CN108374055A - 一种葡萄大褐斑病病原菌的pcr检测引物及检测方法 - Google Patents

一种葡萄大褐斑病病原菌的pcr检测引物及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物及检测方法，属于分子生物学技术领域。所述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物,包括如SEQ ID NO.1所示的第一引物，以及如SEQ ID NO.2所示的第二引物。本发明还公开了利用上述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物检测葡萄大褐斑病病原菌的方法。本发明的PCR检测引物可以特异性扩增葡萄大褐斑病病原菌的靶标DNA片段，并通过琼脂糖凝胶电泳的分离结果，即有无产生目的扩增产物，来快速鉴定待检样品是葡萄大褐斑病病原菌阳性样品，还是葡萄大褐斑病病原菌阴性样品。

Description

一种葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物及检测方法
技术领域
本发明涉及一种葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物及检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
葡萄褐斑病又称叶斑病(leaf blight),是葡萄生产上的一种常见病害。根据病斑大小和病原物不同，分为大褐斑病和小褐斑病[1]。我国各地报道的褐斑病主要以大褐斑病为主，其病原为葡萄拟尾孢菌Pseudocercospora vitis(Lev)Speg.[2]，主要危害葡萄叶片，可造成叶片早期脱落，光合作用下降。
目前褐斑病的鉴别主要通过技术人员实地观察，主观性强。而传统的病原分离培养和鉴定虽然结果准确，但需要时间较长。
分子检测技术，直接锚定检测病害病原物的DNA，检测准确性极高且快速、灵敏，因此该技术目前普遍应用于植物病害病原物的快速检测。但是，目前尚未出现葡萄大褐斑病病原菌分子检测方法的相关报道。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物。本发明的PCR检测引物可以特异性扩增葡萄大褐斑病病原菌的靶标DNA片段，并通过琼脂糖凝胶电泳的分离结果，即有无产生目的扩增产物，来快速鉴定待检样品是葡萄大褐斑病病原菌阳性样品，还是葡萄大褐斑病病原菌阴性样品。此外，本发明的PCR检测引物不会对葡萄霜霉病、溃疡病、白粉病、灰霉病、枝枯病、炭疽病、皮尔斯病等葡萄的主要病害病原的DNA进行非特异性扩增，即该引物特异性强，检测结果可靠。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物,所述PCR检测引物包括如SEQ ID NO.1所示的第一引物，以及如SEQ ID NO.2所示的第二引物。
其中，第一引物(5′-3′)：cgcctggatctccgcttatt(SEQ ID NO.1)。
第二引物(5′-3′)：tctctggcttctgctggttg(SEQ ID NO.2)。
上述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物，是本申请的发明人根据GenBank数据库中已公布的葡萄大褐斑病病原Pseudocercospora vitis(Lev)Speg.的RNA聚合酶II基因的部分序列(GenBank登录号KX348076)而设计的。使用Primer3软件搜索适合设计引物的区域，参数设置如下：引物溶解温度(Tm)＝60℃±3℃，扩增产物片段大小为400bp-800bp，引物长度20bp±5bp，引物GC含量为40％-60％，引物3′端最大自我互补值为3，引物间3′端最大互补值为3。在搜索获得的引物对中，选择最优引物对即上述第一引物和第二引物。使用美国国立生物技术信息中心(NCBI)在线工具BLASTn，将第一引物和第二引物与GenBank数据库中的核苷酸序列进行比对，确认该引物对只能配对葡萄大褐斑病病原。
本发明的目的之二，是提供一种利用上述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物检测葡萄大褐斑病病原菌的方法。本发明采用上述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物，对待测样品通过一次常规的PCR扩增，即可通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示判定出待测样品是葡萄大褐斑病病原阳性样品，还是葡萄大褐斑病病原阴性样品。整个检测过程总共耗时不超过2个小时，且操作过程简单，具有广泛的应用前景。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种利用上述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物检测葡萄大褐斑病病原菌的方法，包括如下步骤：
步骤1：DNA提取
从待测样品的葡萄叶肉组织中提取DNA，得到待测样品的DNA模板；从健康葡萄的叶肉组织中提取DNA，作为阴性对照；从大褐斑病病原菌阳性的葡萄叶片病斑组织中提取DNA，作为阳性对照；
步骤2：PCR扩增反应
将步骤1得到的待测样品的DNA模板、阴性对照和阳性对照分别进行PCR扩增，并设置清水对照；
PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中：
反应条件为：94℃，预变性5min；94℃，45s，56℃，45s，72℃，1min；35个循环；72℃，10min；分别得到待测样品、阳性对照、阴性对照和清水对照的PCR扩增反应产物；
步骤3：结果判断
分别取步骤2得到的待测样品、阳性对照、阴性对照和清水对照的PCR扩增反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳分析，并根据是否扩增出条带来判定待测样品是葡萄大褐斑病病原菌阳性样品，还是葡萄大褐斑病病原菌阴性样品。
本发明的步骤2中，热启动Taq DNA聚合酶由日本TaKaRa公司生产。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤3中，所述“分别取步骤2得到的待测样品、阳性对照、阴性对照和清水对照的PCR扩增反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳分析”具体是指分别取5μL步骤2得到的待测样品、阳性对照、阴性对照和清水对照的PCR扩增反应产物，与1μL 6×DNA上样缓冲液混合均匀后，进行质量浓度为15g/L的琼脂糖凝胶电泳，电泳的电压为120V，时间为1h，同时设100bp梯度的DNA分子量标准作为片段大小衡量的标准。
更进一步，所述琼脂糖凝胶中含1×4S Green Plus无毒核酸染料。
上述无毒核酸染料由生工生物工程(上海)股份有限公司生产。
进一步，步骤3中，所述“根据是否扩增出条带而判定待测样品是否存在葡萄大褐斑病病原菌”具体是指阳性对照在550bp处出现1条扩增条带，阴性对照和清水对照在550bp处不出现扩增条带；当待测样品在550bp处出现1条扩增条带，则待测样品为葡萄大褐斑病病原菌阳性样品，当待测样品在550bp处不出现扩增条带，则待测样品为葡萄大褐斑病病原菌阴性样品。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的PCR检测引物可以特异性扩增葡萄大褐斑病病原菌的靶标DNA片段，并通过琼脂糖凝胶电泳的分离结果，即有无产生目的扩增产物，来快速鉴定待检样品是葡萄大褐斑病病原菌阳性样品，还是葡萄大褐斑病病原菌阴性样品。此外，本发明的PCR检测引物不会对葡萄霜霉病、溃疡病、白粉病、灰霉病、枝枯病、炭疽病、皮尔斯病等葡萄的主要病害病原的DNA进行非特异性扩增，即该引物特异性强，检测结果可靠。
(2)本发明采用上述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物，对待测样品通过一次常规的PCR扩增，即可通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示判定出待测样品是葡萄大褐斑病病原阳性样品，还是葡萄大褐斑病病原阴性样品。整个检测过程总共耗时不超过2个小时，且操作过程简单，具有广泛的应用前景。
(3)本发明提供了一种快速鉴定葡萄大褐斑病病原菌的方法，解决了现有技术的葡萄大褐斑病鉴定方法(如田间症状判断和病原分离纯化培养鉴定)准确性不高和效率低的问题。
附图说明
图1为本发明实施例1的葡萄大褐斑病病原PCR检测图。其中，M为100bp梯度的DNA分子量标准；1-10：夏黑葡萄褐斑病样品DNA提取物；11-20：巨峰葡萄褐斑病样品DNA提取物；21：葡萄霜霉病病原DNA样品；22：葡萄溃疡病病原DNA样品；23：葡萄白粉病病原DNA样品；24：葡萄灰霉病病原DNA样品；25：葡萄枝枯病病原DNA样品；26：葡萄炭疽病病原DNA样品；27：葡萄皮尔斯病病原DNA样品；28-29：清水对照；30-31：阴性对照；32：阳性对照。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物,所述PCR检测引物包括如SEQ ID NO.1所示的第一引物，以及如SEQ ID NO.2所示的第二引物。
其中，第一引物(5′-3′)：cgcctggatctccgcttatt(SEQ ID NO.1)。
第二引物(5′-3′)：tctctggcttctgctggttg(SEQ ID NO.2)。
上述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物，是本申请的发明人根据GenBank数据库中已公布的葡萄大褐斑病病原Pseudocercosporavitis(Lev)Speg.的RNA聚合酶II基因的部分序列(GenBank登录号KX348076)而设计的。使用Primer3软件搜索适合设计引物的区域，参数设置如下：引物溶解温度(Tm)＝60℃±3℃，扩增产物片段大小为400bp-800bp，引物长度20bp±5bp，引物GC含量为40％-60％，引物3′端最大自我互补值为3，引物间3′端最大互补值为3。在搜索获得的引物对中，选择最优引物对即上述第一引物和第二引物。使用美国国立生物技术信息中心(NCBI)在线工具BLASTn，将第一引物和第二引物与GenBank数据库中的核苷酸序列进行比对，确认该引物对只能配对葡萄大褐斑病病原。
实施例2
一种利用实施例1所述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物进行葡萄大褐斑病病原菌检测的方法，包括如下步骤：
步骤1：DNA提取
分别采集发生大褐斑病的夏黑葡萄和巨峰葡萄的病叶样品，每个品种各采集10份病样，每份病样含8张叶片。从保存于网室中的健康巨峰葡萄和发生褐斑病的巨峰葡萄上分别采集叶片样品，作为阴性对照和阳性对照。将采集的各叶片样品分别用清水冲净后再用干净的吸水纸擦干，取病斑组织(有症样品)或叶肉组织(无症样品)置于无菌的研钵中，加入液氮将植物组织研磨至粉末，称取50mg碾碎的组织，使用多糖多酚DNA提取试剂盒(由北京华越洋生物科技有限公司生产)提取总DNA。
收集葡萄霜霉病、葡萄溃疡病、葡萄白粉病、葡萄灰霉病、葡萄枝枯病及葡萄炭疽病的病原纯培养物，用真菌DNA提取试剂盒(由北京华越洋生物科技有限公司生产)提取总DNA；收集葡萄皮尔斯病病原纯培养物，用细菌基因组DNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总DNA。用紫外可见分光光度计对提取的总DNA浓度进行测定，并调节至100ng/μL。
步骤2：PCR扩增反应
将步骤1得到的待测样品的DNA模板、阴性对照、阳性对照以及上述葡萄霜霉病、葡萄溃疡病、葡萄白粉病、葡萄灰霉病、葡萄枝枯病、葡萄炭疽病及葡萄皮尔斯病的病原DNA提取物分别进行PCR扩增，并设置清水对照；
PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中：
反应条件为：94℃，预变性5min；94℃，45s，56℃，45s，72℃，1min；35个循环；72℃，10min；分别得到待测样品、阳性对照、阴性对照和清水对照的PCR扩增反应产物；
步骤3：结果判断
分别取5μL步骤2得到的待测样品、阳性对照、阴性对照、清水对照及其它七种葡萄病原的PCR扩增反应产物，与1μL 6×DNA上样缓冲液混合均匀后，进行质量浓度为15g/L的琼脂糖凝胶电泳，电泳的电压为120V，时间为1h，同时设100bp梯度的DNA分子量作为片段标准。将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中，观察分析并成像保存。结果如图1所示。
由图1可知，所有20个进行检测的葡萄褐斑病叶片DNA样品(夏黑葡萄和巨峰葡萄各10个)均出现了一条550bp大小的目的条带，葡萄褐斑病阳性DNA样品也出现了一条550bp大小的目的条带，而葡萄霜霉病、葡萄溃疡病、葡萄白粉病、葡萄灰霉病、葡萄枝枯病、葡萄炭疽病及葡萄皮尔斯病病原DNA样品以及健康葡萄植株DNA样品、清水对照均未产生任何条带(由图1所示)。由此表明，本发明的葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物及利用其检测葡萄大褐斑病病原菌的方法，可以特异性地检测葡萄大褐斑病病原菌，结果可靠且效率高。
参考文献
[1].古希昕,邓振权,崔辉华,等.葡萄病虫害及防治[M].北京：农业出版社,1991：56-59.
[2].梁春浩,刘长远,苗则彦,等.几种杀菌剂及混悬剂对葡萄褐斑病的生物活性测定[J].农药,2009,48(1):66-68.
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广西特色作物研究院
<120> 一种葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物及检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcctggatc tccgcttatt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctctggctt ctgctggttg 20

Claims (5)

1.一种葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物,其特征在于，所述PCR检测引物包括如SEQID NO.1所示的第一引物，以及如SEQ ID NO.2所示的第二引物。
2.一种利用权利要求1所述葡萄大褐斑病病原菌的PCR检测引物检测葡萄大褐斑病病原菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：DNA提取
从待测样品的葡萄叶肉组织中提取DNA，得到待测样品的DNA模板；从健康葡萄的叶肉组织中提取DNA，作为阴性对照；从大褐斑病病原菌阳性的葡萄叶片病斑组织中提取DNA，作为阳性对照；
步骤2：PCR扩增反应
将步骤1得到的待测样品的DNA模板、阴性对照和阳性对照分别进行PCR扩增，并设置清水对照；
PCR扩增反应体系总体积为25μL，其中：
反应条件为：94℃，预变性5min；94℃，45s，56℃，45s，72℃，1min；35个循环；72℃，10min；分别得到待测样品、阳性对照、阴性对照和清水对照的PCR扩增反应产物；
步骤3：结果判断
分别取步骤2得到的待测样品、阳性对照、阴性对照和清水对照的PCR扩增反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳分析，并根据是否扩增出条带来判定待测样品是葡萄大褐斑病病原菌阳性样品，还是葡萄大褐斑病病原菌阴性样品。
3.根据权利要求2所述的葡萄大褐斑病病原菌检测的方法，其特征在于，步骤3中，所述“分别取步骤2得到的待测样品、阳性对照、阴性对照和清水对照的PCR扩增反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳分析”具体是指分别取5μL步骤2得到的待测样品、阳性对照、阴性对照和清水对照的PCR扩增反应产物，与1μL 6×DNA上样缓冲液混合均匀后，进行质量浓度为15g/L的琼脂糖凝胶电泳，电泳的电压为120V，时间为1h，同时设100bp梯度的DNA分子量标准作为片段大小衡量的标准。
4.根据权利要求3所述的葡萄大褐斑病病原菌检测的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶中含1×4S Green Plus无毒核酸染料。
5.根据权利要求3所述的葡萄大褐斑病病原菌检测的方法，其特征在于，步骤3中，所述“根据是否扩增出条带而判定待测样品是否存在葡萄大褐斑病病原菌”具体是指阳性对照在550bp处出现1条扩增条带，阴性对照和清水对照在550bp处不出现扩增条带；当待测样品在550bp处出现1条扩增条带，则待测样品为葡萄大褐斑病病原菌阳性样品，当待测样品在550bp处不出现扩增条带，则待测样品为葡萄大褐斑病病原菌阴性样品。
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