CN104946634A

CN104946634A - 一种双标记荧光激活型探针及其检测dna的方法

Info

Publication number: CN104946634A
Application number: CN201510304453.8A
Authority: CN
Inventors: 李正平; 周浩贤; 刘成辉
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明公开了一种双标记荧光激活型探针及其检测DNA的方法，该探针是与待测DNA碱基互补的5～40个碱基长度的单链RNA，或是与待测DNA碱基互补的5～40个碱基长度的单链DNA，且该DNA序列中有1/5～4/5的碱基是RNA碱基，探针的两端分别标记荧光基团和猝灭基团。本发明探针结构简单，荧光被完全猝灭，当其与待测DNA杂交形成DNA/RNA杂合双链后，RNase H特异性水解DNA/RNA结构中的RNA链，使荧光基团远离猝灭基团，荧光信号得以恢复，同时游离的探针进一步与待测DNA杂交、被RNase H水解并产生荧光信号，如此循环反复，使体系荧光信号显著放大，实现了待测DNA的快速、高灵敏度检测。本发明探针还可用于扩增产物中DNA的定量检测。

Description

一种双标记荧光激活型探针及其检测DNA的方法

技术领域

本发明属于生物分子及基因标志物检测技术领域，具体涉及一种双标记荧光激活型探针，以及应用该探针在核糖核酸酶H(RNase H)辅助下高灵敏度分析检测DNA的方法。

背景技术

DNA是生命体重要的遗传物质，对特定序列DNA进行准确、灵敏检测对于遗传疾病、病原性疾病的早期诊断以及对食物、环境样品中病原菌检测都具有十分重要的意义。DNA的含量检测通常是通过DNA杂交反应，结合各种信号标记技术来实现的。如常用的Southern印迹杂交方法，需要经过电泳分离结合放射性同位素标记或酶标记，利用放射自显影或酶反应显色实现特定序列DNA的定量分析。该方法存在放射性危害等弊端，且检测信号无法实时监测，需要复杂的操作步骤才能实现信号的读出。近年来，基于荧光标记的DNA杂交检测方法由于设计灵活、操作简便、实用性强而获得了广泛的应用。分子信标(Molecular Beacon，简称MB)探针技术是该类方法的突出代表。MB探针是一种茎-环结构的短链DNA，其环状部分大约为20个碱基长度，和靶标DNA互补，其茎部双链两端分别标记荧光分子和猝灭基团。无靶标DNA时，MB以发卡结构存在，荧光猝灭。靶标DNA存在时会与MB的环状部分杂交从而打开MB的发卡结构，使荧光基团和猝灭基团远离，荧光得以恢复，产生靶标DNA的特异性荧光信号。基于分子信标的DNA检测方法能够实时监测体系DNA的含量信息，已获得了广泛的应用。但需要指出的是每个靶标DNA分子只能与一个MB探针反应而仅激活一个荧光分子的荧光，缺乏信号放大机制，使得检测灵敏度受到了极大的制约。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种结构简单的双标记荧光激活型探针，该探针在RNase H辅助下能够实现对生物样品以及核酸扩增反应产物中DNA分子的快速、高灵敏检测。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：所述双标记荧光激活型探针是与待测DNA序列碱基互补的5～40个碱基长度的单链RNA，或者是与待测DNA序列碱基互补的5～40个碱基长度的单链DNA，且该DNA序列中有1/5～4/5的碱基是RNA碱基，该探针的一个末端修饰荧光基团，另一个末端修饰猝灭基团。

上述双标记荧光激活型探针优选与待测DNA序列碱基互补的10～30个碱基长度的RNA，或者优选与待测DNA序列碱基互补的10～30个碱基长度的单链DNA，且该DNA序列中有1/2～4/5的碱基是RNA碱基，该探针的两个末端分别标记荧光基团和猝灭基团。

上述的荧光基团为荧光标记物为荧光素类、罗丹明类、香豆素类及它们的衍生物中的任意一种或花青染料，具体如：6-羧基荧光素(FAM)、羧基四甲基罗丹明、2,7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、德克萨斯红、3H-吲哚菁染料中的任意一种；上述的猝灭基团为黑洞猝灭基团(BHQ)、4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(Dabcyl)、[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯胺(Eclipse)及它们的衍生物中的任意一种。

采用本发明双标记荧光激活型探针检测DNA的方法为：将双标记荧光激活型探针、核糖核酸酶H、不同浓度待测DNA标准样品混合，在30～40℃下反应，实时监测反应体系的荧光信号，反应完全后，根据不同浓度待测DNA标准样品对应的荧光强度绘制标准曲线；然后按照上述方法测试待测DNA样品对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测DNA的定量检测。

