CN109234436A - 一种基于lamp方法的灰霉病菌快速痕量检测试剂、方法及应用 - Google Patents
一种基于lamp方法的灰霉病菌快速痕量检测试剂、方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于LAMP方法的灰霉病菌快速痕量检测试剂、方法及应用，采用特定的引物组合，该引物组合是根据灰霉病菌Lac1基因序列设计的可专化性扩增灰霉病菌基因组DNA的特异引物，对其它常见病原真菌无扩增条带。该检测反应的最优条件为63℃下反应40 min，在此反应条件下可检测到的灰霉病菌DNA量可达pg级，该方法可以用于灰霉病菌的快速痕量检测。
Description
技术领域
本发明涉及植物病原菌快速检测技术，属于植物保护学科中的病害预测预报研究与应用领域，具体涉及一种基于LAMP方法的灰霉病菌快速痕量检测试剂、方法及应用。
背景技术
灰葡萄孢可引起蔬菜、果树及花卉等多种植物的灰霉病，在保护地果蔬生产中尤为突出，常造成植物茎、叶、花、果受害，对产量和品质均可造成严重影响。在田间，灰霉病爆发性强，若不能适时有效的施用化学农药，不仅难以控制病害的发生，还会因大量频繁的使用化学农药而使病原菌产生抗药性，并导致农药残留和对环境的污染。对病原菌的快速检测，并据此对病害进行精准预报是适时施药和有效控病的基础。已有的病害预测预报方式主要在病害发生后，靠专家在田间根据病害症状作系统的大面积调查，然后再依据经验发表病害情报，不仅费时费力，且因多为病害发生到一定面积后才用药，往往错过了防治适期，从而导致过迟施药现象，防病效果并不理想。因此，发展快速实时的病原菌检测方法，对指导农民用药，有效控制病害具有重要意义。
LAMP技术是特定的针对病原物靶基因的某区域设计特异引物，在DNA聚合酶的作用下，特异、痕量检测样品中的DNA。该方法操作简单、特异性强、产物易检测，且不需要昂贵的试剂和精密高质的仪器，在作物病原菌检测和病害早期预警上有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速痕量检测作物组织中灰霉病菌带菌率与带菌量的试剂、方法及应用。本发明中，基于灰霉病菌Lac1基因序列利用在线软件PrimerExplorer V设计的引物组具有特异高效扩增灰霉病菌的特性，可检测未显症作物组织的带菌率，可为灰霉病的适时预警和科学防治提供依据。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：本发明公开了一组灰霉病菌LAMP检测引物，该组引物组成如下：
BcF3-14：5′-GCCAACTACGATGTTGATCT-3′；
BcB3-14：5′-ACCATCAACAGCTGTGTT-3′；
BcFIP-14：5′-GGTGCTCCAGTCTTTGCTTTAT-GTTCTTGAATGACTGGAACC-3′；
BcBIP-14：5′-ATGGAGCTGGCAAAAAGTTTCA-CACTCTGATGCGGTACTTCA-3′。
BcF2-14：5′-GTTCTTGAATGACTGGAACC-3′(SEQ ID No.121)；
BcF1c-14：5′-GGTGCTCCAGTCTTTGCTTTAT-3′(SEQ ID No.122)；
BcB2-14：5′-CACTCTGATGCGGTACTTCA-3′(SEQ ID No.123)；
BcB1c-14：5′-ATGGAGCTGGCAAAAAGTTTCA-3′(SEQ ID No.124)。
本发明所述引物组能特异痕量检测灰霉病菌基因组DNA。
本发明还公开了上述引物组在灰霉病菌快速痕量检测上的应用。
本发明还公开了一种灰霉病菌LAMP检测方法。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：引物组合是根据灰霉病菌Lac1基因序列设计的可专化性扩增灰霉病菌基因组DNA的特异引物，对其它常见病原真菌无扩增条带。该检测反应的最优条件为63℃下反应40min，在此反应条件下可检测到的灰霉病菌DNA量可达pg级，说明该方法可以用于灰霉病菌的快速痕量检测。
附图说明
图1不同BtF3/BtB3引物对扩增灰霉病菌DNA产物电泳图；
图2qPCR方法检测引物对的灵敏度；
图3qPCR方法检测引物对的专化性；
图4LAMP方法检测引物组的专化性；
图5LAMP方法检测灰霉病菌DNA的灵敏度；
图6LAMP方法下不同时间的显色反应。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
1、特异性引物的设计与筛选
(1)根据灰霉病菌Lac1基因序列(登录号：U20192.1)，利用在线软件PrimerExplorer V设计LAMP检测引物组，选择其中30对BcB3/BcF3引物进行特异性测定(表1)。
表1据灰霉病菌Lac1基因序列设计的部分LAMP引物组
从左至右、从上至下为SEQ ID No.1-120。例如，引物组合01的序列从左至右依次为SEQ ID No.1-4。
(2)用30对BcF3/BcB3引物对灰霉病菌基因组DNA进行PCR扩增，共有17对引物可以从灰霉病菌中扩增出单一条带，扩增条带大小与预计值一致且扩增效果较好的有第12对(BcF3-12/BcB3-12)、第13对(BcF3-13/BcB3-13)、第14对(BcF3-14/BcB3-14)和第21对(BcF3-21/BcB3-21)引物(图1)。
