CN101831492A

CN101831492A - 用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN101831492A
Application number: CN200910242286A
Authority: CN
Inventors: 朱小琼; 国立耘
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2029-12-11
Also published as: CN101831492B

Abstract

本发明提供了一种用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及试剂盒。本发明涉及农作物病害诊断、病原鉴定等领域。本发明所述引物序列为：上游引物ClaF：5’-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3’；下游引物ClaR：5’-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3’。经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可以特异性地从美澳型核果褐腐病菌的DNA中扩增出大小为386bp的片段。本发明引物序列特异性强，应用本发明的引物、方法及试剂盒能够准确、快速的鉴定美澳型核果褐腐病菌。

Description

用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及农作物病害诊断、病原鉴定等领域，更具体涉及一种美澳型核果褐腐病菌鉴定的引物及其应用。

背景技术

褐腐病(Brown Rot)是核果类李属植物桃、李、杏、樱桃等果树及仁果类苹果、梨属植物的重要病害。褐腐病从核果仁果植物开花期便开始发生，造成花腐、枝腐；最严重的是造成产中产后的果实腐烂。2001年，美国南部的乔治亚州褐腐病大面积发生，给桃产业带来直接经济损失达430万美元，购买杀菌剂带来间接经济损失为150万美元(Phillips，2002)。

褐腐病主要是由子囊菌门(Ascomycete)，盘菌纲(Discomycete)，柔膜菌目(Helotiales)，核盘菌科(Sclerotiniaceae)，链核盘菌属(Monilinia)(阿历索保罗等，1996)的三种病原菌---Monilinia fructicola、M.fructigena、M.laxa及2002年新命名的Monilia polystroma引起的。褐腐病菌在世界各地分布不同(Byrde& Willetts，1977；Batra，1991)。美澳型核果褐腐病菌，即M.fructicola主要分布在美洲、澳大利亚、新西兰、日本(Batra，1991)；M.fructigena主要分布在欧洲、日本及亚洲其它地区；M.laxa分布最为广泛，几乎存在于所有核果和仁果的种植区，Molinia polystroma则主要发生在日本。根据文献报道，我国1998年以前的褐腐菌有M.laxa和M.fructigena两种(戴芳澜，1979；庄文颖，1998；王英祥等，1998)。2005年(Zhu，et al)首次报道在中国北京地区的桃和油桃上发现了M.fructicola。在检疫中，M.fructicola是欧盟的A2类检疫对象(OEPP/EPPO，2005)，也是我国对外检疫对象。

四种褐腐病菌的的形态特征非常相似，缺少经验时很难准确判断。近年发展起来的分子生物学技术也在褐腐病菌的种类鉴定中得到了广泛应用(Ioos et al.，2000；Hughes，et al.2000；Ma et al.，2003；Cote et al.，2004；Gell et al.，2007)。但是由于褐腐病菌不同种间的序列差异很小，利用ITS序列差异、微卫星引物等扩增片段差异设计种类特异性引物时没有充分考虑相近种的差异(如图2所示)；同时，用于测试的菌株有限，缺乏来自世界多个地区的褐腐病菌株，所设计的种类特异性引物的特异性往往较差。因此，针对来自世界多个国家和地区的褐腐病菌株，开发具有稳定特异性的鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、试剂盒，以及一种利用该引物和试剂盒快速鉴定美澳型核果褐腐病菌的方法。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1.根据美澳型核果褐腐病菌laccase2(lcc2)基因序列的特异性，设计了对美澳型核果褐腐病菌具有特异性的一对PCR引物，PCR引物的序列为：

ClaF：5’-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3’

ClaR：5’-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3’。

2.美澳型核果褐腐病菌鉴定的方法：

(1)提取待测菌的基因组DNA。

(2)以待测菌的DNA作为模版，以所述引物作为扩增引物，进行PCR扩增。

(3)将5μl PCR产物用重量体积比为1.4％的琼脂糖凝胶电泳分离后用EB染色，若凝胶上显现386bp的DNA条带，则待测菌为美澳型核果褐腐病菌。

上述方法第(2)步中PCR反应体系组成如下：PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR Buffer，200μmol/L dNTPs，引物ClaF和ClaR各0.2μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，10ng模板DNA，ddH₂O补足25μl；PCR反应条件为94-95℃预变性3分钟，94-95℃变性30秒，60-64℃退火30秒，72℃延伸1-1.5分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟。

3.鉴定美澳型核果褐腐病菌的试剂盒：

试剂盒包含10×PCR Buffer、10mmol/L dNTPs、5U/μl Taq DNA聚合酶、ddH₂O、引物ClaF和ClaR，引物浓度为10μmol/L，所述引物序列为：

ClaF：5’-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3’

ClaR：5’-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3’。

本发明有益效果：

本发明提供的引物和方法能快速、准确鉴定美澳型核果褐腐病菌。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

①引物特异性强：本发明的鉴定方法是利用核果及仁果上褐腐病菌的漆酶基因lcc2具有种内保守、种间变异的特点，根据序列差异较大的区段设计引物进行鉴定。已经对来自中国、美国、法国、新西兰、英国、意大利、日本等多个国家已知的4种仁果及核果褐腐病菌即Monilinia fructicola、M.fructigena、M.laxa、Monilia polystroma及其近似种进行了验证，结果显示该引物具有很强的特异性。

②操作简便快速：应用本发明，提取褐腐病菌的DNA作为模板进行PCR扩增，用常规的琼脂糖凝胶电泳，整个过程可在6小时内完成。因此，本发明的引物和鉴定方法可用于快速、准确鉴定美澳型核果褐腐病菌。

