CN104160026B - 使用可裂解探针检测c-Met基因的方法 - Google Patents

使用可裂解探针检测c-Met基因的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104160026B
CN104160026B CN201380013315.3A CN201380013315A CN104160026B CN 104160026 B CN104160026 B CN 104160026B CN 201380013315 A CN201380013315 A CN 201380013315A CN 104160026 B CN104160026 B CN 104160026B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
seqidno
nucleic acid
met
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380013315.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104160026A (zh
Inventor
金桄佑
金钟源
南都铉
奇昌锡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Samsung Life Public Welfare Foundation
Original Assignee
Samsung Life Public Welfare Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Samsung Life Public Welfare Foundation filed Critical Samsung Life Public Welfare Foundation
Publication of CN104160026A publication Critical patent/CN104160026A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104160026B publication Critical patent/CN104160026B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一个具体的实施例的一种形式提供了用于检测c-Met基因表达的量的检测试剂盒，包含特异性地结合至c-Met基因的一对引物，以及可裂解探针，其特异性地结合至由该一对引物扩增的c-Met扩增产物之内。在另一个具体的实施例中，通过使用根据该一个具体的实施例的检测试剂盒测量样品中c-Met基因表达的量。当使用根据该具体的实施例的方法时，可以有效地检测甚至是处于低浓度下的c-Met基因表达的量，并且在癌症诊断和预后方面可以是有用的。

