CN103436608B - 基于核酸适体的快速检测方法及试剂盒 - Google Patents
基于核酸适体的快速检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了基于核酸适体的快速检测方法及试剂盒。本发明利用两种核酸适体，两种适体作用于同一靶标，一种用于纯化，另一种作为等温链置换扩增（stranddisplacement amplification，SDA）的模版以便进行扩增，最后对扩增得到的ssDNA进行快速检测。本发明方法具有操作简便，无需对待测样品进行复杂的前处理；检测成本低，对检测仪器的要求低，检测结果准确可靠，特别适用于基层及偏远地区使用。当本发明用于微生物检测时，免去了微生物的核酸提取，但同时实现核酸扩增，有利于实现微生物的定性和定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测方法，特别涉及一种基于核酸适体的快速检测方法。
背景技术
近年来，国内外的公共健康安全事件层出不穷，尤其是食源性病原微生物污染引起的食品安全事件，不仅严重影响了市场秩序，而且还给公众带来了无处不在的恐慌。根据世界卫生组织的统计，有三分之一的发达国家居民每年会出现食源性疾病感染症状，而这个比例在发展中国家则高达二分之一，全球每年发生300-1000万件食源性疾病死亡案例。此外，由于地震、洪水等灾害事件影响，污水淤积、开放式垃圾堆等因素都极有利于细菌等病原微生物的滋生，这些因素都大大提高了灾区传染病暴发流行的可能性灾情发生。因此，发展简易、 快速的病原微生物检验方法对于公众健康和食品安全监管非常重要。
目前病原微生物常见的检测方法包括微生物培养法、免疫学方法、和分子检测方法。传统的微生物培养法耗时较长、效率较低；而免疫学检测方法灵敏度不足；分子检测方法是直接对病原体的核糖核酸或脱氧核糖核酸的检测，无论是在定性或者定量方法都有一定的优势。尽管核酸检测方法具有高灵敏度、高特异性的优点，但是它们需对病原微生物的核酸进行提取，操作繁琐，而且需要特殊的仪器用需要专业的培训。此外，核酸检测方法只针对残留的核酸，不能精确反应病原微生物的完整性，在病原体死亡破碎的情况下仍能检测出假阳性结果。因此，人们仍然需要寻找快速、灵敏、低成本、操作简易的检测工具。
核酸适体（aptamer）指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。
核酸适体（Aptamer）是一类新型的识别分子，其分子量较低（15-50碱基），没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输。核酸适体是以SELEX 技术，通过重复选择的过程从化学合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的。用以筛选核酸适体的靶物质有蛋白质、多肽、糖、核酸、有机小分子、离子、细胞以及病毒颗粒等，理论上任何分子都能找到其相应的适体。当以纯的靶分子筛选，可得到多种特异的适体，利用这些适体就可以建立该分子的系列分析方法；当以肿瘤细胞为靶物质，则可同时筛选到细胞表面多种靶分子的特异适体，而无需事先了解这些靶分子，得到的适体则可作为分子探针检测特定肿瘤，同时还可用来纯化、鉴定其靶分子从而发现新的生物标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于核酸适体的快速检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
基于核酸适体的快速检测方法，包括如下步骤：
1) 设计得到两种针对待检物的核酸适体，记为A1和A2，在A1的5’端连接有等温链置换扩增引物序列及切刻酶识别位点，在A2的一端修饰有分离标记，得到修饰后的核酸适体A1和A2；
2) 将修饰后的核酸适体A1和A2与样品混合，充分反应，之后利用A2上的分离标记将样品富集、分离，得到浓缩样品；
3) 将浓缩样品置于含有切刻酶的等温链置换扩增反应体系中进行等温扩增；
4) 检测扩增得到的ssDNA的量，确定待检物的浓度。
分离标记选自特异性小分子标记、固相载体。
作为本发明的进一步改进，使用单链核酸快速检测试纸检测扩增产物中是否存在扩增得到的ssDNA。
作为本发明的进一步改进，等温链置换扩增反应体系中的等温链置换酶为无外切核酸酶活性的嗜温 DNA 聚合酶。
一种快速检测试剂盒，包括如下组分：
1) 两种针对待检物的修饰核酸适体A1和A2，A1的5’端连接链置换扩增引物序列及切刻酶识别位点，A2的一端修饰有分离标记；
2) 用于扩增A1的等温链置换扩增反应体系，所述等温链置换扩增反应体系中含有切刻酶；
3) 用于检测扩增产物ssDNA的核酸快速检测试纸。
分离标记选自特异性小分子标记、固相载体。
作为本发明的进一步改进，等温链置换扩增反应体系中的等温链置换酶为无外切核酸酶活性的嗜温 DNA 聚合酶。
本发明的有益效果是：
本发明方法具有操作简便，无需对待测样品进行复杂的前处理；检测成本低，对检测仪器的要求低，检测结果准确可靠，特别适用于基层及偏远地区使用。
特别的，当本发明用于微生物检测时，免去了微生物的核酸提取，但同时实现核酸扩增，有利于实现微生物的定性和定量分析。
附图说明
图1是本发明方法的检测原理示意图；
图2是不同浓度沙门杆菌的检测结果；
图3是不同菌株的检测结果图。
具体实施方式
本发明利用两种核酸适体，两种适体作用于同一靶标，一种用于纯化，另一种作为等温链置换扩增（strand displacement amplification，SDA）的模版以便进行扩增，最后对扩增得到的ssDNA进行快速检测。
基于核酸适体的快速检测方法，包括如下步骤：
1) 设计得到两种针对待检物的核酸适体，记为A1和A2，在A1的5’端连接有等温链置换扩增引物序列及切刻酶识别位点，在A2的一端修饰有分离标记，得到修饰后的核酸适体A1和A2；
2) 将修饰后的核酸适体A1和A2与样品混合，充分反应，之后利用A2上的分离标记将样品富集、分离，得到浓缩样品；
3) 将浓缩样品置于含有切刻酶的等温链置换扩增反应体系中进行等温扩增；
4) 检测扩增得到的ssDNA的量，确定待检物的浓度。
切刻酶可特异性识别并切割其识别位点，可以使用的切刻酶包括但不限于Nt.BstNBI、Nb.BtsI、Nb.BsmI、Nb.BbvCI、Nt.BsmAI。
分离标记为能与特异性结合能力的小分子，或固相载体，特异性小分子包括但不限于生物素（biotin）、地高辛（digoxin）、组氨酸、荧光分子（CY-5，CY-3，FITC，FAM等），固相载体可以是磁珠、微球、微孔板等。
为保证检测效果，适体上连接的等温链置换扩增引物序列的互补引物序列与核酸适体无互补片段。
等温链置换扩增为一种类似与PCR类似的扩增技术，但其引物的引入采用酶切及链置换实现，而不需要进行温度的梯度变化。其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。普通的SDA均采用内外两对引物的方式，产生的是双链DNA。本发明采用的是单向SDA，采用单引物法，最终形成的是单链DNA产物，该产物能配合胶体金层析试纸进行快速检测。
因为5′→3′ 外切核酸酶活性能使引物-靶核酸杂交链的5′端降解，而3′→ 5′外切核酸酶活性则能降解单链引物和最终的扩增产物。因此，为了取得更好的检测效果，本发明所使用的扩增酶为无外切核酸酶活性均缺乏的嗜温 DNA 聚合酶。具有这种特性的扩增酶有klenow 片段 (3′→ 5′ exo-), T7 DNA 聚合酶和phi29 DNA 聚合酶等。
下面结合附图，进一步说明本发明的检测原理。
参照图1，扩增核酸适体（Amplify aptamer，A1）的由5’到3’依次为引物序列、切刻酶识别位点和特异性识别序列；捕获核酸适体（Capture aptamer，A2）上修饰有特异性分离基团（如生物素）；A1和A2与样品混合后，特异性结合在待检物上；将混合后的样品与修饰后的磁珠（如SA修饰）混合，借助A2上分离基团与磁珠上基团之间的特异亲和作用（如生物素-SA之间的特异性亲和作用），将待检细菌富集在磁珠上；分离磁珠洗脱核酸适体，加入等温链置换扩增反应体系，在引物的作用下，对A1进行等温扩增；切割酶识别切割位点，将扩增的新DNA链切割，切割得到的ssDNA（单链DNA）缺乏引物序列，无法被进一步扩增，在反应体系中累积，得到大量ssDNA，这些ssDNA可进一步通过成熟的单链核酸快速检测试纸进行检测。
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
沙门菌S.Typhimurium的快速检测
核酸序列的设计
本实施例中所使用的核酸适体在能结合沙门杆菌表面蛋白的核酸适体基础上改进得到，具体序列如下：
核酸快速检测试纸的制备
1) 胶体金的制备
a) 向250ml的圆底烧瓶中称取100g 0.01%的HAuCl4溶液，磁力搅拌加热至沸腾；
b) 然后向上述溶液中迅速加入4ml 1%的柠檬酸三钠，溶液变为红色后，继续煮沸10min，停止加热继续搅拌直至冷却；
c) 胶体金溶液4℃避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度值鉴定。
2) 金标核酸的制备
a) 用100μl 去离子水溶解1 OD 核酸序列（取核酸序列3和5，按7:3的摩尔比列混合，浓度为1 OD），加入到1ml 5倍体积浓缩的胶体金溶液中， 4℃ 24小时；
b) 1%的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入NaCl和1%的SDS，分别至终浓度为0.15M和0.01%，4℃ 过夜；
c) 11500转/分钟离心20分钟，弃上清，沉底用500μL重悬液（20 mM Na3PO4, 5% BSA, 0.25% Tween, 和10% 蔗糖）重悬，重复洗三遍后用200μL的重悬液重新悬浮，制成悬浮液。
3) 样品垫的处理
玻璃纤维浸泡含有pH9.0，4.0% TritonX-100、100mM 硼酸、3%PEG4000、1%BSA、2%蔗糖，0.1% SDS，50.0nM竞争DNA探针（AGCTACGAGTTGAGA（SEQ ID NO：7）), 0.5 μg/ml鲑鱼精DNA的溶液后，37℃烘干备用。
4) 金标垫处理
将本发明制备的金标核酸序列涂于玻璃纤维上，37℃干燥2个小时，制成金标垫，备用。
