均开发出了一些基于PCR或LAMP的早期分子检测技术，其中也包括针对灰葡萄孢的早期检测技术。但对于已报道的检测技术来说，基于PCR技术设计的灰葡萄孢检测方法灵敏度有限，可检测的DNA为微克级，而基于LAMP技术的灰葡萄孢检测方法灵敏度虽可达纳克级，但并未对葡萄孢属其它种及其近缘属进行特异性检测区分。而已有报道显示葡萄孢属真菌包括灰葡萄孢、蚕豆葡萄孢、拟蚕豆葡萄孢等多个种的病原真菌，在田间这些病原菌并不能有效进行区分，从而延误病害的有效防治，因此需要借助特异性强、灵敏度高且简单易行的检测技术进行早期的检测区分。
本发明依据华中农业大学李国庆课题组通过RAPD方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段进行LAMP的引物设计，发明了可用于科学研究及田间实践灰葡萄孢分子检测方法。利用本发明进行灰葡萄孢的早期检测，具有操作简单易行、耗时短、灵敏度高、特异性强，结果判断简单可靠的特点，具有广泛的实际应用价值，将其应用于灰霉病病的预测预报中，必将有利于田间灰霉病的综合管理，促进多种作物的增产增收。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种田间灰霉病发病早期的快速分子的检测方法，实现了对灰霉病发病早期的快速检测，为灰霉病的田间综合管理提供了科学、准确的预测预报。检测灰霉病，具有操作简单易行、耗时短、灵敏度高、特异性强，结果判断简单可靠的特点，具有广泛的实际应用价值。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
一种灰葡萄孢的早期快速分子的检测方法，其步骤是：
1.依据华中农业大学李国庆课题组通过RAPD方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段为靶标，利用在线软件Primer Explorer 5.0设计LAMP引物，每一组LAMP引物包括两条外引物（F3，B3），上游内引物（FIP），下游内引物（BIP）。本发明使用的引物序列如下：
BC-F3：5’-AATGATCGCCTACACAGC-3’
BC-B3：5’-AGCTACCACCGAGAACAA-3’
BC-FIP：5’-TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG-3
BC-BIP：5’-TTAAGTGACACTTGATGAACGGATCGTTTTATAATCACGAATATGACAG-3’
利用该引物在恒温（64℃）条件下，进行LAMP扩增，反应体系及程序如下：
表1. LAMP 的反应体系（25μL）
成分 体积
10×ThermoPol Bufer 2.5 μL
dNTPs (10 mmol/L) 4.0 μL
6.0 μL
F3 (10 μmol/L) 0.5 μL
B3 (10 μmol/L) 0.5 μL
FIP (10 μmol/L) 3.5 μL
BIP (10 μmol/L) 3.5 μL
DNA模板 1.0 μL
Bst DNA聚合酶（8 U/μL） 1.0 μL
2.5 μL
反应程序为：64℃ 45 min，85℃ 5 min。
2.利用步骤（1）的引物在恒温（64℃）条件下，进行LAMP扩增，取5 μL产物于2.0％（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳分析，进行结果判断，观察电泳结果是否有梯形条带出现，有梯形条带出现，DNA来源为灰葡萄孢，没有梯形条带出现，说明DNA来源不是灰葡萄孢。
3.或用染料法进行观察，在扩增产物中加入1 μL 10%（质量体积比）的SYBR GreenI核酸染料（购买自Invitrogen公司），混匀后进行结果判断，观察加入染料后产物是否变色，产物为绿色，DNA来源为灰葡萄孢，产物不变色，说明DNA来源不是灰葡萄孢。
本发明设计了一套灰葡萄孢特异性引物，并成功建立了一种可用于灰霉病病发病早期的快速检测方法。与其它检测方法相比，本发明具有如下优点：
1．特异性强，本发明中设计的特异性引物不仅可以区分属于亲缘关系较远的不同属的常见植物叶部病原真菌，而且可以区分与灰葡萄孢同属于子囊菌亚门、盘菌纲、柔膜菌目的病原真菌核盘菌，并且可以区分葡萄孢属的多个种的真菌，参见附图1。
2．灵敏度高，采用本发明优化的技术体系，可以检测下限至10 fg的灰葡萄孢菌DNA，而已报道的两种灰葡萄孢快速检测方法的下限分别为0.4ug和1pg，灵敏度大大提高。
3．采用本发明方法检测十分快速，1-2小时内即可得到准确的检测结果，并可以实时跟踪病害的发生发展情况，并进行及时的预测预报。而传统的微生物学检测则至少需要2天至1个星期以上。
4. 操作简单，本发明方法不需要复杂的仪器，只需要简单的水浴恒温设备，通过染料进行染色肉眼即可进行观察结果进行准确判断。
附图说明
图1为一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法对灰葡萄孢、其它葡萄孢属真菌及核盘菌分离物总DNA的检测结果示意图。