Description

使用可裂解探针检测c-Met基因的方法
技术领域
本发明涉及癌症诊断试剂盒和使用其的诊断方法。更具体地，本发明涉及通过使用引物组和可裂解探针使得能够实时地检测基因的试剂盒以及使用其的诊断方法。
背景技术
c-Met是肝细胞生长因子(HGF)受体，而HGF是一种细胞因子，其结合至c-Met受体酪氨酸激酶的胞外区以引起各种正常细胞和肿瘤细胞中的分裂、移动、形态发生和血管生成。c-Met是存在于细胞表面的代表性的受体酪氨酸激酶。与HGF无关(其是配体)，由于c-Met自身也是致癌基因并且有时参与多种相关的机制如肿瘤发生、转移、癌症细胞迁移，癌症细胞侵袭和血管生成，因此c-Met是作为抗癌靶而引起关注的蛋白质。
此外，c-Met在许多类型的癌症中过表达。特别地，已知c-Met过表达主要涉及患者预后不良的原因。因此，可以使用可以特异性地扩增c-Met基因的引物组以通过使用取自患者的临床样品来测量患者中的癌症发展。此外，引物组可以被用作选择癌症治疗剂或治疗方法的重要决策信息。因此，需要开发特异性地结合至c-Met的基因或mRNA的引物或探针，或者能够验证c-Met基因或mRNA的过表达程度的诊断试剂盒。
最近，聚合酶链反应(PCR)被用于检测或扩增基因。利用PCR技术实现高通量PCR筛选已经引起了现代生物学和医学的创新性变革。分析技术对包括诊断、环境监测、血液检测和基因型分析在内的许多研究领域产生了重大影响。随着生物信息学时代的到来，科学家处理基因信息的能力超过以往任何时候。然而，为了能够检测较小量的DNA并实时验证DNA扩增量，许多相关研究仍在进行。
因此，改进PCR方法以开发检测c-Met基因的方法，其可以在癌症诊断中更加有效地使用。在以上结果的基础上，开发了本发明的基于探针的检测试剂盒和诊断方法。
发明内容
技术问题
本发明的一种实施方式提供了c-Met基因检测试剂盒，该检测试剂盒包含引物组和可裂解探针(cleavableprobe)。
本发明的另一种实施方式提供了通过使用含有引物组和可裂解探针的c-Met基因检测试剂盒检测c-Met基因的方法。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了用于检测c-Met基因的表达的检测试剂盒，其中，检测试剂盒包括：特异性结合至c-Met基因的引物组；特异性地结合至由引物组扩增的c-Met扩增产物的内部的可裂解探针。
本发明的一个实施方式提供了c-Met基因检测试剂盒，包括含有SEQIDNO:1的核酸的引物、含有SEQIDNO:2的核酸的引物和含有SEQIDNO:7的核酸的可裂解探针。
本发明的另一个实施方式提供了c-Met基因检测试剂盒，包括含有SEQIDNO:3的核酸的引物、含有SEQIDNO:4的核酸的引物和含有SEQIDNO:8的核酸的可裂解探针。
本发明的另一个实施例，提供了c-Met基因检测试剂盒，包括含有SEQIDNO:5的核酸的引物、含有SEQIDNO:6的核酸的引物和含有SEQIDNO:9的核酸的可裂解探针。
本文使用的术语“c-Met基因”是指编码结合到肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶的基因。例如，c-Met基因可以对应于GenBank登录号NM_000245或GenBank登录号NM_000236。
c-Met蛋白在许多类型的癌症中过表达。特别地，已知c-Met过表达主要涉及患者中预后不良的原因。通过测定可能引起c-Met蛋白过表达的c-Met基因的过表达可以诊断的癌症类型包括肿瘤(恶性上皮肿瘤，carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤和白血病等，但不限于此。癌症(cancer)包括，例如，膀胱癌、乳癌(breastcancer)、子宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤、成人T细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤/星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤和肾母细胞瘤，但不限于此。
本文所用的术语“引物”可以与“寡核苷酸”或“多核苷酸”互换地使用。引物是指在PCR中用作DNA合成的起点的寡核苷酸。引物通常包含约15至约35个核苷酸，并与靶序列的互补区杂交。
本文使用的术语“探针”指的是特异性地结合至靶序列的寡核苷酸，并且包括，例如，含有特定区域的多核苷酸，该特定区域被设计为可通过序列特异方法与特定核酸序列(如靶核酸序列)互补区域杂交。在本发明的一个实施方式中，寡核苷酸探针包含约15至约60个核苷酸。适当地，寡核苷酸探针包含约18至约30个核苷酸。