附图说明

图1A、B为用本发明的引物、试剂盒及鉴定方法鉴定美澳型核果褐腐病菌及近似种各菌株的PCR扩增产物凝胶电泳图谱。Monilinia fructicola为美澳型核果褐腐病菌，分别来自美国、法国、新西兰、中国；Monilinia laxa为来自英国、意大利和中国的核果褐腐病菌；Monilinia fructigena为来自法国、英国、意大利和中国的仁果褐腐病菌；其余为果实褐腐病菌近似种及其它植物病原真菌。所有M.fructicola菌株都产生一条大小为386bp的片段，而阴性对照及其它菌株均无扩增产物，说明是特异性扩增。

图2为用文献报道(Ioos等，2000)的引物鉴定我国褐腐病菌种类的PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。CK为空白对照，Monilinia fructicola为美澳型核果褐腐病菌，Monilinia laxa为核果褐腐病菌；Moniliniafructigena为仁果褐腐病菌；其中，Ft、P3、P1为来自法国的标准菌株，其它菌株均来自中国。所有M.fructicola菌株及1株M.fructigena菌株都产生了1条扩增条带，说明该引物不能准确鉴定美澳型核果褐腐病菌。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述：

实施例一

1.选用菌株

美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)、核果褐腐病菌(M.laxa)、仁果褐腐病菌(M.fructigena)、串珠霉(Monilia polystroma，Monilia mumecola)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、链格孢菌(Alternaria spp.)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、苹果疫霉(Phytophthora cactorum)、番茄叶霉(Cladosporium fulvum)。

上述菌株保存于中国农业大学植物病理学系，也可通过常规的植物病原分离纯化得到。

2.DNA提取

从培养基表面刮菌丝，约50-100mg，放到2ml冻存管中，加入500μl抽提缓冲液，置于DNA提取仪FastPrep-24中，设置速度为5，时间为40秒；取出混合液，加入50μl 10％SDS，37℃水浴1h；加入75μl5M NaCl，将混合液轻轻混匀；加入65μl CTAB/NaCl溶液，充分混匀后于65℃水浴10-20min；加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀后，10,000rpm离心12min；将上清转移至另一eppendorf管中，加0.6倍体积的冷异丙醇，颠倒混匀，然后10,000rpm离心12min，去上清；加入500μl 70％乙醇，颠倒数次；10,000rpm离心12min，去上清；用冷冻浓缩仪将沉淀抽干，沉淀溶于100μl TE中(含100μg/mlRNase)，-20℃保存备用。

3.引物合成

根据美澳型核果褐腐病菌laccase2(lcc2)基因序列的特异性，设计了对美澳型核果褐腐病菌具有特异性的一对PCR引物，PCR引物的序列为：

ClaF：5’-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3’

ClaR：5’-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3’

上述序列由赛百盛合成，也可经常规的引物合成方法合成。

4.菌株鉴定

以上述所有菌株的DNA为模板，用ClaF/ClaR引物进行PCR反应，每次反应均包括一个阴性对照(用ddH₂O代替DNA模板)。

PCR反应体系组成：总体积25μl，包括2.5μl 10×PCR Buffer(北京盛旭百川公司生产)，200μmol/L dNTPs，引物ClaF和ClaR各0.2μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，10ng模板DNA，ddH₂O补足25μl。

PCR反应条件为：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟。

将5μl PCR产物用重量体积比为1.4％的琼脂糖凝胶电泳分离后用溴化乙锭(EB)染色后拍照。

从电泳图片上看(如图1所示)，美澳型核果褐腐病菌的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显色后，凝胶上显现大小为386bp的DNA条带，其它菌的PCR扩增产物经电泳显色后凝胶上不显现DNA条带，即说明本发明的引物可以特异性的扩增美澳型核果褐腐病菌的DNA。

实施例二

仅PCR反应条件不同，其余鉴定过程同实施例1。具体的PCR反应条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业大学

<120>用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物、方法及试剂盒

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>Monilinia fructicola

<400>1

ggtaagcgac atcgcattct cac 23

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>Monilinia fructicola

<400>2

gaggtaaatg tggtaaatat gcag 24

Claims

1.用于鉴定美澳型核果褐腐病菌的引物，其特征在于，所述引物序列为：

ClaF：5’-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3’

ClaR：5’-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3’。

2.一种鉴定美澳型核果褐腐病菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待测菌的基因组DNA；

(2)以待测菌的DNA作为模版，以ClaF和ClaR引物作为扩增引物，进行PCR扩增；

(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用EB染色，若电泳结果出现大小为386bp的DNA条带，则待测菌为美澳型核果褐腐病菌。

3.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于：所述PCR反应体系组成如下：PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR Buffer，200μmol/L dNTPs，引物ClaF和ClaR各0.2μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，10ng模板DNA，ddH₂O补足25μl；PCR反应条件为94-95℃预变性3分钟，94-95℃变性30秒，60-64℃退火30秒，72℃延伸1-1.5分钟，共30-40个循环；72℃延伸10分钟。

4.一种采用如权利要求1、2、3所述的引物鉴定美澳型核果褐腐病菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含10×PCR Buffer、10mmol/L dNTPs、5U/μl Taq DNA聚合酶、ddH₂O、引物ClaF和ClaR，引物浓度为10μmol/L。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物ClaF和ClaR序列为：

ClaF：5’-GGTAAGCGACATCGCATTCTCAC-3’

ClaR：5’-GAGGTAAATGTGGTAAATATGCAG-3’。