CN1875117A

CN1875117A - 对核酸和蛋白质的实时检测

Info

Publication number: CN1875117A
Application number: CNA2004800322508A
Authority: CN
Inventors: 韩勉基
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-11-25
Filing date: 2004-11-24
Publication date: 2006-12-06
Anticipated expiration: 2024-11-24
Also published as: EP1687450A4; WO2005052127A3; US20050214809A1; CN1875117B; WO2005052127A2; KR101041106B1; CA2541969A1; KR20050050390A; EP1687450A2

Abstract

本发明提供了一种用于实时检测独立目标核酸或者连接到二级结构上的目标核酸的方法，其通过信号扩增(直接检测)或者通过检测作为扩增程序对象的目标核酸序列。在同质或者非同质系统的等温或者非等温环境中，将含有可检测标记的探针杂交到独立目标核酸或者连接到二级结构上的目标核酸，以提供对目标核酸和/或目标核酸所连接的二级结构存在的确认。

Description

对核酸和蛋白质的实时检测

对相关申请的交叉参考

本发明根据35U.S.C.119(a)，要求韩国专利申请No.10-2003-0084116的优先权，其于2003年11月25日向韩国专利局提交，这里对其全部内容作为参考文献加以引用。

发明领域

本发明整体上涉及生物化学和分子生物学领域，特别的涉及对核酸反应的实时检测。更特别的，本发明涉及核酸探针及其用于核酸反应中以检测特异性核酸序列、连接到第二分子上的核酸序列和/或含有单核苷酸多态性的核酸序列的方法。

发明背景

特异性检测核酸和蛋白质的方法已经成为科学研究的基础方面。检测和鉴定某些核酸区域和蛋白质的能力已经使研究人员可以确定何种遗传和生物学标记是人类医学状况的指示。这种能力已经导致开发体外诊断试剂盒和用于从环境样品中检测和鉴定病原体和生物战试剂的试剂盒。体外诊断工业的产品通常落入下列的方法类别：临床化学、微生物学、核酸测试、细胞分析、血液学、血库、止血以及免疫组织化学。这些产品已经具有广泛的应用，其包括传染性疾病、糖尿病、癌症、药物测试、心脏疾病以及对病原体的环境检测。

诊断工业已经由传统的免疫化学测试方法占据主导地位并以微生物学为目标。然而，这些测试正逐渐被更快速和更有效的分子诊断测试所代替。随着集中于了解人类基因组的大量研究的展开，用于分子测试的新的目标正在被发现。由于来自于人类基因组的大量信息开始产生商业诊断方案，因此人们希望在核酸测试市场上可以出现最强的进展。由于已经鉴定了数百万的单核苷酸多态性(SNP)，因此诸如基于其基因组成进行药理基因组学表达谱以及评定何种治疗性药物最适合患者的实施例可以变成可能。

核酸扩增方法已经对核酸测试进行了彻底改革。这些方法例如聚合酶链式反应(PCR)(Mullis，Cold Sring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263～273(1986))、链置换扩增(SDA)(Walker，Little，Nadeau和Shank，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392～396(1992)；Walker，Fraiser，Schram，Little，Nadeau和Malinowski，Nucl.Acids Res.20：1691～1696(1992))、连接酶链式反应(LCR)(Wu和Wallace，Genomics 4：560～569(1989)，Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189～193(1991)；Barany，PCR Methods Appl.1：5～16(1991))、基于核酸序列的扩增(NASBA)(Kwoh，Davis，Whitfield，Chappelle，DiMichele和Gingeras，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173～1177(1989)；Guatelli，Whitfield，Kwoh，Barringer，Richman和Gingeras Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874～1878(1990)；Compton，Nature 350：91～92(1991))以及滚环扩增(RCA)(Fire和Xu，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4641～4645(1995)；Liu，Daubendiek，Zillman，Ryan和Kool，J.Am.Cliem.Soc.118：1587～1594(1996)；Lizardi，Huang，Zhu，Bray-Ward，Thomas，Ward，Nature Genet.19：225～232(1998)；Banér，Nilsson，Mendel-Hartvig和Landegren，Nucl.Acids Res.26：5073～5078(1998))。目前使用和开发的多种临床诊断测试是基于这些扩增方法所提供的极端灵敏性。这些测试已经能够将检测所需时间从几天或者几星期显著地降低到几个小时，而同时保持诊断测试所需的特异性水平。

核酸扩增反应的传统检测方法是本领域技术人员所熟知的。这些检测方案通常是劳动密集型扩增后程序，其需要电泳或者利用探针和/或印迹技术。这类方法的例子有酶联凝胶分析、基于酶珠的检测、电致化学发光检测、荧光关联光谱以及微量滴定板夹心杂交，在文献中已经对所有这些进行了广泛的描述。然而，这些方法是异质的(heterogeneous)，需要额外的样品操作，其消耗时间且倾向于交叉污染。目前在同质封闭试管系统中使用目标扩增检测产品的能力可以节省时间，促进大规模筛选和自动化操作并且减少交叉污染的机会，以及带来在诊断检测中所期望的优点。

在最近几年中，已经开发了大量的DNA诊断系统，其可以实时检测扩增的产品，而不打开反应容器。这些同源的(homogeneous)系统已经基于分子能量转移机制例如荧光共振能量转移(FRET)。这些方法通过使用杂交探针对扩增产物进行检测。最多被描述的核酸实时检测方案是对聚合酶链式反应(PCR)的检测。这些方案是基于荧光探针，其在不结合到目标时会形成二级结构，发生荧光淬灭。荧光信号的增强是探针在标准的时间点杂交到每个扩增的产物的结果(Taqman(Holland，Abramson，Watson和Gelfand，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7276～7280(1991)；Heid，Stevens，Livak和Williams，Genome Res.6：986～994(1996))、分子信标(Tyagi和Kramer，Nat.Biotechnol.14：303～308(1996))、蝎子引物(Whitcombe，Theaker，Guy，Brown和Little Nat.Biotechnol.17：804～807(1999))。荧光的增强是探针在杂交之后去折叠或者在杂交到扩增产物后被Taq聚合酶切割的结果。对扩增产物的检测存在扩增子对探针一对一的关系。在任何给定的循环下，一个扩增子得到一个探针(也就是分子信标、Taqman探针等)，且可通过探针的杂交和/或切割来对其进行检测。

目前利用分子信标的扩增来检测核酸序列依赖性扩增(NASBA)产物的实时方法也已经被描述(Leone，van Schijndel，van Gemen，Kramer和Schoen，Nucl.Acids.Res.26：2150-2155(1998))。探针是基于荧光共振能量转移(FRET)的原理设计，其被荧光供体(donor)和淬灭子(quencher)所标记。在不与目标序列杂交时，探针形成发夹结构，供体荧光会由于荧光基团与淬灭子距离非常接近而被淬灭。当发生产物的扩增时，探针杂交到扩增的目标DNA序列上，这使得荧光供体和淬灭子分开，从而在封闭试管实时模式中可以检测到可观察到的荧光信号。

同步的和同质的链置换扩增(SDA)反应和检测方法已经被描述，其中利用了荧光极化(Spears，Linn，Woodard和Walker Anal.Biochem.247：130-137(1997))或者荧光共振能量转移(FRET)(Nadeau，Pitner，Linn，Schram，Dean和Nycz Anal.Biochem.276：177～187(1999))。在这两种情况下，内部引物被荧光标记和设计成结合到目标链的中间区域。在前者中，引物不被用作扩增引物，因为其缺少可切除缺口的限制性位点。这种探针杂交到产物上的结果是探针平均旋转相关时间的提高并形成检测的基础。通过FRET分析，通过延伸上游引物，探针得到延伸和替换。接着，替换的探针作为下游引物的模板，并形成了双链可切割的产物。在两条链中这种产物被切掉导致了荧光强度的提高。

扩增的滚环扩增(RCA)产物之前通过加入半抗原标记或者荧光标记的核苷酸或者通过荧光标记或者酶标记的互补寡居核苷酸进行检测。Thomas等人(Thomas，Nardone和Randall，Arch.Pathol.Lab Med.123：1170～1176(1999))证明了使用开环探针、指数RCA和Amplifluor检测探针，在同质闭合试管模式中达到了1小时内10个目标分子和10⁷倍扩增的灵敏度。在使用实时仪器时，该反应是定量的，并在科研和诊断应用中具有很大的希望。

所有前面提到的实时方案，其有几大缺点：1)探针依赖二级结构的形成以淬灭供体荧光，这样信标的解链温度被严格控制。在等温的反应例如依赖核酸序列的扩增(NASBA)和滚环扩增(RCA)的情况下，这可能是困难的。信标必须要被设计成在反应温度下去折叠以结合到目标序列上，同时在不杂交时维持发夹结构。这可能导致增加了探针设计的困难以及增加了与信号-噪音相关的问题，因为探针通常会由于信标在反应温度下的去折叠而放出背景荧光；和2)探针与目标序列的杂交所提供的信号完全是目标序列扩增的结果。由于一对一杂交的比例，检测的限制性因素完全依赖于扩增的速率。因此，检测的速率被荧光探针自身的检测极限(通常为fmol水平)所限制。更低水平的试剂需要更多的时间来产生充分水平的扩增子以进行检测。