本文使用的术语“可裂解探针(可断裂探针，cleavableprobe)”是指包括两种类型的核酸的探针，例如，在DNA探针的内部还包含一些RNA核苷酸的DNA探针。可裂解探针可以含有内部区域，其中约1至10个DNA核苷酸被替换为RNA核苷酸、其中约2至8个DNA核苷酸被替换为RNA核苷酸或者其中约3至7个DNA核苷酸被替换为RNA核苷酸，但并不限于此。此外，RNA核苷酸可以连续或不连续地定位于在探针内。适当地，可裂解探针可以是SEQIDNOS:7至SEQIDNOS:9的探针之一，但并不限于此。
此外，可裂解探针可以在探针的两端或内部标记有可检测物质。用于PCR的混合物包含RNA酶(核糖核酸酶，RNase酶)，其可以特异性地切割RNA-DNA双链中的RNA序列部分。在由RNA酶切割后，可裂解探针的所有片段将在反应温度下从靶扩增子解离并散布在反应溶液中。由于标记在探针中的供体和受体被分离，可以监测供体的荧光发射。
本文使用的术语“标记物(标签，label)”或“可检测标记”指的是通过共价键或非共价键结合至探针的荧光染料(荧光物，fluorochrome)化合物，并且可以是包含荧光供体和荧光受体的荧光共振能量转移(FRET)对。
本文使用的术语“荧光染料”是指被具有短于所发射的光的波长的波长的光激发后能发光的荧光物质。此外，术语“荧光供体”是指发射由本发明中公开的测定法测量的光的荧光染料。同时，荧光供体可以提供由荧光受体所吸收的光。本文使用的术语“荧光受体”是指吸收由荧光供体发射的能量的二级荧光染料或猝灭剂。二级荧光染料吸收由荧光供体发射的能量并且随后发射具有长于由荧光供体发射光的光的波长的波长的光。猝灭剂吸收从荧光供体发射的能量。
任何发光分子，适当地是荧光染料和/或猝灭剂，可以用于本发明的实施方式中。例如，发光分子可以是AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、荧光素、OregonGreen488、OregonGreen514、四甲基若丹明、若丹明X、德克萨斯红(TexasRed)染料、QSY7、QSY33、Dabcyl、BODIPYFL、BODIPY630/650、BODIPY6501665、BODIPYTMR-X、BODIPYTR-X、二烷基氨基香豆素、Cy3(青色素3)、Cy3.5、Cy5.5、Cy5、DTPA(Eu3+)-AMCA、以及TTHA(Eu3+)AMCA，但不限于此。适当地，发光分子可以是包括6-FAM和爱荷华黑BQ(IowaBlackBQ)的荧光共振能量转移对(FRET)，但不限于此。
此外，用于检测c-Met基因的试剂盒可以进一步含有热稳定聚合酶或RNA酶，并且试剂盒中含有的酶可以是热稳定聚合酶及热稳定RNA酶。
在本文中使用并应用于酶的术语“热稳定的”是指酶在升高的温度下(例如55℃或更高)，或在加热和冷却重复的循环中保持生物学活性。热稳定的多核苷酸聚合酶可以尤其适用于PCR扩增反应。在本发明的实施方式中，热稳定的多核苷酸聚合酶可以是Taq聚合酶。热稳定的多核苷酸聚合酶可以是选自由AmpliTaq、AmpliTaqStoffelfragment、SuperTaq、SuperTaqplus、LATaq、LAproTaq以及EXTaq组成的组中的Taq聚合酶。此外，在本文中使用的术语“RNA酶”是指特异性切割RNA的酶。RNA可以是由使用RNA和DNA的杂交形成的杂交双链的双链RNA。
此外，试剂盒可以提供为包括具有一种或多种试剂的包装单元(packageunit)的试剂盒。试剂盒可以包含选自由以下物品组成的组中的至少一种：缓冲液、操作指南和阳性或阴性对照组。试剂盒可以包括以适当比例混合以进行本文所描述的方法的试剂的容器。试剂容器适当地包括单位数(unitnumber)的试剂以省略完成该方法时的衡量(计量，measuring)。在本发明另一个实施方式中，试剂盒进一步包括用于从生物学样品提取基因组DNA或RNA的试剂。此外，试剂盒试剂可以包括用于逆转录酶-PCR分析的试剂。
本发明的另一个方面提供了检测c-Met基因的方法，该方法包括：
从样品中获得DNA；
使样品与选自由以下组成的组中的至少一个引物-探针组混合以制备混合物：包括含有SEQIDNO:1的核酸的引物、含有SEQIDNO:2的核酸的第二引物以及含有SEQIDNO:7的核酸的可裂解探针的第一引物-探针组；包括含有SEQIDNO:3的核酸的引物、含有SEQIDNO:4的核酸的引物以及含有SEQIDNO:8的核酸的可裂解探针的第二引物-探针组；包括含有SEQIDNO:5的核酸的引物、含有SEQIDNO:6的核酸的引物以及含有SEQIDNO:9的核酸的可裂解探针的第三引物-探针组；
使聚合酶、RNA酶和扩增缓冲液与该混合物混合以扩增混合物中的DNA；和
检测由探针上的标记发射的信号的增加。
检测c-Met基因的方法详细说明如下。
首先，检测c-Met基因的方法可以包括从样品获得DNA。样品可以获自癌症患者或愿意接受癌症进展诊断的个体，或特定的人体部分。
DNA可以是gDNA(基因组DNA)、cDNA(互补DNA)或DNA片段。DNA可直接从细胞中获得。此外，为检测DNA表达，可以从细胞获得mRNA，然后通过进行逆转录酶PCR从该mRNA获得cDNA。
随后，检测c-Met基因的方法可以包括使样品与选自由以下组成的组中的至少一个引物-探针组混合以制备混合样品：包括含有SEQIDNO:1的核酸的引物、含有SEQIDNO:2的核酸的第二引物以及含有SEQIDNO:7的核酸的可裂解探针的第一引物-探针组；包括含有SEQIDNO:3的核酸的引物、含有SEQIDNO:4的核酸的引物以及含有SEQIDNO:8的核酸的可裂解探针的第二引物-探针组；包括含有SEQIDNO:5的核酸的引物、含有SEQIDNO:6的核酸的引物以及含有SEQIDNO:9的核酸的可裂解探针的第三引物-探针组。
可裂解探针可以在其两端或内部标记有可检测物质，并且可以标记有包括荧光供体和荧光受体的荧光共振能量转移(FRET)对。
随后，检测c-Met基因的方法可以包括使聚合酶、RNA酶和扩增缓冲液使混合样品混合以扩增混合物中的DNA。可以使用任何热稳定聚合酶或RNA酶。
本文中所使用的术语“扩增缓冲液”是指被添加到扩增反应中以控制扩增反应并因此改变扩增反应中至少一个要素的稳定性、活性和/或生命周期(lifecycle)的复合物(混合物、化合物，compound)。扩增缓冲液可以与PCR扩增和RNaseH切割活性相容。例如，缓冲液的实例包括含有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、乙酸盐或磷酸盐的缓冲液，但不限于此。
PCR缓冲液通常包括约70mM或更低的KCl，约1.5mM或更高的MgCl2，以及约50至约200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP的每种。缓冲液可进一步包含用于更有效的逆转录酶PCR或优化PCR的添加剂。
添加剂是指为了改变组合物的至少一个要素的稳定性、活性和/或生命周期而添加的化合物。添加剂的实例包括可以改变扩增效率的甜菜碱、甲酰胺、KCl、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH4OAc、NaI、Na(CO3)2、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、二硫苏糖醇(DTT)、焦磷酸酶、无机焦磷酸酶(TAP)、阳离子、以及其他化合物、蛋白质或辅因子，但不限于此。可以选择地加入添加剂以促进引物退火的选择性。
随后，检测c-Met基因的方法可包括检测由探针上的标记发射的信号的增加。发射的信号可以是荧光。可以通过使用适当的装置如AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCR系统或BioradCFX96real-timePCR热循环仪检测荧光发射的结果，但可以使用在本领域中可用的所有装置。
此外，检测c-Met基因的方法可以包括逆转录PCR，其中，从样品获得RNA并通过使用逆转录酶扩增RNA以将获得的cDNA提供为样品DNA。RNA可以获自癌症患者或愿意经历癌症诊断的个人，随后可以通过使用逆转录酶扩增RNA以获得cDNA。可以使用本领域中可用的任何方法进行通过逆转录酶来逆转录为cDNA。
在逆转录PCR中，使用模版特异性DNA引物以产生互补DNA链。然后，在PCR中，产物被改变，并且第二模板特异性引物结合至该cDNA，并延伸以形成双链体(duplex)DNA。在接下来的温度循环中扩增所得到的产物。为了保持最高灵敏度，防止RNA在cDNA合成之前被降解是重要的。
检测c-Met基因的方法可以用于验证c-Met的表达并因此诊断肿瘤(恶性上皮细胞肿瘤，carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病，但不限于此。具体地，癌症包括膀胱癌、乳癌、子宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤、成人T细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤/星形细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤和肾母细胞瘤，但不限于此。
有益效果
当使用根据本发明的实施方式的引物组和可裂解探针(其中，该引物组和探针特异性地结合至c-Met)时，可以实时检测出极少量的c-Met表达，从而可以诊断与c-Met过表达相关的多种癌症并且容易地确定预后。
附图说明
图1示出通过使用第一引物-探针组扩增c-Met靶核苷酸序列的实验结果。
图2示出通过使用第二引物-探针组扩增c-Met靶核苷酸序列的实验结果。
图3示出通过使用第三引物-探针组扩增c-Met靶核苷酸序列的实验结果。
具体实施方式
实施例
以下，参照下面的实施例对本发明进行更详细地说明。然而，这些实施例仅用于说明目的，并不意在限制本发明的使用范围。
实施例1：制备用于c-Met检测的引物组和探针
