CN105177148B - 同时检测两种葡萄溃疡病菌的双重pcr引物及其应用 - Google Patents

同时检测两种葡萄溃疡病菌的双重pcr引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组同时检测两种葡萄溃疡病菌的双重PCR引物及其应用。该组引物，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。这组引物可以在一个双重PCR反应中分别检测到两种葡萄溃疡病菌‑小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的存在，这表明该组引物可以快速、准确、灵敏的确定葡萄苗木以及田间葡萄病样中的上述两种葡萄溃疡病菌，为苗木带菌检测和针对性防治这2种病原菌引起的葡萄溃疡病提供依据。

Description

同时检测两种葡萄溃疡病菌的双重PCR引物及其应用
技术领域
本发明属于本发明属于植物真菌病原物分子检测新技术，具体涉及采用双重PCR技术检测两种葡萄溃疡病菌的方法的建立及其应用。
背景技术
由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌引起的葡萄溃疡病(grapeBotryosphaeria dieback)近年来在世界范围内危害日益加重，已经成为威胁葡萄品质和产量的重要因素之一(Pascoe I.Trunk diseases of grapevines-perspective from atour of California.The Australian Grapegrower and Winemaker.1998,417:68-71.Van Niekerk JM,Fourie P H,Hallenn F,et al.Botryosphaeria spp.as grapevinetrunk disease pathogens.Phytopathologia Mediterranea.2006,45(4):43-54.Urbez-Torres JR.The status of Botryosphaeriaceae species infectinggrapevines.Phytopathologia Mediterrianea.2011,50:5-45.)。截至目前，报道显示在葡萄座腔菌科中有17个种可引起葡萄溃疡病(Auger J,Esterio M,Ricke G,et al.Blackdead arm and basal canker of Vitis vinifera cv.Red Globe caused byBotryosphaeria obtusa in Chile.Plant Disease.2004,88(11):1286.URbez-Torres JR,Peduto F,Striegler R K,et al.Characterization of fungal pathogensassociated with grapevine trunk diseases in Arkansas and Missouri.FungalDiversity.2012:1-21.U Rbez-Torres J R,Gubler W D.Pathogenicity ofBotryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers inCalifornia.Plant Disease.2009,93(6):584-592.)。在我国已发现并报道的葡萄溃疡病病原菌有Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum parvum和Diplodia seriata四个种(Li X H,Yan J Y,Kong F F,et al.Botryosphaeriadothidea causing canker of grapevine newly reported in China[J].PlantPathology.2010,59(6):1170.Yan J Y,Peng Y L,Xie Y,et al.First Report ofGrapevine Trunk Disease Caused by Botryosphaeria obtusa in China[J].PlantDisease.2011,95(5):616.Yan J Y,Li X H,Kong F F,et al.Occurrence of GrapevineTrunk Disease Caused by Botryosphaeria rhodina in China[J].PlantDisease.2011,95(2):219.Yan J Y,Xie Y,Zhang W,et al.Species ofBotryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China.FungalDiverisity.2013,61:221-236.)。研究表明，在我国Neofusicoccum parvum主要分布在亚热带季风气候区，Botryosphaeria dothidea则在温带季风气候区和亚热带季风气候区均有分布，病原菌侵染葡萄后带来严重的损失(Yan J Y,Xie Y,Zhang W,et al.Species ofBotryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China.FungalDiverisity.2013,61:221-236.)。在实际生产中，葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)两种病原菌常混合侵染，带来更为严重的损失。
准确的早期诊断能够为病害有效防控提供依据。由于葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)常混合侵染，且侵染葡萄后引起的症状相似，很难区分，导致传统的早期诊断方法无法快速的得到准确结果。而常规的分子生物学技术——聚合酶链式反应(Polymerase chain react ion,PCR)技术则可以快速、准确的检测到微量病原菌的存在，已被广泛应用于动植物病害的诊断及病原菌的鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一组能够用于同时检测两种葡萄溃疡病菌-葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)的双重PCR引物以及一种操作简便、结果可靠的上述两种葡萄溃疡病菌的双重PCR检测方法。
基于上述发明目的，根据葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)EF延伸因子和β-tubulin序列上的差异位点，分别设计了上述两种病原菌的特异性引物，通过对PCR反应程序、体系的反复摸索，建立了这两种病原菌的双重PCR检测体系，能够将葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)快速准确的区分开来，对开展苗木带菌检测和葡萄园病原菌动态监测具有重要意义。
本发明所提供的检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。其能够同时用于检测葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)。
本发明的另一目的是提供一种同时检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)的试剂盒，包括所述的双重PCR引物组。
在本发明的一个技术方案中，所述试剂盒中还包括PCR反应试剂；所述PCR反应试剂包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、浓缩PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。其中，浓缩PCR缓冲液即为10×PCR缓冲液，是由100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2组成的溶液。
上述双重PCR引物组以及包括该引物组的试剂盒在检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)中的应用也属于本发明的保护范围。所述的检测优选为同时检测。
本发明还提供一种检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)的双重PCR检测方法，包括使用上述引物扩增待测样品。所述扩增过程中还使用PCR反应试剂。PCR反应试剂可以从商业途径获得，也可以自己配置。
本发明的技术方案包括以下步骤：
1)提取待测样品DNA，以该DNA为模板，用权利要求1所述的引物双重PCR扩增；
2)鉴定步骤1)所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个324bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)的样品，将扩增产物中含有一个212bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的样品。
PCR反应体系为25μL，包括：待测样品DNA(约5ng，终浓度0.2ng/μL)，B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R引物(10μmol/L)各0.5μL(即终浓度为0.2μmol/L)，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的终浓度均为2.5mmol/L，2.5μL 10×PCR缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/LKCl，15mmol/L MgCl2)和0.25μL Taq DNA聚合酶(5U/μL，添加终浓度为0.05U/μl)，其余部分用ddH2O补足；
PCR条件为：94℃预变性4min；30个循环的94℃30s，58℃30s和72℃20s；72℃延伸5min。
步骤2)中所述鉴定步骤1)PCR扩增产物的大小的方法是取5μL PCR产物用质量百分浓度为2％琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据有无扩增产物判定结果。
上述双重PCR引物可应用于检测引起葡萄溃疡病的病原菌Neofusicoccum parvum和Botryosphaeria dothidea，其中，本发明的双重PCR引物中的序列1和序列2能够在葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)特异性的扩增出324bp的产物，序列3和序列4能够在小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)特异性的扩增出212bp的产物。而且，本发明的双重PCR引物可以在菌量较少的情况下检测到病原菌的存在，实验证明，当待测样品浓度达10pg时即可检出，表明上述方法具有较高的灵敏性。并且，二者检测灵敏度相同，均为10-5μg/μL，即序列1和序列2组成的引物对葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)基因组DNA的检测灵敏度与序列3和序列4组成的引物对小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)基因组DNA的检测灵敏度相同，均为10-5μg/μL。这组引物可以在一个双重PCR反应中也可以在此浓度(10-5μg/μL)下分别检测到葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)的存在，这表明该组引物可以快速、准确、灵敏的确定葡萄苗木以及田间葡萄病样中的葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)，为苗木带菌检测和针对性防治这2种病原菌引起的葡萄溃疡病提供依据。
同时，由于本发明可以减少对葡萄溃疡病病原菌小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的鉴定时间，从而尽早的在带菌苗木和发病早期的病组织中检测到病原菌的存在，达到早期针对性防病的目的。
附图说明
图1为本发明的引物B.d-F/B.d-R特异性检测的结果，图中，泳道M为分子量Marker(DL2000plus DNA Marker)，泳道1-3分别为分离自不同地区的小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)菌株，4-5：葡萄溃疡病菌Lasiodiplodia theobromae；6-8；葡萄溃疡病菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)；9-10：葡萄溃疡病菌Diplodia seriata；11：葡萄穗轴褐枯病菌Alternaria viticola；12：葡萄枝枯病菌Neopestalotiopsis sp.；13：葡萄炭疽病菌Colletotrichum viniferum；14：葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea；15：葡萄白腐病菌Coniella diplodiella；16：葡萄蔓枯病菌Diaporthe eres：17是以ddH2O为模板的PCR扩增结果。
图2为本发明的引物N.p-F/N.p-R特异性检测的结果，图中，泳道M为分子量Marker(DL2000plus DNA Marker)，泳道1-3分别为分离自不同地区的小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)菌株，4-5：葡萄溃疡病菌Lasiodiplodia theobromae；6-8；葡萄溃疡病菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)；9-10：葡萄溃疡病菌Diplodia seriata；11：葡萄穗轴褐枯病菌Alternaria viticola；12：葡萄枝枯病菌Neopestalotiopsis sp.；13：葡萄炭疽病菌Colletotrichum viniferum；14：葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea；15：葡萄白腐病菌Coniella diplodiella；16：葡萄蔓枯病菌Diaporthe eres：17是以ddH2O为模板的PCR扩增结果。
图3为本发明的引物B.d-F/B.d-R灵敏性检测的结果，泳道M为分子量Marker(DL2000 DNA Marker)，泳道1-7分别是以浓度分别为1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6μg/μL葡萄溃疡病菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)基因组DNA为模板的PCR扩增产物。
图4为本发明的引物N.p-F/N.p-R灵敏性检测的结果，泳道M为分子量Marker(DL2000DNA Marker)，泳道1-7分别是以浓度分别为1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6μg/μL葡萄溃疡病菌小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)基因组DNA为模板的PCR扩增产物。
图5为本发明引物B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R的双重PCR反应验证结果，泳道M为分子量Marker(DL2000DNA Marker)，泳道1为以已知含有葡萄溃疡病菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)基因组DNA为模板的双重PCR扩增产物。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一组同时检测2种葡萄溃疡病菌的双重PCR引物及其检测方法
一、葡萄溃疡病菌Neofusicoccum parvum和Botryosphaeria dothidea双重PCR引物的获得
提取GeneBank中我国已报道的引起葡萄溃疡病菌的4个种(Botryosphaeriadothidea、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum parvum和Diplodia seriata)的EF延伸因子和β-tubul in序列(登录号分别为：JX462265；GU294727；KJ146834；KJ146833；JX462263；JX462272；JX462280；HQ288289；JX462291；GU294713；KJ146836；KJ146835；JX462289；JX462299；JX462306；HQ288254；JX521848)进行同源性比较。根据Botryosphaeria dothidea与其他3个种EF延伸因子序列上的差异位点设计出Botryosphaeria dothidea的特异性引物B.d-F/B.d-R，序列分别为上游正向引物B.d-F序列：5'-GTCTGCATCATTCTCAGCGTGGG-3'(序列表中序列1)；下游反向引物B.d-R序列：5'-TTACCCTCAGTGTAGTGACCCTTG-3'(序列表中序列2)。根据Neofusicoccum parvum与其他3个种β-tubul in序列上的差异位点，设计得到Neofusicoccum parvum的特异性引物N.p-F/N.p-R，序列分别为：上游正向引物N.p-F序列：5'-CTCGGCGGCTTCCTGGGAT-3'(序列表中序列3)；下游反向引物N.p-R序列：5'-CGCACTCAATTTGCCTTATCGCTTC-3'(序列表中序列4)。
二、本发明的用于葡萄溃疡病菌Neofusicoccum parvum和Botryosphaeriadothidea双重PCR引物的效果验证
1、引物合成
B.d-F/B.d-R引物：上游正向引物B.d-F序列：
5'-GTCTGCATCATTCTCAGCGTGGG-3'(序列表中序列1)；下游反向引物B.d-R序列：5'-TTACCCTCAGTGTAGTGACCCTTG-3'(序列表中序列2)；
N.p-F/N.p-R引物：上游正向引物N.p-F序列：
5'-CTCGGCGGCTTCCTGGGAT-3'；下游反向引物N.p-R序列：
5'-CGCACTCAATTTGCCTTATCGCTTC-3'，委托上海生工生物技术有限公司合成。
2、特异性引物B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R的准确性验证
2.1菌株的采集和鉴定
研究中所用菌株均采用常规组织分离法(方中达.植病研究方法[M].第三版.北京：中国农业出版社.1998：122-137.)分离自我国不同地区的葡萄病样上，获得了菌株的纯培养，并通过接种实验完成了柯赫氏法则的验证。菌株信息如下：
葡萄溃疡病菌分别为：3株Neofusicoccum parvum，3株Lasiodiplodiatheobromae；2株葡萄溃疡病菌Botryosphaeria dothidea，2株Diplodia seriata。其他菌株信息如下：2株葡萄穗轴褐枯病菌Alternaria viticola；2株葡萄枝枯病菌Neopestalotiopsis sp.；2株葡萄炭疽病菌Colletotrichum viniferum；2株葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea；2株葡萄蔓枯病菌Diaporthe eres。
2.2菌株的鉴定采用形态学鉴定和分子生物学鉴定
对上述菌株的鉴定采用形态学鉴定和分子生物学鉴定2种方法。首先观察28℃黑暗培养箱中培养3-7d的菌落形态，并在显微镜下观察产孢结构特征以及分生孢子形态和颜色等，对菌株种类进行初步确定。进一步采用PCR技术对菌株种类进行分子生物学鉴定，具体方法如下：
采用CTAB法提取菌株DNA，PCR扩增其rDNA—ITS区段用于菌株种类鉴定。PCR反应体系为：Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，10×缓冲液(含100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L Mg2+)2.5μL，dNTP(各2.5mmoL/L)2μL，10μmo1/L引物ITS1(序列为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(序列为：5’-TCCTCCGCTATGAATGC-3’)各0.5μL，模板5-20ng，用双蒸水将反应体系补充至25μL。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃30s，59℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物的检测：取5μL PCR扩增产物于0.8％的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE。电泳后的凝胶浸在0.5g/mL溴化乙锭染色液中染色l5-20min，清水冲洗后，置于UV紫外成像系统上观察成像，并拍照。
将条带清晰且大小正确的PCR产物送至北京博迈德基因技术有限公司做正反双向测序。将测序结果在NCBI网站上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)利用BLAST下的blastn模块与GenBank上已经发表的基因序列进行比对，确定菌株种类。
根据病原菌形态学特征及分子生物学实验结果，参照文献(Yan J Y,Xie Y,ZhangW,et al.Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback inChina.Fungal Diver is i ty.2013,61:221-236.Dissanayake A,Liu M,Zhang W，etal.Morphological and molecular characterization of Diaporthe speciesassociated with grapevine trunk disease in China.Fungal Biology.2015,283-294.Jayawardena R,Zhang W,Liu M,et al.Identification and characterization ofPestalotiopsis-like fungi related to grapevine diseases in China.FungalBiology.2015,348-361赵奎华.葡萄病虫害原色图鉴[M].北京：中国农业出版社.2006：12-17,30-41,50-57,74-77.)完成病菌种类鉴定。
各个菌株的鉴定结果表明，与2.1中柯赫氏法则鉴定结果一致。
2.3本发明的双重PCR方法鉴定
以上述菌株的基因组DNA为模板，分别以引物对B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R进行PCR扩增实验。以ddH2O为模板的PCR反应为阴性对照。
PCR反应体系为25μL，包括：待测样品DNA(5ng)，上游正向引物和下游反向引物终浓度均为0.2μmol/L，2μL dNTPs(即dATP、dCTP、dGTP、dTTP的终浓度各2.5mmol/L)，2.5μL10×PCR缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)和0.25μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)，其余部分用ddH2O补足。
PCR反应程序为：94℃预变性4min；35个循环的94℃30s，58℃30s和72℃30s；72℃延伸10min。
PCR扩增产物用质量百分浓度2％琼脂糖凝胶电泳分析。结果分别见图1和图2。图1结果表明供试的所有菌株中，只有3株Botryosphaeria dothidea扩增得到一条324bp的DNA特异性扩增片段，其余菌株中均扩增不到任何条带；同样地，在图2中可见，所有供试菌株中，除在3株Neofusicoccum parvum扩增到一条212bp的DNA特异性扩增片段外，其余菌株中均扩增不到任何条带。
上述结果表明，本发明对Botryosphaeria dothidea和Neofusicoccum parvum检测特异性100％。因此，引物对B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R特异性良好，可以分别用于Botryosphaeria dothidea和Neofusicoccum parvum的快速检测。
3、引物B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R的灵敏性验证
将菌株Botryosphaeria dothidea和Neofusicoccum parvum基因组DNA浓度调整为1μg/μL，按10的数量级逐步向下稀释至10-6μg/μL作为模板，分别以引物B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R进行PCR扩增，PCR体系和反应程序按照步骤2中所述，PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图3和图4，引物B.d-F/B.d-R对Botryosphaeria dothidea的检测灵敏度为10-5μg/μL，引物N.p-F/N.p-R对Neofusicoccum parvum的检测浓度也为10-5μg/μL。
4、引物B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R的双重PCR反应验证
PCR反应体系为25μL，包括：含有菌株Botryosphaeria dothidea和Neofusicoccumparvum的基因组DNA(1-10ng)，引物B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R终浓度均为0.2μmol/L，2μLdNTPs(即dATP、dCTP、dGTP、dTTP的终浓度各2.5mmol/L)，2.5μL 10×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)和0.25μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，其余部分用ddH2O补足。
PCR反应程序为：94℃预变性4min；35个循环的94℃30s，58℃30s和72℃30s；72℃延伸10min。PCR扩增产物用质量百分浓度2％琼脂糖凝胶电泳分析。结果见图5，利用引物B.d-F/B.d-R和N.p-F/N.p-R可以在一个双重PCR反应体系中分别检测到Botryosphaeriadothidea和Neofusicoccum parvum的存在。
利用该反应体系和反应程序对步骤2所述的菌株进行双重PCR检测，结果表明，供试的所有菌株中，只有3株Botryosphaeria dothidea扩增得到一条324bp的DNA特异性扩增片段，3株Neofusicoccum parvum扩增到一条212bp的DNA特异性扩增片段，其余菌株中均扩增不到任何条带。
同样，利用本发明的上述双重PCR反应体系和反应程序进行如步骤3)所述的灵敏度检测，结果表明，将Botryosphaeria dothidea和Neofusicoccum parvum均检出的DNA添加浓度为10-5μg/μL。

Claims (8)

1.一组检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。
2.根据权利要求1所述的检测葡萄溃疡病菌的双重PCR引物组，其特征在于：所述葡萄溃疡病菌为小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)。
3.一种同时检测葡萄溃疡病菌中的葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)的试剂盒，包括权利要求1或2所述的双重PCR引物组。
4.根据权利要求3所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
5.权利要求1或2所述的双重PCR引物组、权利要求3或4所述的试剂盒在检测小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)中的应用。
6.一种同时检测葡萄溃疡病菌中的小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)和葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的方法，包括下述步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的双重PCR引物组进行双重PCR扩增；
3)鉴定步骤2)所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个324bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)的样品，将扩增产物中含有一个212bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的样品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述双重PCR扩增的反应体系为25μL，包括：待测样品DNA 0.01-0.8ng/μL，序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸终浓度分别为0.2μmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dTTP的终浓度分别为2.5mmol/L，2.5μL 10×PCR缓冲液和Taq DNA聚合酶终浓度为0.05U/μl，其余部分用ddH2O补足；其中，10×PCR缓冲液是由100mmol/L Tr is-HCl pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2组成的溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：双重PCR反应条件为：94℃预变性4min；35个循环的94℃30s，58℃30s和72℃30s；72℃延伸10min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106478789B (zh) * 2016-12-19 2019-06-28 北京市农林科学院 来源于葡萄溃疡病菌的效应子蛋白及其编码基因和应用
CN106701968B (zh) * 2017-01-22 2020-07-28 北京市农林科学院 同时检测葡萄溃疡病菌和葡萄蔓枯病菌的引物及其应用
CN106701970A (zh) * 2017-01-22 2017-05-24 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法
CN107541560B (zh) * 2017-10-31 2020-06-16 青岛农业大学 用于溃疡病菌、褐斑病菌和丛枝病植原体的多重检测的核酸、试剂盒及方法
CN108374055A (zh) * 2018-05-22 2018-08-07 广西特色作物研究院 一种葡萄大褐斑病病原菌的pcr检测引物及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102747078A (zh) * 2012-07-03 2012-10-24 北京市农林科学院 葡萄溃疡病菌快速检测引物及其应用
CN104351259A (zh) * 2014-11-19 2015-02-18 广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所 一种葡萄溃疡病的生物防治方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102747078A (zh) * 2012-07-03 2012-10-24 北京市农林科学院 葡萄溃疡病菌快速检测引物及其应用
CN104351259A (zh) * 2014-11-19 2015-02-18 广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所 一种葡萄溃疡病的生物防治方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
葡萄溃疡病菌巢式PCR高效检测体系的建立;张玮等;《植物保护学报》;20121031;第39卷(第5期);第479-480页 *

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