这样，本领域在分析时需要通过扩增目标核酸和检测信号以提高核酸检测的速率和灵敏性。

检测蛋白质的能力是诊断工业中的主要方面和最大的市场。其应用范围为从生物战暴露的早期检测到疾病的前表型诊断以及监控治疗过程。另外，作为各种基因组计划的结果，已经鉴定了新的开放阅读框(ORF)，而其蛋白质产品还没有被鉴定。通常使用的方法例如2-D凝胶电泳和酶联免疫吸附分析，缺乏特异性和灵敏性，而质谱分析尽管非常灵敏，但是需要复杂的设备并且目前不适合程序性或者高通量应用。相反，为检测核酸序列所开发的方法提供了优异的速率、灵敏性和特异性。单克隆抗体由于其特异性和亲合力，是目前最广泛使用的蛋白质检测的载体。最近开发的核酸适体(aptamer)，是表现出治疗靶准确性特征的小分子，它可以提供与酶活性、蛋白质-蛋白质相互作用以及信号级联反应的干涉，展示出在这个领域的应用前景，但与所建立的单克隆抗体生产的方法相比，开发它们目前是耗时和草率的。由于抗体提供了蛋白质鉴别，因此需要的是产生和扩增与抗原结合相关的二级信号的方法。目前，已经涉及了将抗原检测的特异性与核酸扩增的速率和便利结合的方法。这些方案目前在特异性、低水平蛋白质检测方面表现出最大的希望。目前有五种高敏感性蛋白质检测方法，其将特异性结合体与可扩增材料相结合。这些方法是免疫-聚合酶链式反应(I-PCR)、通过T7RNA聚合酶的免疫检测扩增(IDAT)、依赖接近的DNA连接(PDL)、免疫链置换扩增(I-SDA)以及免疫-滚环扩增(I-RCA)。

免疫-聚合酶链式反应(I-PCR)已经被用于检测腮腺炎-IgG(McKie，Samuel，Cohen和Saunders J.Immunol.Methods.270：135～141(2002))、肉毒杆菌毒素(Wu，Huang，Lai，Huang和Shaio Lett.Appl.Microbiol.5：321～325(2001))、肿瘤坏死因子(Saito，Sasaki，Araake，Kida，Yagihashi，Yajima，Kameshima和Watanabe Clin.Chem.45：665～669(1999))和乙肝病毒表面抗原(Maia，Takahashi，Adler，Garlick和Wands J.Virol.Methods 53：273～286(1995))。这种程序将双链DNA连接到检测物抗体上。在结合后，通过任何使用者确定的方式进行聚合酶链式反应(PCR)以指数扩增核酸目标序列，接着对其进行定量。所扩增产物的浓度与最初的核酸浓度直接相关，并与被抗体最初结合的蛋白质的浓度间接相关。

在双链寡聚物结合到第二抗体上方面，T7 RNA聚合酶的免疫检测扩增(IDAT)和免疫-聚合酶链式反应(I-PCR)是相似的，但这种寡聚物含有T7RNA聚合酶启动子。在等温条件下，T7 RNA聚合酶结合到启动子上以重复合成核糖核酸(RNA)分子(Zhang，Kacharmina，Miyashiro，Greene和EberwineProc.Natl.Acad.Sci.USA 98：5497～5502(2001))。这种行为导致了依赖于最初模板数的线性扩增。

由Becton Dickinson开发的免疫链置换扩增(I-SDA)是等温的序列特异性的扩增平台，其也需要连接到检测子抗体上的双链脱氧核糖核酸(DNA)。SDA依赖两种酶的活性：核酸外切酶缺陷型聚合酶以及限制性核酸内切酶。在有硫醇化脱氧核苷酸三磷酸(thio-dNTP)时，使用两条引物和聚合酶的外片段(exo-fragment)来产生限制性位点。这导致产生了双链半硫代磷酸酯限制性位点，其被限制性酶切开缺口，但没有切开互补的硫醇化链(Walker，Frasier，Schram，Little，Nadeau和Malinowski Nucl.Acids Res.20：1691～1696(1992))。通过限制性酶的解链，外-聚合酶在切开缺口的引物上起始了DNA的合成，这可以进行目标的指数扩增，同时替换了先前合成的链。切开缺口、链置换以及引物杂交循环是连续的并产生大量期望的目标序列。

依赖接近的DNA连接(PDL)与其它方法的不同之处在于使用核酸代替抗体作为抗原检测的中介物(Fredriksson，Gullberg，Jarvius，Olsson，Pietras，Gustafsdottir，Ostman和Landegren Nat.Biotechnol.5：473～477(2002))。这些核酸(探针)被称作核酸适体，其是通过体外选择与目标分子有高亲合力的程序来得到的。标准的PDL需要结合到感兴趣蛋白质的不同区域的两个核酸适体，以及作为杂交序列的第三寡聚核苷酸链。每个核酸适体由下列组成：结合区域，其接着聚合酶链式反应(PCR)的引物位点以及最后与杂交序列互补的片段。通过结合，一个核酸适体的3′末端与另一个的5′末端通过退火至杂交链上相毗邻的位置，其中两个末端被退火。一旦结合，使用两个所包含的引物位点进行PCR。

免疫-滚环扩增(I-RCA)可以用于以线性动力学为基础的在等温条件下复制环化的寡聚核苷酸(Fire和Xu Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4641～4645(1995)；Liu，Daubendiek，Zillman，Ryan和Kool J.Am.Chem.Soc.118：1587～1594(1996))。在这项程序中，环化的模板被杂交到单链引物上。通过加入单链置换DNA聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，在几分钟内产生了数百个串联的模板拷贝(Schweitzer和Kingsmore Curr.Opina.Biotechnol.12：21～27(2001)；Lizardi，Huang，Zhu，Bray-Ward，Thomas和Ward，Nat.Genet.19：225～232(2001))。对于I-RCA，引物的5′末端被结合到第二抗体上，最终的延伸产物被结合到引物的3′末端上(Schweitzer，Wiltshire，Lambert，O′Malley，Kukanskis，Zhu，Kingsmore，Lizardi和Ward Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：10113～10119(2000))。

已经开发了用于前述程序的实时检测方案。这些方案基于检测荧光信号的增强，这是在所监测时间点探针杂交到每个扩增的核酸产物的结果。因此，尽管它们大大地提高了蛋白质检测的灵敏度，但它们在探针设计的限制、最佳反应速率以及将信号扩增最大化方面，具有与前面所述实时核酸检测相同的缺点。

因此，希望提供一种精确和灵敏的实时蛋白质检测分析方法，该方法同时能提高速率和增强自动化能力。

发明内容

因此，本发明通过提供检测目标DNA或者RNA的实时方法克服了在先技术的缺点。在本发明的第一个方面中，提供了一种方法，其包括在使探针能够杂交到靶上的特异性序列的条件下形成反应混合物，该混合物包括目标核酸和探针。形成靶-探针后，在特异性位点对探针进行切开缺口或者切割，这样能够形成探针片段，该探针片段从目标核酸解离出来，另一个探针可以与目标核酸杂交。探针片段的解离使得检测可以进行，即可以对目标核酸分子进行检测。

本发明的一个目的是可以在目标核酸被扩增和所述探针杂交到所扩增产物上的特异性序列的条件下，通过实时、同质模式检测目标DNA或者RNA，其中反应混合物包括目标核酸和探针。在特异性位点出现对探针的切开缺口或者切割，这样形成了探针片段，探针片段从目标核酸解离下来，另一个探针则可以与目标核酸杂交。探针片段的解离使得检测可以进行，即可以对目标核酸分子进行检测。

在本发明的第二个方面中，提供了一种检测目标抗原表面上抗原决定簇、分子区域的方法，例如蛋白质和/或糖类。该方法包括形成反应混合物，该混合物含有与目标抗原决定簇有高亲合力以及特异性的核酸适体。需要理解的是反应混合物可以含有至少两个核酸适体以与抗原决定簇结合。进一步地，核酸适体与目标核酸序列结合，该目标核酸序列与反应混合物内的探针互补。在核酸适体与目标抗原决定簇结合后，该探针杂交到目标序列上。接着探针被切割形成探针片段并基于它们的结构从目标核酸上解离出来，这样就可以对之进行检测。对探针片段的检测提供了存在目标抗原决定簇的暗示/检测。

本发明的一个目标是将前述的目标核酸序列连接到核酸扩增方法中以进行抗原决定簇的检测。该探针杂交到扩增的核酸产物上，在使用切割试剂进行切出缺口或者切割后，形成了探针片段，其从所扩增的目标核酸序列解离出来，并且另一个探针可以杂交到所述的序列上。通过所解离的探针片段，可以检测抗原决定簇。

本发明的进一步目标是检测目标蛋白质和/或抗原的存在。利用可以与目标蛋白质和/或抗原特异性的抗体结合的目标核酸序列，探针被杂交到目标核酸序列上。然后所杂交的靶-探针复合物可以与一种切割试剂接触，探针被切割后产生至少两个探针片段。通过应用蛋白质和/或抗原，探针片段从目标序列上解离出来。进一步需要理解的是，对探针片段的检测提供了对结合目标核酸的抗体的检测，其中目标核酸与探针杂交。

在本发明的第三个方面中，提供了一种检测单核苷酸多态性的方法。在反应混合物中含有带单核苷酸多态性的目标核酸序列和与含有单核苷酸多态性的目标核酸序列互补的探针，该反应混合物还含有切割试剂以及任何必需的缓冲液。探针杂交到目标核酸提供了靶-探针复合物，其在与切割试剂接触时被切割。这形成了探针片段并且探针片段从目标序列上解离出来。这样，就可以对探针片段进行检测并证实目标核酸序列内单核苷酸多态性的存在。本发明的一个目标是通过检测在本发明方法之一中所形成的探针片段，提供对单核苷酸多态性的检测。

本发明的另一个目的是通过荧光释放检测方法对目标核酸序列、蛋白质、抗体和/或抗原以及单核苷酸多态性进行检测。

本发明的另一个目的是提供通过扩增程序对目标核酸序列的检测。需要理解的是，如前所述，在本发明的方法中所使用的目标核酸序列可以进行蛋白质、抗体和/或抗原以及单核苷酸多态性的检测。在这种方法中，有对原始目标核酸序列的同时扩增，以及从探针对检测信号的扩增，这样提供了速率和灵敏性的最佳水平。

本发明的进一步目的是提供一种方法以降低在不希望的探针位置上对探针进行切割的发生。

需要理解的是，前面的概述和下面的详细描述是只是示范性和说明性的，其不是对本发明所要求的范围的限制。这里所引用的和组成说明书一部分的附图与概要一起说明了本发明的实施方式，其用于解释本发明的原理。

附图说明

通过参考附图，本领域技术人员可以更好地理解本发明众多的优点，其中：

图1是说明根据本发明的示范性实施例在进行实时检测目标核酸序列中使用荧光标记的核酸探针的示意图。使用FRET对(荧光供体和接受子)在探针邻近切割位点处(在这种情况下为RNA酶H切割位点)进行内部标记。在恒温下将过量的这种探针与RNA酶H进行孵育。该核酸探针与目标DNA内的特异序列互补。通过杂交，形成了双链复合物，并形成了RNA酶H的切割位点。RNA酶H切割所形成的切割位点后形成了两个探针片段。通过切割，两个探针片段将从目标DNA解离出来，因为在反应温度下，片段是不稳定结合的。作为切割的结果，另一个被荧光标记的核酸探针可以接着杂交到目标上，切割循环的反应被重复。探针片段的解离导致了荧光强度的提高，这可以通过荧光仪或者荧光板读数计(fluorescent plate reader)进行监测；

图2是说明提供利用本发明信号扩增方法检测目标核酸序列的结构图；

图3是说明提供利用本发明信号扩增方法检测目标蛋白质的结构图；

图4是说明提供利用本发明信号扩增方法检测单核苷酸多态性的结构图；

图5是说明利用含有DNA酶介导可切割序列的核酸探针进行目标核酸序列检测的方法。对目标核酸序列进行扩增程序，其可以提高检测程序的速率和灵敏性；

图6是说明使用热稳定RNA酶H和在目标DNA中存在荧光的嵌合DNA-RNA底物时切割反应的动力学。将指定量的目标DNA在存在5单位RNA酶H和10pmol荧光探针时，在50℃进行孵育。使用荧光微孔板读数计通过荧光强度对反应进行监测；

图7是说明在有10pmol荧光探针和5单位热稳定RNA酶H时PCR实时检测的示意图。在有指定量的目标DNA时进行PCR反应，并在荧光微孔板读数计上对反应进行监测；

图8是说明实时检测滚环扩增(RCA)反应的示意图。37℃下，RCA反应液含有在Φ29DNA聚合酶缓冲液中的未稀释(■)、1∶10(◆)、1∶10²(▲)、1∶10³(●)、1∶10⁴(□)或者1∶10⁵(◇)倍稀释的环化RCA底物，以及65pmol引物、500μM dNTP、200μg/ml BSA、10pmol探针、2.5单位的大肠杆菌(E.Coil)RNA酶H和5单位的Φ29DNA聚合酶。使用未稀释的底物在没有DNA聚合酶的情况下进行对照反应(△)。通过荧光强度在Bio-Rad I-Cycler上对反应进行监测；以及

图9是说明通过切割反应检测单碱基对错配的示意图。将10pmol探针与20pmol在探针的可切割区域指定的碱基对错配进行孵育。使用荧光微孔板读数计和5单位热稳定RNA酶H在50℃下监测探针的切割。

发明的详细描述

现在将详细提及本发明优选的实施方式和附图中所描述的实施例。

本发明提供了一种方法以检测目标核酸序列，例如目标DNA或者RNA。而且，本发明提供了一种检测各种分子的方法，例如结合目的核酸的抗原决定簇、蛋白质、抗原、抗体、肽、糖类、有机或者无机化合物。本发明的检测方法可以通过信号扩增(直接检测)或者通过检测已经进行扩增程序的DNA来完成。将含有可检测标记的探针杂交到目标核酸上以提供对出现目标核酸的确认。探针可以进一步提供在同质或者异质体系的等温或者非等温环境中对出现第二目标的确认，例如特异性抗原决定簇、蛋白质、抗原、抗体、糖类之类。

现在整体上参考图1，其表示了一种以实时同质的模式检测目标DNA的方法。需要理解的是，目标DNA是目标核酸序列并可以是不偏离本发明范围和原理的RNA链。该方法包括使用探针(核酸探针)，其进一步包括可检测标记，探针用于杂交到目标DNA(目标核酸序列)上。在这个实施方式中，可检测的标记是双标记(荧光对)，其被标为“F”(荧光素/供体)和“Q”(受体/淬灭子)。可选择的，可检测的标记可以包括如下面所描述的各种标识和结构。在促进探针与目标序列的杂交反应或者退火的条件下，发生了核酸探针与目标DNA的杂交。通过探针和目标DNA的接触发生了杂交过程。可以预期的是，杂交反应条件可以发生变化以适应为各种探针和目标DNA结构建立的适当条件。探针杂交到目标DNA后，使用切割试剂(切割酶)对探针进行切割，并将探针片段从目标DNA解离出来。切割试剂在探针内的切割位点与探针接触。切割位点可以定位在沿着探针的各种位点。例如切割位点可以定位在靠近探针外端，在探针5′或者3′末端。可选择的，切割位点可以定位在探针的内部，更优选定位在下面描述的探针的酶介导的可切割序列内。探针片段从目标DNA的解离使得可以进行对可检测标记的检测。当将本领域技术人员已知的诸如各种分析方法之类的检测方法应用于探针片段时就可以进行检测，从而提供对目标核酸存在的暗示。

在本发明方法内，可以对探针进行不同的构建以实现杂交、切割和解离功能。在优选的实施方式中，探针是一种核酸探针，其构成为带有特异序列的寡聚核苷酸。寡聚核苷酸的特异序列可以被预先确定或者被构建成包括将探针和目标核酸序列相关联的序列。可以采用探针的各种构建方法，例如在下面所提供实施例中所确定的，或者本领域技术人员所可以预期的，这都没有离开本发明的范围和原理。

可以使用DNA、RNA或者嵌合的DNA/RNA核苷酸序列来构建在本发明的实践中有用的探针(核酸探针)。在优选的实施方式中，探针具有如下结构：

R₁--X--R₂

其中，R₁(第一探针区)、R₂(第二探针区)和X(酶介导可切割序列)是从DNA、RNA或者嵌合的DNA/RNA衍生而来的核酸序列。例如，核酸探针中的R₁和R₂可以都是DNA序列。可选择的，核酸探针中的R₁和R₂可以都是RNA序列。在另一个实施方式中，探针可以包括R₁是RNA或者DNA，R₂是RNA或者DNA的结构。需要理解的是，这些R₁和R₂序列的各种组合可以与X结合，其中X可以由DNA或者RNA序列构建。可以预期的是，R₁、R₂和X也可以完全被甲基化或者部分甲基化以防止非特异性切割。

探针的整体长度或者核苷酸/碱基对的数目可以变化，以允许使用不同的目标核酸序列和/或切割试剂，这在下面有描述。可以预期的是，探针的三个探针区域R₁、R₂和X的长度/核苷酸数目可以被相似地配置，其相对于另一个而变化，或者被构建成与另一个的许多可选择的组合。例如，在本发明一个实施方式中，R₁和R₂可以被独立地被构建成含有1～20个核苷酸，X可以被构建成包括1～80个核苷酸。在可选择的方式中，R₁可以被构建成包括1～10个核苷酸的序列，R₂可以被构建成包括1～20个核苷酸的序列，X可以被构建成包括1～80个核苷酸的序列。在优选的实施方式中，X的长度在1～10个核苷酸的范围内，更特别的为1～7个核苷酸。R₁和R₂的长度可以被构建成在1～100个核苷酸的范围内，更优选的为1～20个核苷酸。

在本实施方式中，X序列是酶介导可切割序列(EMCS)。这样，X序列是探针的切割位点，这可以在检测本发明目标核酸的方法中，通过切割试剂对探针进行切割。术语“酶介导的切割”是指RNA或DNA被酶催化切割，所述的酶例如DNA酶、RNA酶、解旋酶、核酸外切酶、限制性核酸内切酶以及核酸内切酶。在优选的实施方式中，X是由RNA构建成的，并通过核糖核酸酶对其进行切出缺口或者切割。在另一个实施方式中，核糖核酸酶是双链核糖核酸酶，其对双链DNA-RNA杂交链的核糖核酸进行切出缺口和切除。本发明所使用核糖核酸酶的一个实施例是RNA酶H。其它有用的酶如核酸外切酶III和反转录酶。在另一个实施方式中，核酸酶是双链脱氧核糖核酸酶，其对双链DNA-RNA杂交链的脱氧核糖核酸进行切出缺口或者切割。在本发明的实践中有用的脱氧核糖核酸酶的实施例是堪察加半岛蟹(Kamchatkacrab)核酸酶(Shagin，Rebrikov，Kozhemyako，Altshuler，Shcheglov，Zhulidov，Bogdanova，Staroverov，Rasskazov和Lukyanov，Genome Res.12：1935～1942(2002))。与单链DNA相比，这种核酸酶表示出了对DNA二联体(双链DNA和DNA-RNA杂交中的DNA)的相当的偏爱。

另外，由于在本发明实施的方法中所采用的优选等温环境，热稳定的酶可以提高检测的灵敏性、速率和精确度。例如可以通过热稳定的RNA酶H对杂交的探针进行切出缺口或者切割。还可以采用前面所提到的酶和本领域技术人员已知的其它酶，这不离开本发明的范围和原理。

在反应混和物中，本发明的探针可以被构建为带有一个或者多个可检测的标记，或者可以连接一个或者多个可检测的标记。可以预期的是，可检测的标记可以有变化，例如任何可以被检测的分子或者试剂。例如，可检测的标记可以是放射性同位素、荧光分子、荧光抗体、酶、蛋白质(生物素、GFP)或者化学发光催化剂。荧光分子和荧光抗体可以被称为“荧光标记”或者“荧光团”，这里指能够在可检测范围内展示出荧光的物质或其部分。可以在本发明中采用的荧光团的实施例包括异硫氰酸荧光素、荧光素胺、曙红、若丹明、丹磺酰、JOE、伞形酮或者亚历克斯氟石(Alexa fluor)。本领域技术人员已知的其它荧光标记也可以用于本发明中。

可检测标记可以是单荧光/荧光团“单标记”或者包括供体和受体荧光团的荧光对“双标记”，如图1所示。对单标记或者双标记的选择可以依赖于所使用切割酶的效率和所观察到的淬灭的效率。可以进一步预期的是，对所使用单标记或者双标记的选择可以取决于各种其它的因素，例如所采用检测技术的灵敏性(酶联凝胶分析、基于酶珠的检测、电致化学发光检测、荧光关联光谱以及微量滴定板夹心杂交)。

连接供体和受体荧光团与探针的位置可以有变化以适合受体的淬灭能力和各种其它的因素，例如上面所述的。在优选的实施方式中，使用双标记，其中供体和受体荧光团在探针的不同位置与探针连接，两个位置之间间隔0～20个碱基对。更优选的，供体和受体的间隔距离为0～7个碱基对。间隔的这个范围可以将受体的能力提高以适当地淬灭供体的荧光直到探针被切割。这可以进一步降低在本发明的检测方法中所产生的背景噪音。这样，信号-噪音比可以维持在检测目标核酸序列的最佳范围内。

荧光团可以在探针的各种位点和各种区域内与探针连接。标记的优选位点是直接临近X(酶介导可切割序列)，这是优选的探针切割位点。这样，在图1的实施方式中，供体连接到临近探针R₁区的3′末端，也临近探针R₁区与探针X区的5′末端的连接处。受体被连接到探针R₂区的5′末端，其被置于接近于探针的R₂区和探针X区的3′末端的连接处。可以预期的是，供体和受体对和其它任何可以与本发明探针一起使用的可检测标记一样，可以沿着相对于X的探针的R₁和R₂区的长度与探针连接。这样，所使用的可检测标记可以在临近于X的可变范围内的位置处与R₁和R₂相连。进一步，可检测的标记可以分别外部连接在R₁区的5′末端和R₂区的3′末端。使用可检测标记对探针的标记也可以在探针的X区域内完成。在X区域内的标记可以是优选的，只要将切割位点维持在探针之间的位点内，特别是在采用荧光对作为可检测标记时。

所采用的可检测标记和与探针的连接位置可以依赖于探针的结构。例如在R₁、R₂和X内由大量核苷酸序列构建的探针，可以允许使用不同的可探测标记。使用荧光对标记作为实施例，第一对标记可以包括受体，该受体具有比第二对标记的受体提高的淬灭能力。第一对受体的提高的淬灭能力可以使第一对可以被比第二对更大量的核苷酸所隔开。在第一对标记物之间的更大量的碱基对可以提供切割试剂在检测标记之间的切割位点切割探针的优点。可选择的，改变标记之间碱基对的数目可以提高探针与目标核酸序列杂交的性能。

在操作中，图1所表示的行进序列在反应混和物中发生，该反应混和物包括目标核酸和探针。在形成反应混和物中，在能够使探针杂交到目标核酸分子上的条件下，目标核酸分子和过量摩尔量的核酸探针在反应容器中被混合在一起。

现在参考图2，其表示了一种检测目标核酸的方法。在第一步骤205中获得了目标核酸序列。可以使用本领域技术人员已知的技术和方法获得目标核酸序列。该目标核酸序列被杂交到含有可检测标记的核酸探针上，这形成了靶-探针复合物。在步骤210中，将靶-探针复合物与切割探针的切割试剂接触，探针被切割试剂切割后形成了探针片段并从目标核酸序列解离出来。在步骤215重复步骤205和210，其使用在反应混和物中所含有的第二核酸探针，该反应混和物包括目标核酸序列和一些核酸探针。所解离的探针片段使可检测标记能够被检测，这提供了在步骤220中存在目标核酸序列的暗示。

在优选的实施方式中，探针和目标核酸上特异核苷酸序列“特异目标序列”之间发生杂交。这种杂交/退火导致形成双链靶-探针复合物。通过将杂交的探针与能够在切割位点特异性切割探针的切割试剂进行接触，将杂交的靶探针复合物进行切割，其中切割序列是杂交的探针中预先确定的。在优选的实施方式中，预先确定的切割序列是探针的X区。可选择的，预先确定的切割序列可以定为在探针R₁和R₂区的各个位置。

在对探针在切割位点进行酶介导切开缺口或者切割后，形成了第一探针片段和第二探针片段。酶介导切开缺口或者切割可以使第一探针片段和第二探针片段从目标核酸解离(解链或者脱落)。第一探针片段和第二探针片段的解离提供了两个结果：(1)可检测的标记被“活化”(在使用荧光对的位置，受体离开供体，释放出供体以发出荧光)，这可以通过各种检测方法进行其鉴定，这样，检测了目标核酸序列的存在，以及(2)通过从目标核酸解离，其可以使反应混和物内的多余摩尔量的核酸探针中的另一个探针(第二探针)，在特异目标序列杂交到目标核酸上。按照这种方式，探针的信号被扩增，这可以显著地提高灵敏性和速率。

通常在含有适当缓液和切割试剂的反应混和物中，目标核酸分子和被标记的探针被组合在一起。将反应混和物孵育在切割试剂的最佳反应温度下，优选为30℃～72℃。可以理解的是，反应温度可以根据不同的需要而改变，例如各种目标核酸分子的温度需要，各种核酸探针的温度需要，缓冲液和/或切割试剂的最佳性能参数之类。可以将反应混和物孵育5分钟～120分钟，以能够使探针退火到目标序列上，接着进行对探针的后续切割。孵育的时间可以基于所使用的各种酶、缓冲液、核酸序列等而变化，其可以具有预先确定的最佳孵育时间。如上所述的，反应循环包括使用能够与目标核酸序列进行反应的反应混和物内的第二探针进行重复杂交和切割步骤。

对双链探针-靶组合物的切割和切出缺口导致形成至少两个探针片段。产生长度变短的探针片段化促进了在反应条件温度下探针片段从目标核酸解链或者脱离，并使另一个(第二)探针与目标序列结合。接着是用检测方法对所得到的单链探针片段进行鉴定，这样可以检测目标核酸分子的存在。

可以使用各种检测方法进行对探针片段的鉴定。鉴定和检测的方法可以依赖于加入到探针或者反应混和物中的标记或者可检测标记的类型。检测探针片段的一种方法是使用荧光共振能量转移(FRET)对标记探针。在探针是完整的时候，由于受体的靠近，供体的荧光被淬灭。通过两个荧光团的物理分离，作为由切割试剂起始的切割的结果，由于失去了FRET，所淬灭的供体荧光被恢复。因此，对探针的切割和所得到的探针片段的解链导致了供体荧光的“活化”、增强或者恢复，这可以被监测。通过监测荧光的增强，反应步骤可以被实时监测，从而实时监测目标核酸分子的存在。

还可以对探针进行修饰，使得诸如所得到的检测只是对探针X区的特异切割的结果，而不是由于探针R₁和R₂区的非特异切割。例如，如果探针是DNA-RNA-DNA嵌合探针，则探针的DNA部分可以被甲基化以防止被反应中的DNA酶非特异切割。另一个实施例是如果探针全部由RNA构成，R₁和R₂RNA可以被甲基化，这样只有X RNA可被切割。本领域技术人员还可以使用已知的对探针的其它修饰，只要它们有助于减少不希望的切割的出现。

本发明还提供了一种检测目标核酸序列的方法，其结合了核酸扩增反应的快速和灵敏性。在示范型的方法中，形成了反应混和物，其含有包括目标核酸序列的分子。对目标核酸序列进行扩增程序。在反应混和物中包含探针，其杂交到扩增的目标核酸序列产物上。切割试剂在特异位点对探针切出缺口或者进行切割，这样形成了探针片段并从所扩增的目标核酸序列解离出来。探针片段的解离可以使另一个(第二)探针杂交到目标核酸序列。所解离的探针片段得以使对探针剪切进行检测，这样检测了目标核酸序列和分子。

在发明的这项特征中，前面所述的探针设计、切割以及检测的原理适合于对核酸扩增反应相关的分子的检测。本发明优选的实施方式是使用可被RNA酶H切割的FRET探针，以及与RCA反应相关的产物分子。采用本发明与核酸扩增反应结合使用的优点是其提供了在检测速率和灵敏性方面的实质改进。

易于适合本发明的核酸扩增反应是本领域技术人员熟知的。这些反应包括但不限于PCR、SDA、NASBA和RCA。通常，目标核酸、探针、核酸扩增反应的组分以及切割酶在反应混和物中结合，其可以同时进行目标核酸的扩增和通过前面所述探针的切割进行检测。每个扩增反应需要被单独优化以适合缓冲液条件、引物、反应温度和探针切割条件的分别需求。

本发明的检测机制也可以用于检测目标抗原决定簇，其可以被包含在各种抗原、肽、有机化合物、无机化合物之类内。需要理解的是，抗原可以是各种蛋白质和/或糖类物质。为了完成对目标抗原决定簇的检测，一种与包括可检测标记的核酸探针互补的目标核酸序列可以连接到与目标抗原决定簇有高亲合力和特异性的核酸适体上。核酸适体可以是各种寡聚核苷酸(DNA或RNA分子)，其可以结合到抗原决定簇上。可以使用单一核酸适体、一对核酸适体或者三个或更多个核酸适体来构建核酸适体，以有效地鉴定目标抗原决定簇并与其结合。提供互补序列的目标核酸可以允许核酸探针的杂交，在结合到抗原决定簇的核酸适体上形成了靶-探针复合物。接着对靶-探针复合物进行切割，并以与上述相似的方式对可检测的标记进行检测，这样检测了目标抗原决定簇的存在。

通过实施例的方式，图3中表示了检测目标蛋白质的方法。在第一个步骤305中，获得了目标蛋白质。目标蛋白质包括目标抗原决定簇。目标蛋白质的获得可以通过使用本领域技术人员已知的技术和方法来完成。在第二个步骤310中，特异性针对含有抗原决定簇的蛋白质的抗体是通过将其与互补于核酸探针的目标核酸序列连接制备而成的。一旦获得目标蛋白质，制备了抗体，在步骤315中，目标蛋白质将杂交到抗体上，这形成了抗体-目标蛋白质复合物。在步骤320中，形成了含有抗体-目标蛋白质复合物以及一些核酸探针的反应混和物。这些核酸探针每个都含有可检测的标记，单一探针被杂交到目标核酸序列上，这形成了目标核酸-探针复合物，其与抗体连接。在步骤325中提供了一种切割试剂，并且切割试剂与目标核酸-探针复合物进行接触并切割探针，这形成从目标核酸解离的探针片段。在步骤330，使用用于杂交、切割和从目标核酸解离的混合物中的第二探针重复步骤320和325。在步骤335中，对可检测标记进行检测，这样检测了目标蛋白质的存在。以这种方式，对目标蛋白质的检测还提供了对抗体的检测，目标核酸序列与该抗体连接。

需要理解的是，上述方法是示范的并不是要限制本发明的范围。对可以包含在各种结构上的例如抗原(蛋白质、糖类等)上的抗原决定簇的检测，在本发明的方法中，可以通过利用与上述相似的技术，使用核酸适体、抗体之类来完成。这种检测能力在诊断各种抗原的存在中可能具有优势，可以辅助提供治疗。

目标核酸序列连接到抗体上需要设计接头核酸以被连接到核酸的5′末端，这样杂交序列不会被连接到抗体上而产生位阻。接头核酸序列通常为1～10个核苷酸，尽管通过本发明可以预期使用更长的序列。另外，可以将目标核酸序列设计为前后重复，这样可以有多于一个的探针结合到每个抗体上，这样扩增了来自每个所结合抗体的信号。主要有两种方法用于将目标核酸序列结合到检测抗体上。在第一种方法中，5′-硫醇修饰的DNA与抗体中的自由氨基连接，其中可以使用任一以下的试剂：琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸(SMCC)、硫代琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸(Sulfo-SMCC)、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶硫)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺-6-(3′-(2-吡啶二硫)-丙酰胺基)-己酸盐(NHS-Ic-SPDP)或者硫代琥珀酰亚胺-6-(3′-(2-吡啶二硫)丙酰胺基)-己酸盐(Sulfo-NHS-Ic-SPDP)。这些试剂在它们间隔的长度和水溶性程度上有区别。如果必要，可以使用硫醇化试剂来打开连接以释放DNA(目标核酸)进行进一步操作。

在第二种方法中，通过四聚体蛋白质链霉素(strepavidin)来补充抗体-目标核酸序列的桥接方式，其中链霉素与生物素之间形成了大的不能逆转的键(Niemeyer，Adler，Pignataro，Lenhert，Gao，Chi，Fuchs和Blohm NucleicAcids Res.27：4553～4561(1999))。抗体上的自由氨基可以通过与生物素-n-羟基琥珀酰亚胺的反应而标记上生物素。DNA的生物素化可以使用5′-生物素亚磷酰胺来进行，或者通过氨基标记5′末端，接着与生物素-n-羟基琥珀酰亚胺反应。通过在DNA-链霉素结合物中加入1摩尔抗体的等价物，来制备DNA、链霉素和抗体的结合物。在4℃孵育1小时后，在Superdex 200凝胶过滤柱上对抗体-目标核酸序列的结合物进行纯化，在该柱上，在空隙体积中洗脱结合物。通过在用Sybr-Green II染色的1.5～2％的琼脂糖凝胶上进行非变性电泳来分析样品。

可以利用各种技术来使核酸适体与抗原决定簇的结合或者抗体与目标蛋白质的结合。例如，首先将目标蛋白质固定到固体支持物上。将目标蛋白质固定到固体支持物上的许多方法是本领域技术人员熟知的并可以得以使用，均不离开本发明的范围和原理。接着将抗体与固定的目标蛋白质在反应混合物中孵育以使抗体结合到目标蛋白质上。接着对所结合的抗体-目标蛋白质复合物(包括连接到抗体上的目标核酸序列)进行清洗多次以去除未结合的抗体。接着将结合的抗体-目标蛋白质复合物与前面所述的核酸探针与适当的缓冲液和酶(切割试剂)进行孵育，以允许探针杂交到目标核酸上以及对探针进行切割。对来自于切割试剂接触探针后被切割的探针片段的检测可以通过利用前面所述的方法之一来完成。探针片段从目标核酸序列的最终解离提供了存在目标蛋白质的暗示。

本发明进一步提供了一种检测目标蛋白质、抗原、抗原决定簇之类的方法，其将核酸扩增反应的速率和灵敏性与核酸适体和/或抗体检测的特异性相结合。在示范的方法中，形成了反应混合物，其含有例如抗体这样的分子，其可以特异结合到目标蛋白质上。抗体(分子)与目标核酸序列连接，这被连接到核酸扩增方法中以进行抗原结合的检测。在反应混合物中含有探针，其杂交到扩增的核酸产物上。切割试剂(切割酶)在特异位点对探针切出缺口或者切割，这样形成了探针片段并且其从扩增的目标核酸序列解离出来。探针片段的解离可以使另一个探针与核酸序列杂交，所解离的探针片段得以使对探针的剪切进行检测，这样检测了目标蛋白质。

在本发明的这项实施方式中，前述的探针设计、切割和检测的原理是和连接到核酸扩增反应中的目标核酸序列的检测相适应的。本发明的优选实施方式是使用可以被RNA酶H切割的FRET探针与连接到RCA反应的抗体。采用本发明扩增核酸反应的优点是在特异性检测目标核酸序列的速率和灵敏性方面提供了实质性的改进，在这种情况下，提供了在检测目标抗原决定簇、蛋白质、抗原之类时的优点。

利用本发明的方法可以对目标DNA中存在的单核苷酸多态性(SNP)进行检测。用于检测单核苷酸多态性(SNP)的标记和检测方法在所有方面与用于标记和检测目标核酸的是相似的，除了下面所描述的。现在参考图4，在第一步骤405中，在能够使探针和目标核酸序列杂交的条件下，形成了含有目标核酸序列和相对多的核酸探针的反应混合物。目标DNA含有SNP，探针被设计为与目标DNA完全互补，其含有匹配SNP的互补核苷酸。在步骤410中，在与切割试剂接触时，探针被切割成两个或者更多个探针片段。在步骤415中，使用第二探针重复步骤405和410，其中第二探针与目标核酸序列杂交。该探针片段由于其变短的结构从目标DNA解离出来，其可以使可检测的标记连接到探针上，进而在步骤420中被检测。这样，在步骤420中，对所切割探针的检测暗示了在目标核酸序列内存在SNP。

在可选择的实施方式中，在目标核酸序列内可以存在未知的SNP。这样，与目标核酸序列互补的探针可以存在在探针和目标核酸之间存在单个不匹配的情况。如果这种不匹配出现在探针的可切割区域时，可能会不允许探针被切割试剂所切割。缺少切割会导致探针片段没有从目标核酸解离。这样，目标核酸序列不能够“自由”与第二探针杂交。这有限制或者取消可检测标记的产生的效应，此时通常需要通过它们的解离来“活化”。这样，在这个实施方式中，缺少对可检测标记的检测，这暗示在目标核酸内存在SNP。

通过信号检测或者显著缺乏来自可检测标记的信号来对SNP的检测，可以通过探针自身的信号扩增、切割和检测来完成，或者联合近似于之前描述的核酸扩增反应。

现在参考图5，描述了检测与依赖核酸序列的扩增(NASBA)相关的目标核酸序列的方法。在该实施例中，探针在毗邻切割位点处(在这种情况下为来自堪察加半岛蟹(Kamchatka crab)肝胰腺的双链特异性核酸酶切割位点)被内部标记上FRET对(荧光供体与受体)，酶介导的可切割区是由DNA组成的，而第一与第二探针区是由RNA组成的。在NASBA方法的步骤505中，使用特异性引物507通过反转录酶来引导与目标互补的链的合成。新合成的链的3′末端被加入了T7RNA聚合酶启动子509。在步骤510中，在存在T7RNA聚合酶时，T7启动子509诱导RNA的生成，其序列与目标相同，除了产物为RNA外。每个T7启动子509从单个模板诱导了许多拷贝的RNA生成，这是反应的RNA扩增时期。在步骤515中，多拷贝的引物507结合到每个RNA拷贝上，利用反转录酶来产生双链RNA/DNA二联体产物。在步骤520中，RNA酶H消化杂交的RNA部分，产生了与开始的目标DNA互补的DNA产物。在步骤525中，使用第二引物517以引导与步骤520的产物互补的DNA链。这种产物与在上面步骤505中所形成的相同，这样产生了更多的模板，其在接下来的NASBA循环中被进一步扩增。在开始反应的实时检测步骤530中，与在步骤510中产生的RNA产物互补的核酸探针531杂交到每个单独的目标序列上。通过杂交，形成了双链复合物，结果是形成了蟹肝胰腺核酸酶的切割位点。在步骤535中，蟹肝胰腺核酸酶在所形成的DNA/RNA切割位点内对DNA进行切割，从而形成了第一探针片段541和第二探针片段543。在步骤540中，第一探针片段541和第二探针片段543从目标DNA解离出来，这是由于片段在反应温度下是不稳定结合的，这样再生了开始的RNA。作为切割的结果，另一个荧光标记的核酸探针可以杂交到相同的目标序列上并可以重复反应的切割循环。采用这项发明进行连接到各种分子的核酸扩增反应的优点是其为各种分子的特异性检测提供了速率和灵敏性方面的实质性改进。

已经整体上描述了本发明，可以通过参考一个或者多个特定的例子对发明有更好地理解。提供这些实施例是为了辅助理解和说明本发明，并不是为了以任何方式限定如后面权利要求所述的发明。

实施例1

使用荧光探针和RNA酶H对目标DNA的检测分析。

制备荧光标记的切割探针：

使用PerSeptive Biosystems Expedite核酸合成系统合成24个核苷酸的寡聚核苷酸5′-TATGCCATTT-r(GAGA)-TTTTTGAATT-3′(SEQ ID NO：1)。在合成过程中通过包含适当标记的dT单体，在位置10和15加入荧光素和TAMRA。在位置11～14，在序列之前使用小写字母“r”标记核糖核苷酸。通过用氟化四丁基铵溶液过夜处理去除RNA上的唾液酸保护基团。接着加入相同体积的1M TEAA，然后加入灭过菌的水。接着使用Sephadex G-25柱对寡聚核苷酸脱盐。收集组分，并接着将所得到的样品在变性(7M尿素)20％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以进一步纯化寡聚核苷酸并去除任何残留的游离染料。从凝胶上切下适当的寡聚核苷酸带，并使用S&S ELUTRAPElectro-Separation System(Schleicher & Schuell)进行电洗脱。

使用荧光微孔板读数计通过荧光素释放的提高，监测探针的切割。将不同浓度的目标DNA与10pmol荧光探针与5个单位的RNA酶H于50℃孵育在50μl 1×RNA酶H缓冲液中。如图6所示，将其结果作图，其带有起始相对荧光的背景减少。非常快速和明显的依赖剂量的反应可以被观察到。在少到5分钟的时间内，0.2pmol的样品从背景(阴性对照)区别出来。这些结果证明，通过使用本发明的方法，为所有样品提供了非常快速的结果，其几乎立即(小于5分钟)可以观察到统计学上的显著差异。从这项实施例中，可以看出本发明可以提高目标核酸检测的灵敏性和速率，其中探针杂交到目标核酸上。

实施例2

使用RNA酶H对PCR反应进行检测的实时分析。

使用荧光微孔板读数计通过荧光素释放的提高，监测探针的切割。PCR反应是使用1μg和1ng目标DNA，在有10pmol荧光探针和5单位的热稳定PCR RNA酶H时进行。在50μl的Taq聚合酶缓冲液中，PCR反应也可以含有10pmol正向和反向引物、0.2mM dNTP以及2.5单位的Taq聚合酶。在图7中表示的结果证明本发明的方法可以实时检测PCR反应。两个反应的绘图都表示了典型的实时PCR反应，并表现出相似的剂量依赖性能。因此，使用RNA酶H和荧光探针可以提供实时PCR的替换方法。

实施例3

同时切割探针/滚环扩增分析以检测DNA

制备未标记的寡聚核苷酸：使用PerSeptive Biosystems Expedite核酸合成系统合成60个核苷酸的寡聚核苷酸模板5′-ATCTGACTATGCTTGTACCTGGTTATTTAGCACTCGTTTTTAATCAGCTCACTAGCACCT-3′(SEQ ID NO：2)，80个核苷酸的环化寡聚核苷酸5′-CTAAATAACCAGGTACAATATGCCATTTGAGATTTTTGAATTGGTCTTAGAACGCCATTTTGGCTGATTAAAAACGAGTG-3′(SEQ ID NO：3)，以及15个核苷酸的寡聚核苷酸引物5′-TGGCGTTCTAAGACC-3′(SEQ ID NO：4)。在C18柱上对寡聚核苷酸进行纯化。

制备滚环扩增底物：37℃时，在含有10U T4多聚核苷酸激酶的1×T4DNA连接酶缓冲液中对800μM的可环化寡聚核苷酸溶液进行处理60分钟，接着在65℃使激酶失活20分钟。将含有400nM该材料的溶液进行退火，并在含有2000U T4DNA连接酶的1×T4DNA连接酶缓冲液中与200nM的模板寡聚核苷酸进行连接反应，反应于16℃进行16个小时。

使用Bio-Rad I-Cycler通过荧光素释放的提高对探针的切割进行监测。使用实验平板方法对荧光素释放进行基线消除(base-line subtracted)和收集好的因子(well factor)。在特定时间内以1分钟的间隔收集强度数据。在Φ29DNA聚合酶缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl₂，10mM(NH₄)₂SO₄，4mM DTT)中进行所有的荧光测量，并且在20μl体积内含有浓度变化的环化RCA底物、65pmol引物、500μM脱氧核苷酸三磷酸、200μg/ml BSA、10pmol探针、2.5单位大肠杆菌(E.Coli)RNA酶H和5单位Φ29DNA聚合酶，于37℃进行120分钟。

滚环扩增是用于快速产生大量单链DNA的等温技术。在这种程序中，可环化寡聚核苷酸被退火和连接到模板上以形成环形DNA合成底物。通过加入引物、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和链置换DNA聚合酶，产生了由多重复拷贝环化底物组成的单链产物。在环化底物的序列内编码的是一个或者多个切割探针的结合位点(特异目标序列)。一旦产物产生，位点/特异性目标序列的数目开始增加，从而使得探针和被RNA酶H切割的RNA部分结合，之后探针解离并重复循环。解离后，两个荧光标记的DNA片段互相分散开，这增大了荧光素和TAMRA淬灭子之间的距离，同时提高了被监测的荧光素的释放。最后的结果是循环检测期与环状底物的DNA扩增相连接的过程。由于可环化底物多于模板，因此分析的灵敏性可以通过改变反应中模板的量来进行确定。图8表示了这种分析的结果，其中未稀释(■)、1∶10(◆)、1∶10²(▲)、1∶10³(●)、1∶10⁴(□)或者1∶10⁵(◇)10倍系列稀释的环化底物在有探针时于37℃通过RCA进行扩增。在没有DNA聚合酶的情况下对未稀释的底物进行对照反应(△)。这些结果证明使用本发明的方法切割探针可以用于监测以浓度倚赖的方式进行RCA扩增的实时产物。