5) 硝酸纤维素膜上质控线和检测线的处理
a) 用32μl 去离子水溶解1OD的核酸序列6，使其浓度为100μM；
b) 取15μl 100μM的核酸序列6，加入15μl（1mg/ml）链和亲霉素，室温下反应2小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜质控线上，37℃干燥两个小时。
6) 胶体金试纸条的组装
将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。
上述核酸快速检测试剂的制备方法仅为示例性说明，本领域的技术人员亦可以采用其他公知方法制备得到。
检测
1) 样品预处理
将组织破碎，用组织匀浆器匀浆，准确称取1g均质后的组织样本，用8 mL磷酸缓冲液PBS稀释，再用滤纸过滤。
2) 核酸适体杂交
将两种核酸适体分别用PBS溶解成100μM后，加入到1mL上述过滤的溶液中，室温孵育20min。
3) 病原体纯化
a) 首先用EDC法将链霉亲和素与羧基化的磁珠进行偶联，清洗后用于下一步反应；生物素修饰的C-aptamer则由上海生工直接合成；
b) 将过量的C-aptamer与样品及适量磁珠在PBS中混合，混合液置于磁架上静置3min，其后吸取并弃上清，再用PBS重悬和清洗3次。
4) A-aptamer的扩增
用10μL去离子水重悬上述沉淀，其后加入10×扩增缓冲液，最终体系含有1 U Nb. BsmI, 5 U polymerase Klenow fragment exo-，50 μM dNTPs，1 μM 引物，并调整到20μL。该体系置于50℃水浴锅反应15min。
5) 产物检测
上述扩增产物用40μL稀释后加到核酸检测卡样品垫上，5min后读取检测结果。结果显示该方法能检测到1CFU/mL的沙门菌S.Typhimurium （图2），且与其他菌无交叉，具有很高的特异性和灵敏度（图3）。
上述仅为本发明检测方法的一个示例，基于本发明的构思，本领域的技术人员可以将于应用于其他大分子、微生物、特种细胞的检测。
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> 基于核酸适体的快速检测方法及试剂盒
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcggcaacaa ggtcacccgg agaagatcgg tggtcaaact gcataggtag tccagaagcc 60
gaacaagctg aggatgaaga acaacggct 89
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<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcggcaacaa ggtcacccgg agaagatcgg tggtcaaact gcataggtag tccagaagcc 60
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tagtccagaa gccgaacaa 19
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agctacgagt tgaga 15
Claims (6)
1.基于核酸适体的快速检测方法，包括如下步骤：
1)设计得到两种针对待检物的核酸适体，记为A1和A2，在A1的5’端连接有等温链置换扩增引物序列及切刻酶识别位点，在A2的一端修饰有分离标记，得到修饰后的核酸适体A1和A2；
2)将修饰后的核酸适体A1和A2与样品混合，充分反应，之后利用A2上的分离标记将样品富集、分离，得到浓缩样品；
3)将浓缩样品置于含有切刻酶的等温链置换扩增反应体系中进行等温扩增；
4)检测扩增得到的ssDNA的量，确定待检物的浓度。
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于：分离标记选自特异性小分子标记、固相载体。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测方法，其特征在于：使用单链核酸快速检测试纸检测扩增产物中是否存在扩增得到的ssDNA。
4.一种快速检测试剂盒，包括如下组分：
两种针对待检物的修饰核酸适体A1和A2，A1的5’端连接链置换扩增引物序列及切刻酶识别位点，A2的一端修饰有分离标记；
用于扩增A1的等温链置换扩增反应体系，所述等温链置换扩增反应体系中含有切刻酶；
用于检测扩增产物ssDNA的核酸快速检测试纸。
5.根据权利要求4所述的快速检测试剂盒，其特征在于：分离标记选自特异性小分子标记、固相载体。
6.根据权利要求4所述的快速检测试剂盒，其特征在于：等温链置换扩增反应体系中的等温链置换酶为无外切核酸酶活性的嗜温 DNA 聚合酶。
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150225 Termination date: 20150808 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |