CN106755476A - 用于鉴定六种褐腐病菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定六种褐腐病菌的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。本发明提供的试剂盒，包括Mfc引物探针组合物、Mla引物探针组合物、Mmu引物探针组合物、Mfg引物探针组合物、Myu引物探针组合物和Mpo引物探针组合物。通过实验证明：本发明的试剂盒可以快速准确的鉴定Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis以及Monilia polystroma。本发明的试剂盒不仅能够满足病害防治及口岸检疫部门对褐腐病菌快速、准确鉴定方法和技术的迫切需求，也为病害防治及检验检疫提供技术支持和决策参考，具有重要的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定核果和仁果上六种褐腐病菌的实时荧光PCR检测试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
褐腐病(Brown Rot)是桃、杏、樱桃等核果及苹果、梨等仁果上重要的病害。褐腐病可以危害多种核果仁果植物引起花腐、枝干溃疡、果实腐烂等不同症状，其中危害最严重的是造成产中和产后的果实腐烂。2001年，美国南部的乔治亚州桃上褐腐病大面积发生，造成的直接经济损失达430万美元，由于防治褐腐病购买杀菌剂带来的间接经济损失为150万美元(Phillips,2002)。根据对北京地区桃褐腐病的调查发现，桃褐腐病的发病率为20％，严重时发病率达100％，严重影响果实的食用价值和果农的经济收入(陈笑瑜等，2003)。其它地区也经常报道褐腐病的发生和危害(林永安等，2004；孙宝海，2006；毛立仁等，2007)。
褐腐病的病原菌为链核盘菌属(Monilinia)，分类上属于子囊菌门(Ascomycete)，盘菌纲(Discomycete)，柔膜菌目(Helotiales)，核盘菌科(Sclerotiniaceae)；无性态属于串珠霉属(Monilia)。根据最新的研究进展，目前世界上已经发现了6种褐腐病菌：Monilinia fructicola、Monilinia fructigena、Monilinia laxa、Monilia polystroma、Monilia mumecola以及Monilia yunnanensis。这些褐腐病菌在世界各地的分布不同，M.fructicola主要分布在北美和亚洲地区，仍然是欧州地区的重要检疫对象。M.fructigena主要分布在欧州。M.laxa分布在欧洲、北美洲。在我国，发现了所有世界上已经报道的种类，普遍存在M.yunnanensis，在一些地区发现了M.fructicola、M.polystroma，在局部地区也发现了M.mumecola。M.fructigena和M.laxa仅在新疆的野果林中检测到。因此，一些种群属于国际间或国内地区间的检疫对象。我国是桃、苹果、梨等核果仁果重要的进出口国家，随着各国果品贸易的不断加强，急切需要加强对褐腐病菌的检疫工作。
褐腐病菌的准确检测和鉴定显得尤为重要。几种褐腐病菌的形态特征非常相似，缺少经验时很难准确判断。近年发展起来的分子生物学技术也在褐腐病菌的种类鉴定中得到了广泛应用(Ioos et al.,2000；Hughes,et al.2000；Ma et al.,2003；Cote et al.,2004；Gell et al.,2007)。但根据文献报道以及本研究小组的测试，这些方法都不能用于准确鉴定6种褐腐病菌。在6种褐腐病菌中，M.mumecola与M.laxa最相近，M.yunnanensis与M.polystroma和M.fructigena最相近，在褐腐病菌的鉴定中难以区分。
Real-time PCR方法是近年发展起来可用于快速检测病原菌的分子方法，目前在褐腐病菌的研究中已经开发用于检测Monilinia fructicola、M.laxa等。目前仍然缺少区分6种褐腐病菌的Real-time PCR检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定褐腐病菌。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种用于鉴定或辅助鉴定褐腐病菌的成套引物。
本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定褐腐病菌的成套引物包括Mfc引物探针组合物、Mla引物探针组合物、Mmu引物探针组合物、Mfg引物探针组合物、Myu引物探针组合物和Mpo引物探针组合物；
所述Mfc引物探针组合物由Mfc引物对和Mfc探针组成；所述Mfc引物对由上游引物MfcF和下游引物MfcR组成；所述上游引物MfcF的核苷酸序列为序列表的序列1，所述下游引物MfcR的核苷酸序列为序列表的序列2；所述Mfc探针的核苷酸序列为序列表的序列3；
所述Mla引物探针组合物由Mla引物对和Mla探针组成；所述Mla引物对由上游引物MlaF和下游引物MlaR组成；所述上游引物MlaF的核苷酸序列为序列表的序列4，所述下游引物MlaR的核苷酸序列为序列表的序列5；所述Mla探针的核苷酸序列为序列表的序列6；
所述Mmu引物探针组合物由Mmu引物对和Mmu探针组成；所述Mmu引物对由上游引物MmuF和下游引物MmuR组成；所述上游引物MmuF的核苷酸序列为序列表的序列7，所述下游引物MmuR的核苷酸序列为序列表的序列8；所述Mmu探针的核苷酸序列为序列表的序列9；
所述Mfg引物探针组合物由Mfg引物对和Mfg探针组成；所述Mfg引物对由上游引物MfgF和下游引物MfgR组成；所述上游引物MfgF的核苷酸序列为序列表的序列10，所述下游引物MfgR的核苷酸序列为序列表的序列11；所述Mfg探针的核苷酸序列为序列表的序列12；
所述Myu引物探针组合物由Myu引物对和Myu探针组成；所述Myu引物对由上游引物MyuF和下游引物MyuR组成；所述上游引物MyuF的核苷酸序列为序列表的序列13，所述下游引物MyuR的核苷酸序列为序列表的序列14；所述Myu探针的核苷酸序列为序列表的序列15；
所述Mpo引物探针组合物由Mpo引物对和Mpo探针组成；所述Mpo引物对由上游引物MpoF和下游引物MpoR组成；所述上游引物MpoF的核苷酸序列为序列表的序列16，所述下游引物MpoR的核苷酸序列为序列表的序列17；所述Mpo探针的核苷酸序列为序列表的序列18。
上述成套引物中，
每个所述引物探针组合物中的上游引物和下游引物的摩尔比均为1：1。
上述成套引物中，
在所述探针的5’末端均修饰荧光基团FAM；
在所述Mfc探针的3’末端修饰荧光基团BHQ；
在所述Mla探针、所述Mfg探针、所述Myu探针、所述Mmu探针和所述Mpo探针的3’末端均修饰荧光基团MGB。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了一种用于鉴定或辅助鉴定褐腐病菌的实时荧光PCR试剂。
本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定褐腐病菌的实时荧光PCR试剂包括上述成套引物。
上述实时荧光PCR试剂中，
每个所述引物探针组合物中的两条引物在所述实时荧光PCR试剂中的终浓度均为0.5μM。
上述实时荧光PCR试剂中，
所述Mfc探针在所述实时荧光PCR试剂中的最佳浓度为0.2μM；
所述Mla探针在所述实时荧光PCR试剂中的最佳浓度为0.8μM；
所述Mmu探针在所述实时荧光PCR试剂中的最佳浓度为1μM；
所述Mfg探针在所述实时荧光PCR试剂中的最佳浓度为0.5μM；
所述Myu探针在所述实时荧光PCR试剂中的最佳浓度为0.8μM；
所述Mpo探针在所述实时荧光PCR试剂中的最佳浓度为1μM。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种用于鉴定或辅助鉴定褐腐病菌的试剂盒。
本发明提供的用于鉴定或辅助鉴定褐腐病菌的试剂盒包括上述成套引物或上述实时荧光PCR试剂。
上述试剂盒中，每种引物探针组合物均单独包装，每种引物探针组合物中的引物和探针均单独包装。
上述试剂盒还可包括实时荧光PCR反应缓冲液、热启动DNA聚合酶和dNTP。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述成套引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述成套引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒在如下(1)-(10)中任一种中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Moniliamumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和/或Monilia polystroma；
(2)制备鉴定或辅助鉴定Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Moniliamumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和/或Monilia polystroma的产品；
(3)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为褐腐病菌；
(4)制备鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为褐腐病菌的产品；
(5)鉴定或辅助鉴定待测菌株为褐腐病菌中的哪一种；
(6)制备鉴定或辅助鉴定待测菌株为褐腐病菌中的哪一种的产品；
(7)检测或辅助检测待测样品是否感染褐腐病菌；
(8)制备检测或辅助检测待测样品是否感染褐腐病菌的产品；
(9)区分或辅助区分Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Moniliamumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和Monilia polystroma；
(10)制备区分或辅助区分Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Moniliamumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和Monilia polystroma的产品。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为褐腐病菌的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为褐腐病菌的方法包括以下步骤：
以待测菌株的基因组DNA为模板，分别采用上述成套引物中的所述Mfc引物探针组合物、所述Mla引物探针组合物、所述Mmu引物探针组合物、所述Mfg引物探针组合物、所述Myu引物探针组合物和所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR；
若实时荧光PCR满足如下1)-6)中的至少一种，则待测菌株为或候选为褐腐病菌：
1)采用所述Mfc引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
2)采用所述Mla引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
3)采用所述Mmu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
4)采用所述Mfg引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
5)采用所述Myu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
6)采用所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
若实时荧光PCR不满足如上1)-6)中的任一种，则待测菌株不为或候选不为褐腐病菌。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测菌株为褐腐病菌中的哪一种的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测菌株为褐腐病菌中的哪一种的方法包括如下步骤：
以待测菌株的基因组DNA为模板，分别采用上述成套引物中的所述Mfc引物探针组合物、所述Mla引物探针组合物、所述Mmu引物探针组合物、所述Mfg引物探针组合物、所述Myu引物探针组合物和所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR；
如果采用所述Mfc引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.fructicola；
如果采用所述Mla引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.laxa；
如果采用所述Mmu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.mumecola；
如果采用所述Mfg引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.fructigena；
如果采用所述Myu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.yunnanensis；
如果采用所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.polystroma。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种检测或辅助检测待测样品是否感染褐腐病菌的方法。
本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否感染褐腐病菌的方法包括以下步骤：
以待测菌株的基因组DNA为模板，分别采用上述成套引物中的所述Mfc引物探针组合物、所述Mla引物探针组合物、所述Mmu引物探针组合物、所述Mfg引物探针组合物、所述Myu引物探针组合物和所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR；
若实时荧光PCR满足如下1)-6)中的至少一种，则待测样品感染或候选感染褐腐病菌：
1)采用所述Mfc引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
2)采用所述Mla引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
3)采用所述Mmu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
4)采用所述Mfg引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
5)采用所述Myu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
6)采用所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
若实时荧光PCR不满足如上1)-6)中的任一种，则待测样品未感染或候选未感染褐腐病菌。
上述方法中，实时荧光PCR的反应数据由荧光定量PCR仪qTOWER2.0自带软件自动收集和分析，生成扩增曲线图。在获得的扩增曲线图中：当dRn超过阈值，且Ct值小于30，则被认为是阳性反应；否则，被认为是阴性反应。Ct值是指荧光值开始达到指数增长时的循环数；dRn是指荧光强度增长指数；阈值是指荧光本底信号。
上述成套引物或上述实时荧光PCR试剂或上述试剂盒或上述应用或上述方法，其特征在于：所述褐腐病菌为Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis或Monilia polystroma。
本发明以6种褐腐病菌为研究对象，开发区分M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.polystroma以及M.yunnanensis的Real-time PCR引物、探针及快速检测方法，为国际贸易中果品的快速通关提供有力的技术支持。
附图说明
图1为实施例2中针对M.fructicola的Real-time PCR特异性检测扩增结果。其中，1-5:M.fructicola；6-8:M.laxa；9-11:M.yunnanensis；12-14:M.fructigena；15-17:M.polystroma；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp.；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:阴性对照。
图2为实施例2中检测M.fructicola的定量PCR灵敏度结果。
图3为实施例3中针对M.laxa的Real-time PCR特异性检测结果。其中，1-5:M.laxa；6-8:M.fructicola；9-11:M.yunnanensis；12-14:M.fructigena；15-17:M.polystroma；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:阴性对照。