上述检测方法中，优选反应体系中双标记荧光激活型探针的初始浓度为0.6～1.2μmol/L，核糖核酸酶H的初始活性为2～5U。

本发明的双标记荧光激活型探针结构简单，探针一末端修饰荧光基团，另一末端修饰猝灭基团，由于两末端距离接近，荧光被完全猝灭。该探针与待测DNA杂交形成DNA/RNA杂合双螺旋结构后，RNase H会高选择性水解DNA/RNA双螺旋结构中的RNA，使得荧光分子远离猝灭基团，荧光信号得以恢复，而对单链RNA及DNA无影响。在此基础上，游离的探针会进一步与待测DNA杂交、被RNase H水解并产生荧光信号，如此循环反复，使得体系荧光信号得到显著放大，从而可实现待测DNA的快速、高灵敏度检测，克服了基于分子信标等荧光标记技术的DNA杂交检测方法缺乏有效信号放大机制这一显著缺点，且基于该探针的信号放大机制只需要在常温条件下即可进行，检测信号可实时监测，大大简化了DNA检测的操作步骤。除用于直接检测生物样品中的待测DNA外，该探针还可以进一步与各种核酸扩增反应相结合，用于扩增产物中特定DNA序列的定量检测。

附图说明

图1是双标记荧光激活型探针信号放大体系用于DNA检测的原理图。

图2是实施例1中的双标记荧光激活型探针检测不同浓度待测DNA的实时荧光监测图。

图3是实施例1中的双标记荧光激活型探针检测待测DNA的荧光信号与DNA浓度的线性关系图。

图4是实施例2中的双标记荧光激活型探针检测待测DNA的实时荧光监测图。

图5是实施例2中的双标记荧光激活型探针检测待测DNA的荧光信号与DNA浓度的线性关系图。

图6是双标记荧光激活型探针用于滚环扩增(RCA)产物检测的原理图。

图7是实施例3中的双标记荧光激活型探针检测RCA产物的实时荧光监测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

针对待测DNA序列TAAATGATAGTAGAGTTATGCTAA(由生工生物工程(上海)股份有限公司提供)，设计与其碱基互补的14个碱基长度的RNA，其碱基序列为AUAACUCUACUAUC，3’-末端标记黑洞猝灭基团(BHQ1)、5’-末端标记6-羧基荧光素(FAM)，得到双标记荧光激活型探针(由Integrated DNA Technologies(USA)提供)，由于距离接近，FAM的荧光信号被BHQ1所猝灭。在1×RNase H缓冲介质中加入双标记荧光激活型探针、RNase H、待测DNA标准样品，混合均匀，在37℃下反应，控制反应体系中双标记荧光激活型探针的初始浓度为0.8μmol/L、RNase H的初始活性为2.5U，并控制反应体系中待测DNA标准样品的初始浓度分别为0、1、5、10、20nmol/L，利用StepOne实时定量PCR系统检测反应体系的荧光强度(F)，检测原理如图1所示，荧光强度随待测DNA标准样品浓度(C_DNA)变化的荧光光谱图见图2，并绘制反应120分钟后荧光强度随待测DNA标准样品浓度变化的线性曲线图，结果见图3。由图2可见，随待测DNA标准样品浓度在0～20nmol/L范围内逐渐升高，反应体系荧光信号逐渐增强。由图3可见，荧光强度与待测DNA标准样品浓度呈线性关系，线性方程为：

F＝357.9+1740.2×C_DNA

相关系数r为0.9985，由相关系数可见，荧光强度与待测DNA标准样品浓度的线性关系很好。

按照上述方法测试待测DNA样品对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测DNA样品的定量检测。

实施例2

针对待测DNA序列TAAATGATAGTAGAGTTATGCTAA(由生工生物工程(上海)股份有限公司提供)，设计与其碱基互补的14个碱基长度的DNA，且其中有3个连续的碱基是RNA碱基，其碱基序列为ATAACrUrCrUACTATC，3’-末端标记BHQ1，5’-末端标记FAM，得到双标记荧光激活型探针(由Integrated DNATechnologies(USA)提供)，由于距离接近，FAM的荧光信号被BHQ1所猝灭。按照实施例1的方法，先检测荧光强度随待测DNA标准样品浓度(C_DNA)变化的荧光光谱图(见图4)，并绘制反应120分钟后荧光强度随待测DNA标准样品浓度变化的线性曲线图(见图5)，由图4可见，随待测DNA标准样品浓度在0～20nmol/L范围内逐渐升高，反应体系荧光信号逐渐增强，由图5可见，荧光强度与待测DNA标准样品浓度呈线性关系，线性方程为：

F＝1833.9+327.9×C_DNA

相关系数r为0.9979，由相关系数可见，荧光强度与待测DNA标准样品浓度的线性关系很好。然后测试待测DNA样品对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测DNA样品的定量检测。

实施例3

除了进行生物样品中DNA分子的直接检测外，本发明的双标记荧光激活型探针还可用于核酸扩增体系中DNA产物的检测，下面以RCA产物分析为例，原理如图6所示，具体实施步骤如下：

1、针对人体p53基因外显子8的一段突变DNA序列TTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACTGGCGCACAGAGGAAGAGAATCT(由Integrated DNA Technologies(USA)提供)，设计挂锁式探针GTCTCTCCCAGGACAGGCTTTTGATCACAGTTTACGGTTTAGCATAACTCTACTATCATTTACTTTACGATTTCGGCTCTTCCTCTGTGCGCCA(由Integrated DNA Technologies(USA)提供)，在1×嗜热DNA连接酶缓冲介质中加入挂锁式探针、连接酶、待测DNA标准样品，混合均匀，在70℃下反应，控制反应体系中挂锁式探针的初始浓度为20nmol/L、连接酶的初始活性为1.0U，并控制反应体系中突变DNA标准样品的初始浓度分别为0、0.1、0.5、1、10、100pmol/L，挂锁式探针成环后加入引物(TAAACCGTAAACTGTGATCA，由Integrated DNA Technologies(USA)提供)，在37℃下进行RCA反应，这样RCA产物上就存在很多与挂锁式探针序列互补的相同重复序列。

2、针对RCA产物中的重复序列，设计与其碱基互补的14个碱基长度的RNA，其碱基序列为AUAACUCUACUAUC，3’-末端标记BHQ1、5’-末端标记FAM，得到双标记荧光激活型探针(由Integrated DNA Technologies(USA)提供)。在RCA过程中加入双标记荧光激活型探针和RNase H，控制反应体系中双标记荧光激活型探针的初始浓度为0.8μmol/L、RNase H的初始活性为2.5U，在RCA的同时即可同时进行探针与RCA产物的杂交、RNase H酶切、荧光恢复这一循环信号放大过程，利用StepOne实时定量PCR系统实时监测体系的荧光信号(如图7所示)，由图可见，随待测DNA标准样品浓度在0～100pmol/L逐渐升高，体系荧光信号逐渐增强，表明本发明的双标记荧光激活型探针和检测方法可用于核酸扩增体系中特定DNA产物的定量检测。

Claims

1.一种用于检测DNA的双标记荧光激活型探针，其特征在于：所述探针是与待测DNA序列碱基互补的5～40个碱基长度的单链RNA，或者是与待测DNA序列碱基互补的5～40个碱基长度的单链DNA，且该DNA序列中有1/5～4/5的碱基是RNA碱基，该探针的两个末端分别标记荧光基团和猝灭基团。

2.根据权利要求1所述的用于检测DNA的双标记荧光激活型探针，其特征在于：所述探针是与待测DNA序列碱基互补的10～30个碱基长度的单链RNA，且探针的两个末端分别标记荧光基团和猝灭基团。

3.根据权利要求1所述的用于检测DNA的双标记荧光激活型探针，其特征在于：所述探针是与待测DNA序列碱基互补的10～30个碱基长度的单链DNA，且该DNA序列中有1/2～4/5的碱基是RNA碱基，该探针的两个末端分别标记荧光基团和猝灭基团。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的用于检测DNA的双标记荧光激活型探针，其特征在于：所述荧光基团为荧光标记物为荧光素类、罗丹明类、香豆素类及它们的衍生物中的任意一种或花青染料。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的用于检测DNA的双标记荧光激活型探针，其特征在于：所述荧光基团为6-羧基荧光素、羧基四甲基罗丹明、2,7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、德克萨斯红、3H-吲哚菁染料中的任意一种。

6.根据权利要求1～3任意一项所述的用于检测DNA的双标记荧光激活型探针，其特征在于：所述猝灭基团为黑洞猝灭基团、4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸、[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮基]-苯胺及它们的衍生物中的任意一种。

7.采用权利要求1所述的双标记荧光激活型探针检测DNA的方法，其特征在于：将双标记荧光激活型探针、核糖核酸酶H、不同浓度待测DNA标准样品混合，在30～40℃下反应，实时监测反应体系的荧光信号，反应完全后，根据不同浓度待测DNA标准样品对应的荧光强度绘制标准曲线；然后按照上述方法测试待测DNA样品对应的荧光强度，根据标准曲线即可实现待测DNA的定量检测。

8.根据权利要求7所述的检测DNA的方法，其特征在于：所述反应体系中，双标记荧光激活型探针的初始浓度为0.6～1.2μmol/L，核糖核酸酶H的初始活性为2～5U。