A为用染料法进行观察，从1-12分别为以灰葡萄孢菌株B05.10、Bc-1、CanBc-3v及BC-Red、核盘菌1980菌株、葡萄孢属其它种菌株B.fabiopsis、B.fabae、B.sinoallii、B.squamosa、B.aclada、B.porri和B.byssoidea的基因组DNA为模版进行LAMP检测，结果可见只有1-4来自灰葡萄孢菌株的样品检测可见产物为绿色，其它来源样品DNA检测结果均未变色；
B为用电泳法进行观察，M为分子量标记Marker，泳道1-12分别为以灰葡萄孢菌株B05.10、Bc-1、CanBc-3v及BC-Red、核盘菌1980菌株、葡萄孢属其它种菌株B.fabiopsis、B.fabae、B.sinoallii、B.squamosa、B.aclada、B.porri和B.byssoidea的基因组DNA为模版进行LAMP检测后产物电泳，结果可见只有1-4来自灰葡萄孢菌株的样品可检测到梯度条带的出现，其它来源样品DNA检测结果均为空白。
上述结果说明本发明方法可特异检测灰葡萄孢菌株。
图2为一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法（LAMP）对灰葡萄孢不同浓度DNA的检测结果示意图。
A为用染料法进行观察，B为用电泳法进行观察，M为分子量标记Marker，从1-10分别为以灰葡萄孢菌株不同浓度DNA（10μg/μL、1μg/μL、100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL）为模板进行的LAMP检测结果，结果可见不同浓度的样品检测均可见产物为绿色，并且电泳结果显示可检测到梯度条带的出现，结果说明本发明的LAMP方法灵敏度极高。
图3为一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法（LAMP）对灰葡萄孢不同浓度孢子接种番茄叶片后的检测结果示意图。
A为用染料法进行观察，B为用电泳法进行观察，M为分子量标记Marker，从1-6分别为以灰葡萄孢菌株B05.10不同浓度孢子（约为6×106个/mL、6×105个/mL、6×104个/mL、6×103个/mL、6×102个/mL、6×101个/mL）取10μL接种番茄叶片，接种后立即提取叶片DNA为模板进行的LAMP检测，7为B05.10的DNA，作为阳性对照，8为接种10μL的清水对照。结果可见当接种浓度低达6×102个/mL时仍然可见产物为绿色，并且电泳结果显示可检测到梯度条带的出现，说明本发明的LAMP方法可检测到寄主叶片上浓度极低的灰葡萄孢孢子，可用于灰霉病发生的早期检测及预测预报。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但不是对本发明的限制。下列实施例中为注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件进行。
实施例1：
一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其步骤是：
A、依据华中农业大学李国庆课题组通过RAPD方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段为靶标，利用在线软件Primer Explorer 5.0设计LAMP引物，每一组LAMP引物包括两条外引物（F3，B3），上游内引物（FIP），下游内引物（BIP）。本发明使用的引物序列如下：
BC-F3：5’-AATGATCGCCTACACAGC-3’
BC-B3：5’-AGCTACCACCGAGAACAA-3’
BC-FIP：5’-TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG-3
BC-BIP：5’-TTAAGTGACACTTGATGAACGGATCGTTTTATAATCACGAATATGACAG-3’
利用该引物在恒温(64℃)条件下，进行LAMP扩增，首先我们以灰葡萄孢的DNA为模板，对体系中的甜菜碱、dNTP、Mg2+、扩增时间和反应温度等反应条件进行优化，以确定LAMP检测的最佳扩增体系。试验设置甜菜碱浓度为 0~2.5 mM，依次增加0.5 mM，共6个梯度；Mg2+浓度为2~8 mM，依次增加2 mM，共设置4个梯度；dNTPs浓度为0.8~3.2 mM，依次增加0.8 mM，共设置4个梯度；反应温度为60~65℃，依次增加1℃，共设置6个梯度；反应时间为30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，设置5个梯度。
B、取5 μL产物于2.0％（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳分析，观察是否有梯形条带出现。如果有梯形条带出现，说明DNA来源为灰葡萄孢，如果没有梯形条带出现，说明DNA来源不是灰葡萄孢。