图4为实施例3中检测M.laxa的定量PCR灵敏度结果。
图5为实施例4中针对M.mumecola的Real-time PCR特异性检测结果。其中，1-3:M.mumecola；4-6:M.fructicola；7-9:M.laxa；10-12:M.fructigena；13-15:M.yunnanensis；16-18:M.polystroma；19:Botryosphaeria dothidea；20:Alternariaspp.；21:Botrytis cinerea；22:Colletotrichum fructicola；23:Penicillium spp.；24:阴性对照。
图6为实施例4中检测M.mumecola的定量PCR灵敏度结果。
图7为实施例5中针对M.fructigena的Real-time PCR特异性检测结果。其中，1-5:M.fructigena；6-8:M.fructicola；9-11:M.laxa；12-14:M.yunnanensis；15-17:M.polystroma；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp.；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:阴性对照。
图8为实施例5中检测M.fructigena的定量PCR灵敏度结果。
图9为实施例6中针对M.yunnanensis的Real-time PCR特异性检测结果。其中，1-5:M.yunnanensis；6-8:M.fructicola；9-11:M.laxa；12-14:M.fructigena；15-17:M.polystroma；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp.；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:阴性对照。
图10为实施例6中特异性检测M.yunnanensis的定量PCR灵敏度结果。
图11为实施例7中针对M.polystroma的Real-time PCR特异性检测结果。其中，1-5:M.polystroma；6-8:M.fructicola；9-11:M.laxa；12-14：fructigena；15-17:M.yunnanensis；18-20:M.mumecola；21:Botryosphaeria dothidea；22:Alternaria sp.；23:Botrytis cinerea；24:Colletotrichum fructicola；25:Penicillium spp.；26:阴性对照。
图12为实施例7中特异性检测M.polystroma的定量PCR灵敏度结果。
图13为对比例1中的褐腐病菌的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的6种褐腐病菌：
美澳型核果褐腐病菌Monilinia fructicola(Mfc)、核果褐腐病菌Monilinialaxa(Mla)和仁果褐腐病菌Monilinia fructigena(Mfg)均在非专利文献“Ioos&Frey，2000，European Journal of Plant Pathology 106:373-378”中公开过，公众可从中国农业大学获得；
Monilia polystroma(Mpo)在非专利文献“van Leeuwen et al.,2002,Mycological Research 106:444-451”中公开过，公众可从中国农业大学获得；
Monilia mumecola(Mmu)在非专利文献“Harada et al.,2004,Journal ofgeneral Plant Pathology 70:297-307”中公开过，公众可从中国农业大学获得；
Monilia yunnanensis(Myu)在非专利文献“Hu et al.,2011,Plos One 6:e24990”中公开过，公众可从中国农业大学获得；
下述实施例中的果实上的常见病菌：
灰葡萄孢Botrytis cinerea在非专利文献“Jiang,J et al.,2009，PesticideBiochemistry and Physiology 93:72-76”中公开过，公众可从中国农业大学获得；
菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum在非专利文献“Liu et al.,2009,Pesticide Biochemistry and Physiology,95,106-112”中公开过，公众可从中国农业大学获得；
苹果腐轮纹病菌Botryosphaeria dothidea在非专利文献“Tang et al.,2012,Plant Disease 96(4):486-496.”中公开过，公众可从中国农业大学获得；
Alternaria在非专利文献“Zhu&Xiao,2015,Phytopathology Phytopathology105(12):1555-1567.”中公开过，公众可从中国农业大学获得；
Colletotrichum fructicola在非专利文献“Zhang et al.,2015,EuropeanJournal of Plant Pathology,143(4):651-662”中公开过，公众可从中国农业大学获得；
实施例1、检测6种褐腐病菌的试剂盒及其检测方法
一、针对6种褐腐病菌的特异性引物和TaqMan探针的设计
选择6种褐腐病菌(美澳型核果褐腐病菌Monilinia fructicola、核果褐腐病菌Monilinia laxa、仁果褐腐病菌Monilinia fructigena、Monilia polystroma、Moniliamumecola、Monilia yunnanensis)及其他参考菌株的漆酶基因序列及延伸因子基因序列(朱小琼，2010)，用DNAMAN Version 6比对截齐，找到种特异性的序列区域，根据基因差异序列分别设计6种褐腐病菌特异性引物及探针：Mfc引物探针组合物、Mla引物探针组合物、Mmu引物探针组合物、Mfg引物探针组合物、Myu引物探针组合物和Mpo引物探针组合物；
Mfc引物探针组合物由Mfc引物对和Mfc探针组成；Mfc引物对由上游引物MfcF和下游引物MfcR组成；引物MfcF的核苷酸序列为序列表的序列1，引物MfcR的核苷酸序列为序列表的序列2；Mfc探针的核苷酸序列为序列表的序列3；
Mla引物探针组合物由Mla引物对和Mla探针组成；Mla引物对由上游引物MlaF和下游引物MlaR组成；引物MlaF的核苷酸序列为序列表的序列4，引物MlaR的核苷酸序列为序列表的序列5；Mla探针的核苷酸序列为序列表的序列6；
Mmu引物探针组合物由Mmu引物对和Mmu探针组成；Mmu引物对由上游引物MmuF和下游引物MmuR组成；引物MmuF的核苷酸序列为序列表的序列7，引物MmuR的核苷酸序列为序列表的序列8；Mmu探针的核苷酸序列为序列表的序列9；
Mfg引物探针组合物由Mfg引物对和Mfg探针组成；Mfg引物对由上游引物MfgF和下游引物MfgR组成；引物MfgF的核苷酸序列为序列表的序列10，引物MfgR的核苷酸序列为序列表的序列11；Mfg探针的核苷酸序列为序列表的序列12；
Myu引物探针组合物由Myu引物对和Myu探针组成；Myu引物对由上游引物MyuF和下游引物MyuR组成；引物MyuF的核苷酸序列为序列表的序列13，引物MyuR的核苷酸序列为序列表的序列14；Myu探针的核苷酸序列为序列表的序列15；
Mpo引物探针组合物由Mpo引物对和Mpo探针组成；Mpo引物对由上游引物MpoF和下游引物MpoR组成；引物MpoF的核苷酸序列为序列表的序列16，引物MpoR的核苷酸序列为序列表的序列17；Mpo探针的核苷酸序列为序列表的序列18。
设计的探针与引物通过Primer Express 3.0计算Tm值，保证引物的Tm值在58-60℃，探针的Tm值在68-70℃(Real-time PCR的引物与探针由上海基康生物技术有限公司合成)。
上述探针均为TaqMan探针，每一TaqMan探针中，在DNA分子的5’末端修饰荧光基团FAM；在Mfc探针DNA分子的3’末端修饰荧光基团BHQ，在Mla探针、Mfg探针、Myu探针、Mmu探针或Mpo探针DNA分子的3’末端修饰荧光基团MGB。
本发明设计的针对6种褐腐病菌的特异引物和TaqMan探针具体见表1。
表1、针对6种褐腐病菌的特异引物和探针
二、检测6种褐腐病菌的试剂盒
本发明的检测6种褐腐病菌的试剂盒包括步骤一中的针对6种褐腐病菌的特异引物和探针，以及实时荧光PCR反应缓冲液、热启动DNA聚合酶和dNTP。
本发明的试剂盒中，每种引物探针组合物均单独包装，每种引物探针组合物中的引物和探针均单独包装。
三、检测6种褐腐病菌的试剂盒的使用方法