制备用于c-Met检测的总共三组的引物组和引物(F：正向引物，R：反向引物，IN：CataCleave探针)。(由IntegratedDNATechnologies,Inc.合成)。
表1
在表1中，显示为小写字母的核苷酸是RNA。
此外，通过在5'端使用6-FAM(其是荧光染料)并且在3'端使用爱荷华黑RQ(其是猝灭剂)标记CataCleave(其是可裂解探针)的两个DNA末端。
实施例2：取样
将MET-1基因(SEQIDNO:10)用于第一引物组和第二引物组的阳性反应，而将MET-2基因(SEQIDNO:11)用于第三引物组的阳性反应。将编码基因序列的多核苷酸插入pGEM-3Z(Promega)的EcoR1/BamH1位点以制备阳性样品。
实施例3：通过使用用于c-Met检测的引物组和探针检测c-Met基因
使用引物、探针、扩增缓冲液(32mMHEPES-KOH，pH7.8；100mM乙酸钾；4mM乙酸镁；0.11％牛血清白蛋白；1％二甲亚砜)，dUTP/NTP混合物(dGTP、dCTP和dATP各80μM，dUTP160μM)、2.5单位的ThermusaquaticusDNA聚合酶、1单位的PyrococcusfuriosisHII以及0.1单位的尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase)，在RABI7500系统(AppliedBiosystem)中根据如下循环方案进行PCR：95℃预变性5分钟；50次循环的95℃变性10秒、65℃退火10秒和72℃扩增40秒；72℃最终延伸5分钟。当温度为65℃时监测FAM发射(参见图1至图3)。
工业实用性
当使用根据本发明的一个实施方式的引物和探针时，与常规PCR的浓度相比，可以容易地检测出非常低浓度的c-Met基因。因此，在进行逆转录PCR后，可以使用根据本发明的一个实施方式的引物-探针组以确定c-Met基因的表达。
序列表自由文字
SEQIDNO:1：
TCATGGGTCAATTCAGCGAAGTCCTCT
SEQIDNO:2：
tggagacactggatgggagtcca
SEQIDNO:3：
ctcctgggaatctgcctgcga
SEQIDNO:4：
tgcagccaagtctctgtggacaaac
SEQIDNO:5：
ggcagtgcagcatgtagtgattgg
SEQIDNO:6：
tgatgattccctcggtcagaaattggg
SEQIDNO:7：
tgggacatcagagggtcgcttca
SEQIDNO:8：
aagggtctccgctggtggtc
SEQIDNO:9：
gcccagtagccugautgtgcatttca
SEQIDNO:10：
agagtttaccacagctttgcagcgcgttgacttattcatgggtcaattcagcgaagtcct
cttaacatctatatccaccttcattaaaggagacctcaccatagctaatcttgggacatc
agagggtcgcttcatgcaggttgtggtttctcgatcaggaccatcaacccctcatgtgaa
ttttctcctggactcccatccagtgtctccagaagtgattgtggagcatacattaaacca
aaatggctacacactggttatcactgggaagaagatcacgaagatcccattgaatggctt
gggctgcagacatttccagtcctgcagtcaatgcctctctgccccaccctttgttcagtg
tggctggtgccacgacaaatgtgtgcgatcggaggaatgcctgagcgggacatggactca
acagatctgtctgcctgcaatctacaaggttttcccaaatagtgcaccccttgaaggagg
gacaaggctgaccatatgtggctgggactttggatttcgg
SEQIDNO:11：
ctcagtgctctaaatccagagctggtccaggcagtgcagcatgtagtgattgggcccagt
agcctgattgtgcatttcaatgaagtcataggaagagggcattttggttgtgtatatcat
gggactttgttggacaatgatggcaagaaaattcactgtgctgtgaaatccttgaacaga
atcactgacataggagaagtttcccaatttctgaccgagggaatcatcatgaaagatttt
agtcatcccaatgtcctctcgctcctgggaatctgcctgcgaagtgaagggtctccgctg
gtggtcctaccatacatgaaacatggagatcttcgaaatttcattcgaaatgagactcat
aatccaactgtaaaagatcttattggctttggtcttcaagtagccaaaggcatgaaatat
cttgcaagcaaaaagtttgtccacagagacttggctgcaag