2、特异性测定
(1)qPCR结果表明，按实验室常规方法提取的草莓灰霉病菌DNA，利用引物对BcF3-14/BcB3-14在进行34个循环左右就可以检测到(图2)。
(2)通过qPCR方法，用草莓其它常见病原菌如草莓炭疽病菌、草莓枯萎病菌、草莓疫病菌、腐生的链格孢菌和健康草莓植株DNA等来检测引物对BcF3-14/BcB3-14的专化性发现，引物对BcF3-14/BcB3-14只能对草莓灰霉病菌DNA进行扩增，其它几种真菌菌和草莓植株样品检测均表现阴性，说明引物对BcF3-14/BcB3-14可以用来进行草莓灰霉病菌DNA的特异性检测(图3)。
(3)用引物组14(BcF3-14/BcFIP-14/BcBIP-14/BcB3-14)进行LAMP检测，加入草莓灰霉病菌DNA的PCR管呈现绿色(阳性)，而加入其它病菌和草莓DNA的PCR管显褐色(阴性)(图4)。
FIP和BIP是Primerexplorer中对引物的特定命名，FIP为引物F1c和F2序列的结合，BIP是B1c和B2序列的结合。F1c是F1的互补序列，B1c为B1的互补序列。所以依据表1，BcFIP-14及BcBIP-14序列如下：
BcFIP-14：5′-GGTGCTCCAGTCTTTGCTTTAT-GTTCTTGAATGACTGGAACC-3′(SEQ IDNo.55)
BcBIP-14：5′-ATGGAGCTGGCAAAAAGTTTCA-CACTCTGATGCGGTACTTCA-3′(SEQ IDNo.56)
3、灵敏度检测
将灰霉病菌基因组DNA进行梯度稀释，浓度分别为0.01pg/μL～100pg/μL，LAMP显色反应结果表明，在1pg/μL浓度下，管里反应液的褐色变浅，至10pg/μL时反应液显示绿色，说明LAMP技术对灰霉病菌的检测灵敏度可达10pg/μL(图5)。
4、反应时间测定
将草莓灰霉病菌基因组DNA稀释至10ng/μL，按LAMP检测试剂盒说明书分别向各管中加入DNA和检测试剂，置于63℃普通水浴锅中，结果发现，仅40min反应管中就出现了绿色阳性反应，说明LAMP检测反应不需要高质仪器且反应时间较短，易于在田间操作(图6)。
反应体系包括：DNA模板2μL、反应液RM(2×)1μL、内引物(FIP\BIP)0.8μL、外引物(F3\B3)0.2μL、Bst聚合酶1.0μL、、加ddH2O至25μL。反应在63℃恒温水浴锅上进行。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种基于LAMP方法的灰霉病菌快速痕量检测试剂、方法及应用
<130> xhx2018103001
<141> 2018-10-30
<160> 124
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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cactctgatg cggtacttca 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
atggagctgg caaaaagttt ca 22
Claims (6)
1.一组灰霉病菌LAMP检测引物，其特征在于，该组引物组成如下：
BcF3-14：5′-GCCAACTACGATGTTGATCT-3′；
BcB3-14：5′-ACCATCAACAGCTGTGTT-3′；
BcFIP-14：5′-GGTGCTCCAGTCTTTGCTTTATGTTCTTGAATGACTGGAACC-3′；
BcBIP-14：5′-ATGGAGCTGGCAAAAAGTTTCACACTCTGATGCGGTACTTCA-3′。
2.一种基于LAMP方法的灰霉病菌快速痕量检测试剂，包括权利要求1所述的灰霉病菌LAMP检测引物。
3. 一种基于LAMP方法的灰霉病菌快速痕量检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的一组灰霉病菌LAMP检测引物对灰霉病菌进行痕量检测，检测时该组灰霉病菌LAMP检测引物、待测DNA、LAMP相应组分混合后60-65 ℃水浴至少40分钟。
4. 根据权利要求3所述的一种基于LAMP方法的灰霉病菌快速痕量检测方法，其特征在于，检测时该组灰霉病菌LAMP检测引物、待测DNA、LAMP相应组分混合后63 ℃水浴40分钟。
5.权利要求1所述的灰霉病菌LAMP检测引物在制备灰霉病菌快速痕量检测试剂或灰霉病菌快速痕量检测中的应用。
6.权利要求2所述的基于LAMP方法的灰霉病菌快速痕量检测试剂在灰霉病菌快速痕量检测上的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
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Family Applications (1)
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