C、也可以用染料法进行观察，在将扩增产物中加入1 μL 10%（质量体积比）的SYBRGreen I核酸染料，混匀后观察颜色变化。如果产物颜色变为绿色，说明DNA来源为灰葡萄孢，如果没有颜色变化，说明DNA来源不是灰葡萄孢。
经过优化，最终确定反应的最适宜温度为64℃，体系中添加1.6 mM的dNTPs，6 mM的Mg2+，不添加甜菜碱，其它成分添加浓度见表1。反应程序为：64℃ 45 min，85℃ 5 min。具体反应体系及程序如下：
表1. LAMP 的反应体系（25μL）
成分 体积
10×ThermoPol Bufer 2.5 μL
dNTPs (10 mmol/L) 4.0 μL
6.0 μL
F3 (10 μmol/L) 0.5 μL
B3 (10 μmol/L) 0.5 μL
FIP (10 μmol/L) 3.5 μL
BIP (10 μmol/L) 3.5 μL
DNA模板 1.0 μL
Bst DNA聚合酶（8 U/μL） 1.0 μL
2.5 μL
反应程序为：64℃ 45 min，85℃ 5 min。
实施例2：
本发明LAMP技术对灰葡萄孢的特异性试验：
1．真菌分离物及真菌菌丝的培养
试验以灰葡萄孢（B. cinerea）的4个菌株B05.10、Bc-1、CanBc-3v、BC-Red，葡萄孢属的拟蚕豆葡萄孢（B. fabiopsis）、蚕豆葡萄孢（B. fabae）、中国葱葡萄孢（B. sinoallii）、葱鳞葡萄孢菌（B. squamosa）、葱腐葡萄孢（B. aclada）、大蒜盲种葡萄孢（B. porri）、葱细丝葡萄孢（B. byssoidea）以及核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）为研究对象进行LAMP 检测。本发明所用葡萄孢属菌株分离及鉴定办法请参考文献（张静，湖北省灰霉病病菌区系和灰葡萄孢多样性研究，华中农业大学，博士学位论文，2010），所有菌株来源于华中农业大学农业微生物国家重点实验室植物病原真菌姜道宏课题组及李国庆课题组。
将真菌分离物接种于PDA培养基上，20℃培养，活化2-3次。再用直径为5mm的打孔器打出含菌丝的琼脂块，接种于铺玻璃纸的PDA平板上，48h后刮取适量菌丝于-20℃冻存。
2．提取真菌分离物总DNA
参考 Sambrook等（Sambrook, J., Frisch, E.F., Maniatis, T., MolecularCloning: A Laboratory Manual, second ed. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY），具体步骤如下：称取0.2 g 于-20℃中冷冻的真菌菌丝在液氮中充分研磨成粉末，转入1 ml 65℃预热的抽提缓冲液，颠倒混匀；65℃温育5 min，中间轻轻混匀两次；加入等体积氯仿／苯酚（v/v = 1/1）混匀，12,000 rpm离心15 min；取上清，再加入等体积氯仿／苯酚（v/v = 1/1）再抽提一次；取上清，加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，于室温（20－25℃）下静置沉淀30 min；12,000 rpm离心10 min，弃上清，再用-20℃预冷的70%（质量体积比）乙醇洗两遍，置37℃温箱干燥后，用TE溶解，得到真菌的总DNA，-20℃保存。
3．LAMP检测
将步骤2中得到的总DNA提取液用ddH2O稀释10倍，用于LAMP检测，LAMP检测的体系及反应条件参考优化的结果进行。结果观察用电泳观察法及染料染色法2种方法进行：取5μL产物于2.0％（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳分析，观察是否有梯形条带出现。在将扩增产物中加入1 μL 10%（质量体积比）的SYBR Green I核酸染料，混匀后观察颜色是否变化为绿色。
从电泳及染色结果观察，在经过LAMP检测后，只有以灰葡萄孢菌株的DNA为模板的LAMP扩增才能扩增出阶梯状条带，而以其他灰霉菌DNA及核盘菌DAN为模板时均不能扩增出阶梯状条带。同样也只有以灰葡萄孢菌株的DNA为模板的LAMP扩增产物在加入核酸染料后才可观察到绿色的颜色变化出现（图1）。
其中：
步骤1所述的PDA培养基配方及其制作方法：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20g和少量蒸馏水煮制，补充蒸馏水至1000 ml进行灭菌备用；
步骤2所述的抽提缓冲液成分：2%十六烷基三乙基溴化铵 (w/v)，2%聚乙烯吡咯烷酮 (w/v)，1.4 M 氯化钠，0.1 M 三羟甲基氨甲烷-盐酸（Tris-HCl，pH8.0），0.02M乙二胺四乙酸（EDTA）；
步骤3所述的SYBR Green I核酸染料购自Invitrogen公司，下同。
实施例3：
本发明的LAMP技术对灰葡萄孢的灵敏度试验：
1．灰葡萄孢菌株B05.10菌丝的培养
将灰葡萄孢菌株B05.10菌丝接种于PDA培养基（配方参见前述《发明内容》和具体实施例2中所示）上，20℃培养，活化2-3次。再用直径为5mm的打孔器打出含菌丝的琼脂块，接种于铺玻璃纸的PDA（配方如前所述）平板上，24h后刮取1mg菌丝于-20℃冷冻。
2．灰葡萄孢菌株B05.10菌丝DNA的提取
用CTAB法提取B05.10菌株的DNA，用紫外分光光度计测量灰葡萄孢菌株B05.10总DNA的浓度：
（1）取10 µl步骤所提取的灰葡萄孢菌株B05.10总DNA，用ddH2O稀释50倍；
（2）用ddH2O作为空白，在波长260 nm、280 nm、310 nm处调节分光光度计读数为零；
（3）加入DNA稀释液于三处波长处读OD值，并记录；
（4）计算DNA浓度，公式如下：
[dsDNA]=50×(OD260－OD310)×稀释倍数（以上浓度单位为μg/ml）
3．灰葡萄孢菌的LAMP检测
通过上述试验获得初始浓度为10μg/μL的DNA模板，按照10倍浓度进行梯度稀释（1、101、102、103、104、105、106、 107、108、109），获得不同浓度的DNA（10μg/μL、1μg/μL、100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL）作为检测模板，用LAMP方法进行扩增。试验结果显示，当B05.10的DNA稀释109倍时，LAMP扩增仍可检测到产物，在电泳检测中可见梯度产物，加入核酸染料后可见反应产物为绿色（图2），结果表明法可以检测到低达10fg的DNA，说明本发明针对灰葡萄孢菌的LAMP检测体系具有极高的灵敏度。
实施例4：
本发明的LAMP技术对寄主叶片上的少量孢子进行快速检测：
1.灰葡萄孢菌株B05.10孢子的收集
将灰葡萄孢菌株B05.10菌丝接种于PDA培养基（配方参见前述《发明内容》和具体实施例2中所示）上，20℃培养，活化2-3次。再用直径为5mm的打孔器打出含菌丝的琼脂块，接种于铺玻璃纸的PDA（配方如前所述）平板上，20℃黑暗条件下培养7 d，每皿中加入5 mL的无菌水，重复用无菌水充分冲洗培养皿中的孢子，并用刮铲刮洗孢子，使孢子尽量散到水中，同时用四层擦镜纸滤去菌丝碎片。将孢子液转移至10 mL灭菌试管中充分混匀，然后在每管中取少量的孢子液于血球计数板上，在显微镜下计数。获得浓度约为6.0×106个/mL的孢子液。
2.灰葡萄孢菌孢子接种寄主番茄的叶片
将上述孢子夜按照10倍的浓度梯度进行稀释，共设置6个浓度梯度（约为6×106个/mL、6×105个/mL、6×104个/mL、6×103个/mL、6×102个/mL、6×101个/mL），用移液枪分别移取10 μL每个浓度的孢子液，接种到新鲜健康的番茄叶片上。
3.LAMP检测
在接种灰葡萄孢菌孢子液后立即用CTAB法提取接种后的番茄叶片的DNA，提取的DNA作为检测模板，用LAMP方法进行扩增。试验结果显示，当叶片接种的孢子液浓度为6×102个/mL时，用LAMP扩增体系仍可得到特异性扩增的梯度条带，核酸染料染色也可见到绿色的产物（图3），结果进一步说明本发明所建立的LAMP扩增体系的灵敏度非常高，可以检测到几个孢子在寄主叶片上的存在，因此可以用于田间灰霉病发生的早期特异性检测，从而进行精准的灰霉病流行的预测预报。

Claims (2)

1.一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其步骤是：
(1)通过RAPD方法扩增获得的灰葡萄孢特异性片段为靶标，利用在线软件PrimerExplorer 5.0设计LAMP引物，每一组LAMP引物包括两条外引物F3，B3，上游内引物FIP，下游内引物BIP，所述的2对特异性引物的序列分别是：
BC-F3：5’-AATGATCGCCTACACAGC-3’
BC-B3：5’-AGCTACCACCGAGAACAA-3’
BC-FIP：5’-TCCCCTTAATAAATGTGATAGGCACCTGAACCGAAAGATTGAAAAGG-3
BC-BIP：5’-TTAAGTGACACTTGATGAACGGATCGTTTTATAATCACGAATATGACAG-3’；
(2)利用步骤(1)的引物在恒温条件下，进行LAMP扩增，取5μL产物于2.0％质量体积比的琼脂糖凝胶电泳分析或用染料法进行观察；
(3)进行结果判断，观察电泳结果是否有梯形条带出现或加入染料后产物是否为绿色，有梯形条带出现或产物为绿色，DNA来源为灰葡萄孢，没有梯形条带出现或产物不变色，DNA来源不是灰葡萄孢。
2.根据权利要求1所述的一种灰葡萄孢的早期快速分子检测方法，其特征在于，所述的LAMP反应体系及条件是：
25μL的LAMP的反应体系：
反应程序为：64℃45min，85℃5min。
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