Claims (6)

1.一种c-Met基因检测试剂盒，包括由SEQIDNO:5的核酸组成的引物、由SEQIDNO:6的核酸组成的引物和由SEQIDNO:9的核酸组成的可裂解探针，其中所述可裂解探针的两端标记有荧光染料。
2.根据权利要求1所述的c-Met基因检测试剂盒，进一步包括由SEQIDNO:1的核酸组成的引物、由SEQIDNO:2的核酸组成的引物和由SEQIDNO:7的核酸组成的可裂解探针。
3.根据权利要求1所述的c-Met基因检测试剂盒，进一步包括由SEQIDNO:3的核酸组成的引物、由SEQIDNO:4的核酸组成的引物和由SEQIDNO:8的核酸组成的可裂解探针。
4.根据权利要求1至3之一所述的c-Met基因检测试剂盒，其中，所述c-Met基因检测试剂盒进一步包含聚合酶和RNA酶，所述聚合酶和RNA酶是热稳定的。
5.根据权利要求1所述的c-Met基因检测试剂盒，其中，所述荧光染料是荧光共振能量转移FRET对。
6.包括引物的引物-探针组在制备用于检测c-Met基因的试剂中的用途，所述引物-探针组包括由SEQIDNO:5的核酸组成的引物、由SEQIDNO:6的核酸组成的引物和由SEQIDNO:9的核酸组成的可裂解探针，其中所述可裂解探针的两端标记有荧光染料。
CN201380013315.3A 2012-01-09 2013-01-09 使用可裂解探针检测c-Met基因的方法 Active CN104160026B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2012-0002465 2012-01-09
KR1020120002465A KR101404682B1 (ko) 2012-01-09 2012-01-09 절단 가능한 프로브를 이용한 ｃ―Ｍｅｔ 유전자 검출 방법
PCT/KR2013/000139 WO2013105774A1 (ko) 2012-01-09 2013-01-09 절단 가능한 프로브를 이용한 ｃ－Ｍｅｔ 유전자 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104160026A CN104160026A (zh) 2014-11-19
CN104160026B true CN104160026B (zh) 2016-04-20