实施例4

使用发出荧光的探针和RNA酶H对单核苷酸多态性进行检测。

现在参考图9，其表示了RNA酶H切割目标序列的能力，该目标序列在RNA杂交区内有单碱基对错配。合成了4条错配的目标DNA寡聚核苷酸。这些寡聚核苷酸除了一个错配外与探针互补。例如寡聚核苷酸1C-1T指的是只有探针上第一个5′RNA核苷酸相应的互补序列从C变成了T。50℃下，将20pmol的每种错配的目标核苷酸与10pmol荧光探针和5单位热稳定RNA酶H在50μl RNA酶H缓冲液中孵育和监测25分钟。其结果说明，即使是单核苷酸错配也导致缺少切割和荧光强度的相应提高。这些结果进一步示范了通过反应所提供的高度特异性。这样，该方法自身或者与核酸扩增反应相结合对于检测单核苷酸多态性是相当有利的。

需要理解的是所公开的方法中步骤的特定顺序或者等级是示范性的方法。基于设计的偏爱，可以理解的是可以对方法中步骤的特定顺序或者等级进行重排，而这也在本发明的范围和原理内。所附带的方法权利要求代表了在举例方式中各种步骤的要素，其不是必然意味着要限制所表示的特定顺序或者等级。

相信通过前面的说明可以理解本发明及其附带的优点。也相信可以对其形式、结构和其组件的排列进行各种改变，而不离开本发明的范围和原理，或者不破坏其实质性的优点。之前所描述的形式主要是其说明性的实施例。后面的权利要求也需要包含和包括这些改变。

参考文献列表

K.B.Mullis，F.A.Faloona，S.J.Scharf，S.K.Saiki，G.T.Horn和H.A.Erlich，Specific enzymatic amplification of DNA in vitro：the polymerase chainreaction.Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51(1986)，pp.263～273。

G.T.Walker，M.C.Little，J.G.Nadeau和D.D.Shank，Isothermal in vitroamplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system.Proc.Natl.Acad Sci.USA 89(1992)，pp.392～396。

G.T.Walker，M.S.Fraiser，J.L.Schram，M.C.Little，J.G.Nadeau和D.P.Malinowski，Strand displacement amplification-an isothermal，in vitro DNAamplification technique.Nucl.Acids Res.20(1992)，pp.1691～1696。

D.Y.Wu and R.B.Wallace，The ligation amplification reaction(LAR)-amplification of specific DNA sequences using sequential rounds oftemplate-dependent ligation.Genomics 4(1989)，pp.560～569。

F.Barany，Genetic disease detection and DNA amplification using clonedthermostable ligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)，pp.189～193。

F.Barany，The ligase chain reaction in a PCR world.PCR Methods Appl.1(1991)，pp.5～16。

D.Y.Kwoh，G.R.Davis，K.M.Whitfield，H.L.Chapelle，L.J.DiMichele和T.R.Gingeras，Transcription-based amplification system and detection ofamplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwichhybridization format.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)，pp.1173～1177。

J.C.Guatelli，K.M.Whitfield，D.Y.Kwoh，K.J.Barringer，D.D.Richman和T.R.Gingeras，Isothermal，in vitro amplification of nucleic acids byamultienzyme reaction modeled after retroviral replication.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)，pp.1874～1878。

J.Compton，Nucleic acid sequence-based amplification.Nature 350(1991)，pp.91～92。

A.Fire和S.Q.Xu，Rolling replication of short DNA circles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)，pp.4641～4645。

D.Liu，S.L.Daubendiek，M.A.Zillman，K.Ryan和E.T.Kool，Rolling CircleDNA Synthesis：Small Circular Oligonucleotides as Efficient Templates for DNAPolymerases.J.Am.Chem.Soc.118(1996)，pp.1587～1594。

P.M.Lizardi，X.Huang，Z.Zhu，P.Bray-Ward，D.C.Thomas和D.C.Ward，Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circleamplification.Nature Genet.19(1998)，pp.225～232。

J.Baner，M.Nilsson，M.Mendel-Hartvig和U.Landegren，Signalamplification of padlock probes by rolling circle replication.Nucl.Acids Res.26(1998)，pp.5073～5078。

P.M.Holland，R.D.Abramson，R.Watson and D.H.Gelfand，Detection ofspecific polymerase chain reaction product by utilizing the 5′to 3′exonucleaseactivity of Thermus aquaticus DNA polymerase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)，pp.7276～7280。

C.A.Heid，J.Stevens，K.J.Livak和P.M.Williams，Real time quantitativePCR.Genome Res.6(1996)，pp.986～994。

S.Tyagi and F.R.Kramer，Molecular beacons：probes thatfluoresce uponhybridization.Nat.Bioteclznol.14(1996)，pp.303～308。

D.Whitcombe，J.Theaker，S.P.Guy，T.Brown和S.Little，Detection of PCRproducts using self-probing amplicons and fluorescence.Nat.Biotechnol.17(1999)，pp.804～807。

G.Leone，H.van Schijndel，B.van Gemen，F.R.Kramer和C.D.Schoen，Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enablehomogeneous，real-time detectionof RNA.Nucl.Acids Res.26(1998)，pp.2150～2155。

P.A.Spears，C.P.Linn，D.L.Woodard和G.T.Walker，Simultaneous stranddisplacement amplification and fluorescence polarization detection of Chlamydiatrachomatis DNA.Anal.Biochem.247(1997)，pp.130～137。

J.G.Nadeau，J.B.Pitner，C.P.Linn，J.L.Schram，C.H.Dean和C.M.Nycz，Real-time，sequence-specific detection of nucleic acids during stranddisplacement amplification.Anal.Biochem.276(1999)，pp.177～187。

D.C.Thomas，G.A.Nardone和S.K.Randall，Amplification of padlockprobes for DNA diagnostics by cascade rolling circle amplification or thepolymerase chain reaction.Arch.Pathol.Lab Med.123(1999)，pp.1170～1176。

A.Mckie，D.Samuel，B.Cohen和N.A.Saunders，A quantitativeimmuno-PCR assay for the detection of mumps-specific IgG.J.Immunol.Methods.270(2002)，pp.135～141。

H.C.Wu，Y.L.Huang，S.C.Lai，Y.Y.Huang和M.F.Shaio，Detection ofClostridium botulinum neurotoxin type A using immuno-PCR.Lett.Appl.Microbiol.5(2001)，pp.321～325。

K.Saito，D.Kobayashi，M.Sasaki，H.Araake，T.Kida，A.Yahihashi，T.Yajima，H.Kameshima和N.Watanabe，Detection of human serum tumornecrosis factor-alpha in healthy donors，using a highly sensitiveimmuno-PCRassay.Clin.Chez.45(1999)，pp.665～669。

M.Maia，H.Takahashi，K.Adler，R.K.Garlick和J.R.Wands，Developmentof a two-site immuno-PCR assay for hepatitis B surface antigen.J.Virol.Methods53(1995)，pp.273～286。

H.T.Zhang，J.E.Kacharmina，K.Miyashiro，M.I.Greene和J.Eberwine，Protein quantification from complex protein mixtures using a proteomicsmethodology with single-cell resolution.Proc.NatL Acad.Sci.USA 98(2001)，pp.5497～5502。

S.Fredriksson，M.Gullberg，J.Jarvius，C.Olsson，K.Pietras，S.M.Gustafsdottir，A.Ostman和U.Landegren，Protein detection usingproximity-dependent DNA ligation assays.Nat.Biotechnol.5(2002)，pp.473～477。

A.Fire and S.Q.Xu，Rolling replication of short DNA circles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)，pp.4641～4645。

D.Liu，S.L.Daubendiek，M.A.Zillman，K.Ryan和E.T.Kool，RollingCircle DNA Synthesis：Small Circular Oligonucleotides as Efficient Templates forDNAPolymerases.J.Am.Chem.Soc.118(1996)，pp.1587～1594。

B.Schweitzer and S.Kingsmore，Combining nucleic acid amplification anddetection.Curr.Opin.Biotechnol.12(2001)，pp.21～27。

P.M.Lizardi，X.Huang，Z.Zhu，P.Bray-Ward，D.C.Thomas和D.C.Ward，Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circleamplification.Nat.Genet.19(1998)，pp.225～232。

B.Schweitzer，S.Wiltshire，J.Lambert，S.O′Malley，K.Kukanskis，Z.Zhu，S.F.Kingsmore，P.M.Lizardi和D.C.Ward，Inaugural article：immunoassayswith rolling circle DNA amplification：a versatile platform for ultrasensitiveantigen detection.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)，pp.10113～10119。

D.A.Shagin，D.V.Rebrikov，V.B.Kozhemyako，I.M.Altshuler，A.S.Shcheglov，P.A.Zhulidov，E.A.Bogdanova，D.B.Staroverov，V.A.Rasskazov和S.Lukyanov，A novel method for SNP detection using a new duplex-specificnuclease from crab hepatopancreas.Genome Res.12(2002)，pp.1935～1942。

C.M.Niemeyer，M.Adler，B.Pignataro，S.Lenhert，S.Gao，L.Chi，H.Fuchs和D.Blohm，Self-assembly of DNA-streptavidin nanostructures and theiruse as reagents in immuno-PCR.Nucleic Acids Res.27(1999)，pp.4553～4561。

序列表

<110>韩勉基

<120>对核酸和蛋白质的实时检测

<130>79982/1

<150>韩国申请提交No.：10-2003-0084116

<151>韩国申请提交日期：2003年11月25日

<160>4

<170>Microsoft Word

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>DNA-RNA-DNA

<222>11...14

<223>位置11到14包括序列的RNA部分并在RNA序列的开始之前和末端用符号“-”代表

<400>1

TATGCCATTT-r(GAGA)-TTTTTGAATT

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ATCTGACTAT GCTTGTACCT GGTTATTTAG CACTCGTTTT

TAATCAGCTC ACTAGCACCT

<211>80

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

CTAAATAACC AGGTACAATA TGCCATTTGA GATTTTTGAA

TTGGTCTTAG AACGCCATTT TGGCTGATTA AAAACGAGTG

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

TGGCGTTCTA AGACC

Claims

1.一种用于实时检测目标核酸的方法，其包括：

(a)在相对多的核酸探针中的第一核酸探针可被杂交到目标核酸序列上形成靶-探针复合物的条件下，形成目标核酸序列和相对多的核酸探针的反应混合物，其中每个核酸探针都含有酶介导可切割序列和可检测标记，所述的第一核酸探针含有第一酶介导可切割序列和第一可检测标记；

(b)将靶-探针复合物与切割试剂进行接触，该切割试剂在酶介导可切割序列内的切割位点对第一核酸探针进行切割，这形成了第一核酸探针片段和第二核酸探针片段，其中第一核酸探针片段和第二核酸探针片段从目标核酸解离出来；

(c)使用来自反应混合物中相对多的核酸探针的第二核酸探针重复步骤(a)和(b)，其中形成了相对多的解离的核酸探针片段；以及

(d)检测通过相对多的核酸探针片段的解离所活化的可检测标记，这样检测了目标核酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中酶介导可切割序列是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其中切割位点定位在可以通过切割探针来活化可检测标记的位置。

4.根据权利要求1所述的方法，其中相对多的核酸探针还包括于酶介导可切割序列连接的第一探针区和第二探针区。

5.根据权利要求4所述的方法，其中第一探针区是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)中的至少一种，第二探针区是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的方法，其中酶介导可切割序列、第一探针区和第二探针区中的至少一个被进行了完全甲基化和部分甲基化中的至少一种修饰以防止非特异切割。

7.根据权利要求1所述的方法，其中可检测标记是连接在第一探针区的5′末端、第一探针区的3′末端、第二探针区的5′末端、第二探针区的3′末端、第一探针区或者第二探针区的中部、酶介导可切割序列的5′末端、酶介导可切割序列的3′末端以及酶介导可切割序列的中部中的至少一处。

8.根据权利要求1所述的方法，其中可检测的标记是从由荧光分子、放射性同位素、酶或者化学发光催化剂组成的组中选择的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中可检测标记是内部标记的荧光共振能量转移(FRET)对、外部标记FRET对、连接在第一探针区3′末端以及第二探针区5′末端的FRET对中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的方法，其中切割试剂是从由RNA酶H、堪察加半岛蟹肝胰腺的双链特异性核酸酶、核酸内切酶、切出缺口的核酸内切酶、核酸外切酶或者含有核酸酶活性的酶组成的组中选择的。

11.根据权利要求1所述的方法，其中目标核酸序列是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)中的至少一种。

12.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增目标核酸序列程序的过程中，发生了该方法的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中用于扩增目标核酸序列的程序是从由滚环扩增、聚合酶链式反应、依赖核酸序列的扩增或者链置换扩增组成的组中选择的。

14.根据权利要求1所述的方法，其中对探针片段的监测是以实时和反应后中的至少一种进行的。

15.一种实时检测目标抗原决定簇的方法，其包括：

(a)获得目标抗原决定簇；

(b)制备核酸适体，其带有连接的目标核酸序列，该目标核酸序列与含有第一酶介导可切割序列和第一可检测标记的第一核酸探针互补；

(c)将核酸适体与目标抗原决定簇进行杂交，这形成了复合物；

(d)在相对多的核酸探针中的第一核酸探针可被杂交到目标核酸序列上形成目标核酸-探针复合物的条件下，形成相对多的核酸探针的反应混合物，其中每个核酸探针都带有酶介导可切割序列和可检测标记，所述的第一核酸探针含有第一酶介导可切割序列和第一可检测标记；

(e)将目标核酸-探针复合物与切割试剂进行接触，该切割试剂在酶介导可切割序列内的切割位点对第一探针进行切割，这形成了第一探针片段和第二探针片段，其中第一探针片段和第二探针片段从目标核酸解离出来；

(f)使用来自反应混合物中相对多的核酸探针的第二核酸探针重复步骤(d)和(e)，其中形成了相对多的解离的探针片段；以及

(g)检测通过相对多的探针片段的解离所活化的可检测标记，这样检测了目标抗原决定簇。

16.根据权利要求15所述的方法，其中核酸适体包括单个核酸适体、两个或者更多核酸适体以及三个或者更多个核酸适体中的至少一种。

17.根据权利要求15所述的方法，其中抗原决定簇特异性地与连接到目标核酸序列上的抗体结合，其中抗体是单克隆抗体和多克隆抗体中的至少一种。

18.根据权利要求17所述的方法，其中多于一个目标核酸序列被连接到单克隆抗体和多克隆抗体中的至少一种。

19.根据权利要求15所述的方法，其中酶介导可切割序列是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)中的至少一种。

20.根据权利要求15所述的方法，其中切割位点定位在可以通过切割探针来活化可检测标记的位置。

21.根据权利要求15所述的方法，其中相对多的核酸探针还包括第一探针区和第二探针区，其连接到酶介导可切割序列上。

22.根据权利要求21所述的方法，其中第一探针区是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)中的至少一种。

23.根据权利要求21所述的方法，其中第二探针区是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)中的至少一种。

24.根据权利要求21所述的方法，其中酶介导可切割序列、第一探针区和第二探针区中的至少一个被进行了完全甲基化和部分甲基化中的至少一种修饰以防止非特异切割。

25.根据权利要求15所述的方法，其中切割试剂是从由RNA酶H、堪察加半岛蟹肝胰腺的双链特异性核酸酶、核酸内切酶、切出缺口的核酸内切酶、核酸外切酶或者含有核酸酶活性的酶组成的组中选择的。

26.根据权利要求15所述的方法，其中可检测标记是连接在第一探针区的5′末端、第一探针区的3′末端、第二探针区的5′末端、第二探针区的3′末端、第一探针区或者第二探针区的中部、酶介导可切割序列的5′末端、酶介导可切割序列的3′末端以及酶介导可切割序列的中部中的至少一处。

27.根据权利要求15所述的方法，其中可检测的标记是从由荧光分子、荧光抗体、放射性同位素、酶、蛋白质或者化学发光催化剂组成的组中选择的。

28.根据权利要求27所述的方法，其中可检测标记是内部标记的荧光共振能量转移(FRET)对、外部标记FRET对、连接在第一探针区3′末端以及第二探针区5′末端的FRET对中的至少一种。

29.根据权利要求15所述的方法，其中目标核酸序列是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)中的至少一种。

30.根据权利要求15所述的方法，其中在扩增目标核酸序列程序的过程中，发生了该方法的步骤。

31.根据权利要求30所述的方法，其中用于扩增所连接的目标核酸序列的程序是从由滚环扩增、聚合酶链式反应、依赖核酸序列的扩增或者链置换扩增组成的组中选择的。

32.根据权利要求15所述的方法，其中对探针片段的检测是以实时和反应后中的至少一种进行的。

33.一种实时检测目标核酸内单核苷酸多态性的方法，其包括：

(a)在相对多的核酸探针中的第一核酸探针可被杂交到目标核酸序列上形成靶-探针复合物的条件下，形成含有单核苷酸多态性的目标核酸序列和相对多的核酸探针的反应混合物，其中每个核酸探针都含有酶介导可切割序列和可检测标记，所述的第一核酸探针含有第一酶介导可切割序列和第一可检测标记；

(b)将靶-核酸复合物与切割试剂进行接触，该切割试剂在酶介导可切割序列内的切割位点对第一核酸探针进行切割，这形成了第一核酸探针片段和第二核酸探针片段，其中第一核酸探针片段和第二核酸探针片段从目标核酸解离出来；

(c)使用来自反应混合物中相对多的核酸探针的第二探针重复步骤(a)和(b)，其中形成了相对多的解离的核酸探针片段；以及

(d)检测通过相对多的核酸探针片段的解离所活化的可检测标记，这样检测了目标核酸序列的单核苷酸多态性。

34.根据权利要求33所述的方法，其中可检测的标记是从由荧光分子、荧光抗体、放射性同位素、酶、蛋白质或者化学发光催化剂组成的组中选择的。

35.根据权利要求33所述的方法，其中切割位点定位在可以通过切割探针来活化可检测标记的位置。

36.根据权利要求33所述的方法，其中在扩增目标核酸序列程序的过程中，发生了该方法的步骤。

37.根据权利要求36所述的方法，其中用于扩增目标核酸序列的程序是从由滚环扩增、聚合酶链式反应、依赖核酸序列的扩增或者链置换扩增组成的组中选择的。

38.根据权利要求33所述的方法，其中切割试剂是从由RNA酶H、DNA酶、RNA酶、解旋酶、核酸外切酶、限制性核酸内切酶以及核酸内切酶组成的组中选择的。

39.根据权利要求33所述的方法，其中对探针片段的检测是以实时和反应后中的至少一种进行的。

40.根据权利要求33所述的方法，其中核酸探针杂交到目标核酸序列上，目标核酸序列含有包括一个碱基对错配的单核苷酸多态性，这导致在与切割试剂接触后探针仍保持杂交到目标核酸序列上。