1、采用CTAB法提取待测菌株菌丝和孢子的基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，分别采用Mfc引物探针组合物、Mla引物探针组合物、Mmu引物探针组合物、Mfg引物探针组合物、Myu引物探针组合物和Mpo引物探针组合物进行单重实时荧光PCR。设置以灭菌去离子水代替基因组DNA为空白对照。
实时荧光PCR在qTOWER2.0荧光定量PCR仪(Analytik Jena AG，Jena，Germany)中进行。
实时荧光PCR的反应体系(20μl)：2×Master Mix 10μl(上海基康生物有限公司)，灭菌去离子水2μl，上游引物MfcF 1μL(引物浓度为10μmol/L)，下游引物MfcR 1μL(引物浓度为10μmol/L)，探针Mfc 4μL(探针浓度为1μmol/L)，模板DNA 2μL(10-15ng/μl)。
实时荧光PCR的反应体系中，每种引物探针组合物中的两条引物在实时荧光PCR反应体系中的摩尔浓度均为0.5μM，在实时荧光PCR反应体系中，Mfc探针的浓度为0.2μM，Mla探针的浓度为0.8μM，Mmu探针的浓度为1μM，Mfg探针的浓度为0.5μM，Myu探针的浓度为0.8μM，Mpo探针的浓度为1μM。
实时荧光PCR的反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，最佳退火温度退火30s，共40个循环。
实时荧光PCR的反应数据由荧光定量PCR仪qTOWER2.0自带软件自动收集和分析，生成扩增曲线图。扩增曲线图中：当dRn超过阈值，且Ct值小于30(Ct值是指荧光值开始达到指数增长时的循环数，dRn是指荧光强度增长指数；阈值是指荧光本底信号)，则被认为是阳性反应；否则，被认为是阴性反应。
实施例2、应用Mfc引物探针组合物鉴定M.fructicola的特异性和灵敏度
用于鉴定M.fructicola的引物探针组合物为Mfc引物探针组合物，由Mfc引物对和Mfc探针组成。Mfc引物对由表1中的MfcF和MfcR组成。Mfc探针为表1中的MfcP。该实施例的步骤一和步骤二中的供试菌株均在文献“Zhu et al.2011Plant Disease95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物学报35(10)：1-12”中公开过。
一、引物的特异性检测
1、供试菌株
特异性实验中的待测褐腐病菌都是在前期实验中鉴定过的菌株，具体如下：
M.fructicola菌株：来自中国的菌株323031、324051，来自美国的菌株KAC3-4、RI37和来自新西兰的菌株NE18各1株；
M.laxa菌株：来自美国的B-C11、来自荷兰的CBS298.31和来自法国的P3菌株各1株；
M.mumecola菌株：来自日本的3231、来自中国的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；
M.yunnanensis菌株：来自中国的ABC15、AK9-1和AL1-2各1株；
M.fructigena菌株：来自中国的HX17-1、来自英国的EA-3和来自荷兰的CBS101502各1株；
M.polystroma菌株：来自中国的LHX12、来自日本的2319和CBS102686各1株。
特异性实验中的待测菌株同时还包含了近似种群B.cinerea，以及来自果实上的病菌Alternaria sp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。
2、实时荧光PCR
(1)采用CTAB法提取待测菌株菌丝和孢子的基因组DNA。
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用Mfc引物探针组合物进行单重实时荧光PCR。设置以灭菌去离子水代替基因组DNA为空白对照。
实时荧光PCR在qTOWER2.0荧光定量PCR仪(Analytik Jena AG，Jena，Germany)中进行。
实时荧光PCR的反应体系(20μl)：2×Master Mix 10μl(上海基康生物有限公司)，灭菌去离子水2μl，上游引物MfcF 1μL(引物浓度为10μmol/L)，下游引物MfcR 1μL(引物浓度为10μmol/L)，探针Mfc 4μL(探针浓度为1μmol/L)，模板DNA 2μL(10-15ng/μl)。
实时荧光PCR的反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，最佳退火温度退火30s，共40个循环。
检测结果如图1所示。5个M.fructicola菌株均显示阳性反应(荧光信号呈指数增长，Ct值为24-26)。M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.yunnanensis、M.polystroma均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Mfc引物探针组合物鉴定M.fructicola具有良好的特异性。
二、引物的灵敏度检测
1、供试菌株
待测褐腐病菌为M.fructicola的菌株323031。
2、实时荧光PCR
(1)采用CTAB法提取待测菌株菌丝和孢子的基因组DNA。
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板进行梯度稀释，采用Mfc引物探针组合物进行单重实时荧光PCR。设置以灭菌去离子水代替基因组DNA为空白对照。
实时荧光PCR在qTOWER2.0荧光定量PCR仪(Analytik Jena AG，Jena，Germany)中进行。
实时荧光PCR的反应体系(20μl)：2×Master Mix 10μl(上海基康生物有限公司)，灭菌去离子水2μl，上游引物MfcF 1μL(引物浓度为10μmol/L)，下游引物MfcR 1μL(引物浓度为10μmol/L)，探针Mfc 4μL(探针浓度为1μmol/L)，模板DNA 2μL(DNA含量为10ng、1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng、10-5ng)。
实时荧光PCR的反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，最佳退火温度退火30s，共40个循环。
检测结果见图2。采用各个浓度的M.fructicola菌株的基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低明显增大，当浓度分别为10ng、1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng或10-5ng时，Ct值依次分别为19、23、27、29、33、35或40。结果表明：应用Mfc引物探针组合物鉴定M.fructicola，检测限度可达10-5ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光反应在达到40个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当模板浓度大于等于0.01ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测M.fructicola的适宜模板浓度应高于0.01ng。
实施例3、应用Mla引物探针组合物鉴定M.laxa的特异性和灵敏度
用于鉴定M.laxa的引物探针组合物为Mla引物探针组合物，由Mla引物对和Mla探针组成。Mla引物对由表1中的MlaF和MlaR组成。Mla探针为表1中的MlaP。该实施例的步骤一和步骤二中的供试菌株均在文献“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhuet al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物学报35(10)：1-12”中公开过。
一、引物的特异性检测
1、供试菌株
特异性实验中的待测褐腐病菌都是在前期实验中鉴定过的菌株，具体如下：
M.laxa：来自美国的B-C11、MDA12-1，来自荷兰的CBS298.31、CBS489.50，和来自法国的P3菌株各1株；
M.fructicola：来自中国323031、来自美国的菌株KAC3-4和来自新西兰的菌株NE18各1株；
M.mumecola：来自日本的3231、来自中国的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；
M.yunnanensis：为来自中国的ABC15、AK9-1和AL1-2各1株；
M.fructigena：来自中国的HX17-1、来自荷兰的CBS101502、CBS101499各1株；
M.polystroma：来自中国的LHX12、来自日本的2319和CBS102686各1株。
待测菌株同时包含了近似种群B.cinerea，以及来自果实上的病菌Alternariasp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR方法同实施例2的步骤1。
检测结果见图3。5个M.laxa菌株均显示阳性反应(荧光信号呈指数增长，Ct值为23-27)。M.fructicola、M.mumecola、M.fructigena、M.yunnanensis、M.polystroma及其他参考菌株均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Mla引物探针组合物鉴定M.laxa具有良好的特异性。
二、引物的灵敏度检测
1、供试菌株
灵敏度实验中的待测褐腐病菌为M.laxa的菌株CBS298.31。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR方法同实施例2的步骤2。
检测结果见图4。采用各个浓度的M.laxa菌株的基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低明显增大，当浓度分别为10ng、1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng或10-5ng时，Ct值依次分别为20、25、29、32、34、34或36。结果表明：应用Mla引物探针组合物鉴定M.laxa，检测限度可达10-5ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光反应在达到36个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当模板浓度大于等于0.1ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测M.laxa的适宜模板浓度应高于0.1ng。
实施例4、应用Mmu引物探针组合物鉴定M.mumecola的特异性和灵敏度
用于鉴定M.mumecola的引物探针组合物为Mmu引物探针组合物，由Mmu引物对和Mmu探针组成。Mmu引物对由表1中的MmuF和MmuR组成。Mmu探针为表1中的MmuP。该实施例的步骤一和步骤二中的供试菌株均在文献“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物学报35(10)：1-12”中公开过。
一、引物的特异性检测
1、供试菌株
特异性实验中的待测褐腐病菌都是在前期实验中鉴定过的菌株，具体如下：
M.mumecola：来自日本的3231、来自中国的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；
M.laxa：来自美国的B-C11、MDA12-1，来自荷兰的CBS298.31、CBS489.50，以及来自法国的P3菌株各1株；
M.fructicola：来自中国323031，来自美国的菌株KAC3-4，来自新西兰的菌株NE18各1株；
M.yunnanensis：为来自中国的ABC15、AK9-1以及AL1-2各1株；
M.fructigena：来自中国的HX17-1、来自荷兰的CBS101502、CBS101499各1株；
M.polystroma：来自中国的LHX12、来自日本的2319和CBS102686各1株。
待测菌株同时包含了近似种群B.cinerea，以及来自果实上的病菌Alternariasp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR方法同实施例2的步骤1。
检测结果见图5。3个M.mumecola菌株均显示阳性反应(荧光信号呈指数增长，Ct值为23-24)。M.fructicola、M.laxa、M.fructigena、M.yunnanensis、M.polystroma及其他参考菌株均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Mmu引物探针组合物鉴定M.mumecola具有良好的特异性。
二、引物的灵敏度检测
1、供试菌株
灵敏度实验中的待测褐腐病菌为M.laxa的菌株HWL10-4b。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR同实施例2的步骤2。
检测结果见图6。采用各个浓度的M.mumecola菌株的基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低明显增大，当浓度分别为10ng、1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng或10-5ng时，Ct值依次分别为23、26、30、33、36、35或36。结果表明：应用Mmu引物探针组合物鉴定M.mumecola，检测限度可达10-5ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光反应在达到36个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当模板浓度大于等于1ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测M.mumecola的适宜模板浓度应高于1ng。
实施例5、应用Mfg引物探针组合物鉴定M.fructigena的特异性和灵敏度
用于鉴定M.fructigena的引物探针组合物为Mfg引物探针组合物，由Mfg引物对和Mfg探针组成。Mfg引物对由表1中的MfgF和MfgR组成。Mfg探针为表1中的MfgP。该实施例的步骤一和步骤二中的供试菌株均在文献“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物学报35(10)：1-12”中公开过。
一、引物的特异性检测
1、供试菌株
特异性实验中的待测褐腐病菌都是在前期实验中鉴定过的菌株，具体如下：
M.fructigena：来自中国的HX17-1、来自荷兰的CBS101502、CBS101499，来自英国的EA-2和EA-3各1株；
M.mumecola：来自日本的3231、来自中国的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；
M.laxa菌株：来自美国的B-C11、MDA12-1，来自荷兰的CBS298.31、CBS489.50，和来自法国的P3菌株各1株；
M.fructicola：来自中国323031、来自美国的菌株KAC3-4和来自新西兰的菌株NE18各1株；
M.yunnanensis：为来自中国的ABC15、AK9-1和AL1-2各1株；
M.polystroma：来自中国的LHX12、来自日本的2319和CBS102686各1株。
待测菌株同时还包含了近似种群B.cinerea，以及来自果实上的病菌Alternariasp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR方法同实施例2的步骤1。
检测结果见图7。5个M.fructigena菌株均显示阳性反应(荧光信号呈指数增长，Ct值为18-22)。M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.yunnanensis、M.polystroma及其他参考菌株均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Mfg引物探针组合物鉴定M.fructigena具有良好的特异性。
二、引物的灵敏度检测
1、供试菌株
灵敏度实验中的待测褐腐病菌为M.laxa的菌株CBS98.312。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR方法同实施例2的步骤2。
检测结果见图8。采用各个浓度的M.fructigena菌株的基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低明显增大，当浓度分别为10ng、1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng或10-5ng时，Ct值依次分别为21、25、29、32、35、37或无Ct值。结果表明：应用Mfg引物探针组合物鉴定M.fructigena，检测限度可达10-4ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光反应在达到37个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当模板浓度大于等于0.1ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测M.fructigena的适宜模板浓度应高于0.1ng。
实施例6、应用Myu引物探针组合物鉴定M.yunnanensis的特异性和灵敏度
用于鉴定M.yunnanensis的引物探针组合物为Myu引物探针组合物，由Myu引物对和Myu探针组成。Myu引物对由表1中的MyuF和MyuR组成。Myu探针为表1中的MyuP。该实施例的步骤一和步骤二中的供试菌株均在文献“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物学报35(10)：1-12”中公开过。
一、引物的特异性检测
1、供试菌株
特异性实验中的待测褐腐病菌都是在前期实验中鉴定过的菌株，具体如下：
M.yunnanensis：来自中国的ABC15、AK5-1、AK7-1、AK9-1和AL1-2各1株；
M.fructigena：来自中国的HX17-1、来自荷兰的CBS101502、CBS101499各1株；
M.mumecola：来自日本的3231、来自中国的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；
M.laxa菌株：来自美国的B-C11、MDA12-1，来自荷兰的CBS298.31、CBS489.50，以及来自法国的P3菌株各1株；
M.fructicola：来自中国323031，来自美国的菌株KAC3-4，来自新西兰的菌株NE18各1株；
M.polystroma：来自中国的LHX12、来自日本的2319和CBS102686各1株。
待测菌株同时还包含了近似种群B.cinerea，以及来自果实上的病菌Alternariasp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR方法同实施例2的步骤1。
检测结果见图9。5个M.yunnanensis菌株均显示阳性反应(荧光信号呈指数增长，Ct值为24-26)。M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.polystroma及其他参考菌株均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Mfg引物探针组合物鉴定M.yunnanensis具有良好的特异性。
二、引物的灵敏度检测
1、供试菌株
灵敏度实验中的待测褐腐病菌为M.yunnanensis的菌株AL1-2。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR方法同实施例2的步骤2。
检测结果见图10。采用各个浓度的M.yunnanensis菌株的基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低明显增大，当浓度分别为10ng、1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng或10-5ng时，Ct值依次分别为27、31、33、37、36、36或36。结果表明：应用Myu引物探针组合物鉴定M.yunnanensis，检测限度可达10-5ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光反应在达到36个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当模板浓度大于等于10ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测M.yunnanensis的适宜模板浓度应高于10ng。
实施例7、应用Mpo引物探针组合物鉴定M.polystroma的特异性和灵敏度
用于鉴定M.polystroma的引物探针组合物为Mpo引物探针组合物，由Mpo引物对和Mpo探针组成。Mpo引物对由表1中的MpoF和MpoR组成。Mpo探针为表1中的MpoP。该实施例的步骤一和步骤二中的供试菌株均在文献“Zhu et al.2011Plant Disease 95(10):1284-1291；Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250；牛程旺等2016菌物学报35(10)：1-12”中公开过。
一、引物的特异性检测
1、供试菌株
特异性实验中的待测褐腐病菌都是在前期实验中鉴定过的菌株，具体如下：
M.polystroma：来自中国的LHX12、LS25、SS3，来自日本的2319和CBS102686各1株；
M.yunnanensis：为来自中国的ABC15、AK5-1、AK7-1、AK9-1和AL1-2各1株；
M.fructigena：来自中国的HX17-1、来自荷兰的CBS101502和CBS101499各1株；
M.mumecola：来自日本的3231、来自中国的HWL10-4b和HWL10-20a各1株；
M.laxa菌株：来自美国的B-C11、MDA12-1，来自荷兰的CBS298.31、CBS489.50，和来自法国的P3菌株各1株；
M.fructicola：来自中国323031，来自美国的菌株KAC3-4和来自新西兰的菌株NE18各1株。
待测菌株同时还包含了近似种群B.cinerea，以及来自果实上的病菌Alternariasp.、C.fructicola、Penicillium sp.和B.dothidea各1株。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR方法同实施例2的步骤1。
检测结果见图11。5个M.polystroma菌株均显示阳性反应(荧光信号呈指数增长，Ct值为21-26)。M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.yunnanensis及其他参考菌株均显示阴性反应，空白对照显示阴性反应。结果表明，应用Mfg引物探针组合物鉴定M.polystroma具有良好的特异性。
二、引物的灵敏度检测
1、供试菌株
灵敏度实验中的待测褐腐病菌为M.polystroma的菌株CBS102686。
2、实时荧光PCR
实时荧光PCR方法同实施例2的步骤2。
检测结果见图12。采用各个浓度的M.polystroma菌株的基因组DNA作为模板，Ct值随着DNA模板浓度的降低明显增大，当浓度分别为10ng、1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng或10-5ng时，Ct值依次分别为20、24、27、30、32、34或33。结果表明：应用Myu引物探针组合物鉴定M.polystroma，检测限度可达10-5ng(但此浓度下扩增效率很低，荧光反应在达到33个循环时才出现指数增长，即Ct值大于30)；当模板浓度大于等于0.1ng时，Ct值均小于30，说明实时荧光PCR方法检测M.polystroma的适宜模板浓度应高于0.1ng。
对比例1、检测褐腐病菌的方法
以如下褐腐病菌：323031M.fructicola、ABC15M.yunnanensis、3231M.mumecola、P3M.laxa、CBS102686M.polystroma和HX17-1M.fructigena为研究对象，采用根据beta-tubulin基因序列差异开发的多重普通PCR方法进行检测，检测的具体步骤参照文献“Hu etal.,2011,Plos One 6:e24990”中方法。
检测结果如图13所示。从图中可以看出，文献“Hu et al.,2011,Plos One 6:e24990”中方法仅能区分M.fructicola、M.yunnanensis和M.mumecola菌株，无法区分M.laxa、M.polystraoma和M.fructigena菌株，且检测方法在检测速度和灵敏性方面也不及本发明的方法。
对比例2、检测褐腐病菌的方法
以如下褐腐病菌：M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.fructigena、M.yunnanensis和M.polystraoma六种褐腐病菌为研究对象，采用根据laccase基因序列差异开发的普通PCR方法进行检测，检测的具体步骤参照文献“Zhu et al.2016PlantDisease 100(11):2240-2250”中的方法。
结果表明：文献“Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250”中的方法仅可以区分M.fructicola、M.laxa、M.mumecola、M.yunnanensis和M.polystraoma五种褐腐病菌，不能鉴定M.fructigena，且文献“Zhu et al.2016Plant Disease 100(11):2240-2250”中的方法在检测速度和灵敏性方面也不及本发明的方法。
序列表
<110>中国农业大学
<120>用于鉴定六种褐腐病菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
<160>18
<210>1
<211>24bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tgtcactcaa gtaagttgat ctgc 24
<210>2
<211>19bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
tccatcgccg tattgaagt 19
<210>3
<211>25bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
tacctccatc aagtgcccta tcgct 25
<210>4
<211>24bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
tcaatcgata ccaactggta cgat 24
<210>5
<211>28bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
ttctcaactg aaagccaata ttctttag 28
<210>6
<211>24bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
cactagaggt aagtgatatg acat 24
<210>7
<211>25bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
aattgatacc aactggtacg atgtg 25
<210>8
<211>30bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
aaagccaata ttcttgatat caagttagtg 30
<210>9
<211>23bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
aggtaagtga taaaacatcc ttt 23
<210>10
<211>28bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
ataccaactg gtacgatgtt actcctac 28
<210>11
<211>30bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
aagccaatat tctttatata aagttagcgc 30
<210>12
<211>21bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
ctagaggtaa gtgatatggc a 21
<210>13
<211>20bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>13
aagttgcatc ccttcgctgt 20
<210>14
<211>22bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
atgaccaggg gcatctgtaa tt 22
<210>15
<211>18bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>15
acgttcagga taatctaa 18
<210>16
<211>21bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>16
tcattggtaa gttgcatccc c 21
<210>17
<211>26bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>17
gatgaccagg ggcatctata attatt 26
<210>18
<211>20bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>18
cattacgttg ttcacgataa 20
Claims (10)
1.一种用于鉴定或辅助鉴定褐腐病菌的成套引物，其包括Mfc引物探针组合物、Mla引物探针组合物、Mmu引物探针组合物、Mfg引物探针组合物、Myu引物探针组合物和Mpo引物探针组合物；
所述Mfc引物探针组合物由Mfc引物对和Mfc探针组成；所述Mfc引物对由上游引物MfcF和下游引物MfcR组成；所述上游引物MfcF的核苷酸序列为序列表的序列1，所述下游引物MfcR的核苷酸序列为序列表的序列2；所述Mfc探针的核苷酸序列为序列表的序列3；
所述Mla引物探针组合物由Mla引物对和Mla探针组成；所述Mla引物对由上游引物MlaF和下游引物MlaR组成；所述上游引物MlaF的核苷酸序列为序列表的序列4，所述下游引物MlaR的核苷酸序列为序列表的序列5；所述Mla探针的核苷酸序列为序列表的序列6；
所述Mmu引物探针组合物由Mmu引物对和Mmu探针组成；所述Mmu引物对由上游引物MmuF和下游引物MmuR组成；所述上游引物MmuF的核苷酸序列为序列表的序列7，所述下游引物MmuR的核苷酸序列为序列表的序列8；所述Mmu探针的核苷酸序列为序列表的序列9；
所述Mfg引物探针组合物由Mfg引物对和Mfg探针组成；所述Mfg引物对由上游引物MfgF和下游引物MfgR组成；所述上游引物MfgF的核苷酸序列为序列表的序列10，所述下游引物MfgR的核苷酸序列为序列表的序列11；所述Mfg探针的核苷酸序列为序列表的序列12；
所述Myu引物探针组合物由Myu引物对和Myu探针组成；所述Myu引物对由上游引物MyuF和下游引物MyuR组成；所述上游引物MyuF的核苷酸序列为序列表的序列13，所述下游引物MyuR的核苷酸序列为序列表的序列14；所述Myu探针的核苷酸序列为序列表的序列15；
所述Mpo引物探针组合物由Mpo引物对和Mpo探针组成；所述Mpo引物对由上游引物MpoF和下游引物MpoR组成；所述上游引物MpoF的核苷酸序列为序列表的序列16，所述下游引物MpoR的核苷酸序列为序列表的序列17；所述Mpo探针的核苷酸序列为序列表的序列18。
2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：
每个所述引物探针组合物中的上游引物和下游引物的摩尔比均为1：1。
3.根据权利要求1或2所述的成套引物，其特征在于：
在所述探针的5’末端均修饰荧光基团FAM；
在所述Mfc探针的3’末端修饰荧光基团BHQ；
在所述Mla探针、所述Mfg探针、所述Myu探针、所述Mmu探针和所述Mpo探针的3’末端均修饰荧光基团MGB。
4.一种用于鉴定或辅助鉴定褐腐病菌的实时荧光PCR试剂，其包括权利要求1-3中任一所述的成套引物。
5.一种用于鉴定或辅助鉴定褐腐病菌的试剂盒，其包括权利要求1-3中任一所述的成套引物或权利要求4所述的实时荧光PCR试剂。
6.权利要求1-3中任一所述的成套引物或权利要求4所述的实时荧光PCR试剂或权利要求5所述试剂盒在如下(1)-(10)中任一种中的应用：
(1)鉴定或辅助鉴定Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和/或Monilia polystroma；
(2)制备鉴定或辅助鉴定Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Moniliamumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和/或Monilia polystroma的产品；
(3)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为褐腐病菌；
(4)制备鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为褐腐病菌的产品；
(5)鉴定或辅助鉴定待测菌株为褐腐病菌中的哪一种；
(6)制备鉴定或辅助鉴定待测菌株为褐腐病菌中的哪一种的产品；
(7)检测或辅助检测待测样品是否感染褐腐病菌；
(8)制备检测或辅助检测待测样品是否感染褐腐病菌的产品；
(9)区分或辅助区分Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和Monilia polystroma；
(10)制备区分或辅助区分Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Moniliamumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis和Monilia polystroma的产品。
7.一种鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为褐腐病菌的方法，包括以下步骤：
以待测菌株的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述的成套引物中的所述Mfc引物探针组合物、所述Mla引物探针组合物、所述Mmu引物探针组合物、所述Mfg引物探针组合物、所述Myu引物探针组合物和所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR；
若实时荧光PCR满足如下1)-6)中的至少一种，则待测菌株为或候选为褐腐病菌：
1)采用所述Mfc引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
2)采用所述Mla引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
3)采用所述Mmu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
4)采用所述Mfg引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
5)采用所述Myu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
6)采用所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
若实时荧光PCR不满足如上1)-6)中的任一种，则待测菌株不为或候选不为褐腐病菌。
8.一种鉴定或辅助鉴定待测菌株为褐腐病菌中的哪一种的方法，包括如下步骤：
以待测菌株的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述的成套引物中的所述Mfc引物探针组合物、所述Mla引物探针组合物、所述Mmu引物探针组合物、所述Mfg引物探针组合物、所述Myu引物探针组合物和所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR；
如果采用所述Mfc引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.fructicola；
如果采用所述Mla引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.laxa；
如果采用所述Mmu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.mumecola；
如果采用所述Mfg引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.fructigena；
如果采用所述Myu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.yunnanensis；
如果采用所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应，则待测菌株为或候选为M.polystroma。
9.一种检测或辅助检测待测样品是否感染褐腐病菌的方法，包括以下步骤：
以待测菌株的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述的成套引物中的所述Mfc引物探针组合物、所述Mla引物探针组合物、所述Mmu引物探针组合物、所述Mfg引物探针组合物、所述Myu引物探针组合物和所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR；
若实时荧光PCR满足如下1)-6)中的至少一种，则待测样品感染或候选感染褐腐病菌：
1)采用所述Mfc引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
2)采用所述Mla引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
3)采用所述Mmu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
4)采用所述Mfg引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
5)采用所述Myu引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
6)采用所述Mpo引物探针组合物进行实时荧光PCR显示阳性反应；
若实时荧光PCR不满足如上1)-6)中的任一种，则待测样品未感染或候选未感染褐腐病菌。
10.根据权利要求1-3中任一所述的成套引物或权利要求4所述的实时荧光PCR试剂或权利要求5所述试剂盒或权利要求6所述的应用或权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：
所述褐腐病菌为Monilinia fructicola、Monilinia laxa、Monilia mumecola、Monilinia fructigena、Monilia yunnanensis或Monilia polystroma。
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|---|---|---|---|---|
| CN108034744A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-15 | 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局 | 一组核苷酸序列及其应用 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN101831492A (zh) * | 2009-12-11 | 2010-09-15 | 中国农业大学 | 用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及试剂盒 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101831492A (zh) * | 2009-12-11 | 2010-09-15 | 中国农业大学 | 用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ANTONIOS PAPAVASILEIOU等: "Identification and Differentiation of Monilinia Species Causing Brown Rot of Pome and Stone Fruit using High-Resolution Melting (HRM) Analysis", 《PHYTOPATHOLOGY》 * |
| JING-RU WANG等: "Detection and Identification of Six Monilinia spp. Causing Brown Rot Using TaqMan Real-Time PCR from Pure Cultures and Infected Apple Fruit", 《PLANT DISEASE》 * |
| 樊锦艳等: "褐腐病菌三种分子鉴定方法的比较", 《植物保护学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108034744A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-05-15 | 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局 | 一组核苷酸序列及其应用 |
| CN108034744B (zh) * | 2017-12-12 | 2021-02-05 | 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局 | 一组核苷酸序列及其应用 |
| CN109234436A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-01-18 | 扬州大学 | 一种基于lamp方法的灰霉病菌快速痕量检测试剂、方法及应用 |
| RU2751248C2 (ru) * | 2019-12-09 | 2021-07-12 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур" (ФГБНУ ВНИИЦиСК) | Праймеры для выявления видов monilinia laxa, monilinia fruticola, monilinia fructigena |
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