Family

ID=48781676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380013315.3A Active CN104160026B (zh) 2012-01-09 2013-01-09 使用可裂解探针检测c-Met基因的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9587280B2 (zh)
KR (1) KR101404682B1 (zh)
CN (1) CN104160026B (zh)
WO (1) WO2013105774A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015065008A1 (ko) * 2013-10-28 2015-05-07 서울대학교산학협력단 섬유묶음 절단물을 이용한 다중 바이오어세이 플랫폼
CN104946634A (zh) * 2015-06-04 2015-09-30 陕西师范大学 一种双标记荧光激活型探针及其检测dna的方法
CN112852929A (zh) * 2021-02-08 2021-05-28 广州普世利华科技有限公司 用于检测dna的组合产品
CN117187395A (zh) * 2023-11-06 2023-12-08 神州医疗科技股份有限公司 一种met基因扩增定量检测的引物探针组、试剂盒和系统

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1875117A (zh) * 2003-11-25 2006-12-06 韩勉基 对核酸和蛋白质的实时检测
CN101180410A (zh) * 2005-03-25 2008-05-14 健泰科生物技术公司 肺癌中的c-met突变

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011188856A (ja) * 2010-03-11 2011-09-29 Samsung Techwin Co Ltd リアルタイムｐｃｒのための核酸テンプレートの製造

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1875117A (zh) * 2003-11-25 2006-12-06 韩勉基 对核酸和蛋白质的实时检测
CN101180410A (zh) * 2005-03-25 2008-05-14 健泰科生物技术公司 肺癌中的c-met突变

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"The HGF Receptor c-Met Is Overexpressed in Esophageal Adenocarcinoma";Luis J.Herrera et al.;《Neoplasia》;20050131;第7卷(第1期);第76页表1 *
Characterization and applications of CataCleave probe in real-time detection assays;John J.Harvey et al.;《Analytical Biochemistry》;20040720;第333卷;第248页左栏第2段，第249页图1，第254页左栏第2段、右栏第1段 *
c-Met Expression Level in Primary colon Cancer:A Predictor of Tumor Invasion and Lymph Node Metastases;Hiroya Takeuchi et al.;《Clinical Cancer Research》;20030430;第9卷;第1481页右栏第2段 *

Also Published As

Publication number Publication date
US9587280B2 (en) 2017-03-07
WO2013105774A1 (ko) 2013-07-18
US20150247200A1 (en) 2015-09-03
CN104160026A (zh) 2014-11-19
KR101404682B1 (ko) 2014-06-10
KR20130081468A (ko) 2013-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102246600B1 (ko) 핵산 검정에서 개선된 용융 판별 및 멀티플렉싱을 위한 프로브
US11725242B2 (en) Nucleic acid amplification controls and kits and methods of use thereof
US20100184015A1 (en) Method for detection of xmrv
CN104160026B (zh) 使用可裂解探针检测c-Met基因的方法
US20120045747A1 (en) Kit for detecting hepatitis b virus and method for detecting hepatitis b virus using the same
US20140248611A1 (en) Nucleic acid probe for assaying nucleic acids
CN105745335A (zh) 用于对cMET核酸进行多模态分析的组合物及方法
ES2705849T3 (es) Acidos nucleicos para la amplificación de ácidos nucleicos
CN103103259A (zh) 确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物
CN105734117A (zh) 利用通用引物的核酸目标待测位点检测方法
CN105734167A (zh) 多重靶核酸检测方法
AU2011209624B2 (en) Methods and kits used in the detection of fungus
Zhang et al. Target-activated T7 transcription circuit-mediated multiple cycling signal amplification for monitoring of flap endonuclease 1 activity in cancer cells
KR20140024411A (ko) 토크 테노 바이러스 진단
KR101753833B1 (ko) 절단 가능한 프로브를 이용한 만성골수성백혈병 유전자의 멀티플렉스 검출 방법
CN105734116A (zh) 多重核酸位点检测方法
CN103725775A (zh) 一种采用等位基因rna等温扩增法来快速检测braf基因突变的方法
US20230366038A1 (en) Compositions and methods relating to loop mediated isothermal amplification (lamp)
US20220127658A1 (en) Systems and methods for ultra-specific and ultra-sensitive nucleic acid detection
Kitaoka et al. Simultaneous visual detection of single-nucleotide variations in tuna DNA using DNA/RNA chimeric probes and ribonuclease A
CN102369297A (zh) 识别基因型的方法
US20160053302A1 (en) Method for visual identification of pcr solutions for accurate reaction setup
CN109477139A (zh) 使用长ssDNA多核苷酸作为PCR测定中的引物的方法
CN105734119A (zh) 利用通用探针的核酸目标待测位点检测方法
CN106916882A (zh) 用于辨识核苷酸基因多型性的基因型鉴定芯片的双重等位基因特异性聚合酶链锁反应的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant