CN106033060B - 基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏度dna荧光分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过引入吗啉寡核苷酸来对特异性DNA片段进行检测的高灵敏度、高选择性的荧光分析方法。将共价连接到磁性微球表面的吗啉寡核苷酸作为捕获探针，与较长的目标DNA片段杂交后，目标DNA的未杂交段再与末端修饰生物素的信号DNA杂交，利用链霉亲和素与生物素的结合作用，将碱性磷酸酶引入到信号探针DNA末端，碱性磷酸酶催化L‑抗坏血酸2‑磷酸盐生成L‑抗坏血酸，L‑抗坏血酸再还原刃天青形成强荧光的试卤灵，荧光强度与目标DNA呈相关关系，通过荧光分析的方法实现对DNA片段的高灵敏度、高选择性检测，可应用于分子识别、临床诊断、环境监测及食品安全等领域中DNA样品的检测。
Description
技术领域
本发明属于荧光分析应用领域，具体涉及一种基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法。
背景技术
高灵敏度高特异性的DNA检测技术在疾病诊断、药物开发、食品安全、环境监测等方面得到了广泛的应用，近年来，DNA检测技术趋于微型化与简便化，灵敏度、特异性、检测速率的提高，成本的降低以及更简便的过程控制是目前DNA检测技术发展的趋势。与早期的DNA检测技术如比色法、凝胶电泳、紫外光谱等检测方法相比，采用荧光法的DNA传感器由于其高灵敏度、低成本及便携性等特点受到了越来越多的关注。
文献1(李宏业，范树国、刘玉乐、陈刚、王寰宇，改良聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA，细胞生物学杂志，1999,21,201-202。)利用改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳法，用30％丙烯酰胺，10×TBE，TEMED，10％过硫酸铵配制成10mL的3.5％凝胶，灌胶后采用15V/cm的电压梯度电泳，利用银染法对拟南芥基因组DNA为模板的PCR产物及其克隆于pGEM7Z上的重组质粒限制酶切产物进行检测，DNA片段得到很好的分离，条带显示清晰。目前，这种聚丙烯酰胺凝胶电泳法对于DNA的检测技术已经发展成熟，然而此法需要制胶、聚合酶链式反应，电泳、染色等一系列的过程，消耗时间长，劳动强度大，染料毒性大，银染的DNA片段不能直接回收纯化，且无法用于痕量及突变DNA的检测，因此具有很大的局限性。
文献2(Fernando Patolsky,Yossi Weizmann,Itamar Willner.Redox-ActiveNucleic-Acid Replica for the Amplified Bioelectrocatalytic Detection of ViralDNA.JACS. 2002,124,770-772.)将短链DNA探针固定于金电极表面，其与待测的环状M13￠病毒DNA部分杂交，在聚合酶的作用下，以长链上未杂交部分的DNA作为母链进行 DNA复制，复制原料中的dUTP标记有电活性物质羧酸二茂铁，从而得到具有二茂铁标记的寡聚核苷酸修饰电极，在电极上引入电信号。为了获得放大的检测信号，用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化来加速电子传递。该实验通过测定峰电流的变化，达到特异性的检测M13￠病毒DNA的目的。目前，利用二茂铁的电活性来对DNA进行检测的方法已经得到了广泛的应用，然而电化学法背景噪音大，重现性差，且难以用于单核苷酸多态性检测，此法中所用的DNA杂交探针的杂交效率相对肽核酸、吗啉寡核苷酸等探针较低，不适用于碱基错配的DNA检测。
发明内容
本发明的目的是为了检测痕量的DNA片段，包括完全互补、单碱基错配、三碱基错配和对照序列，以及发明一种高灵敏度高特异性DNA荧光分析方法。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法，包括如下步骤：
步骤一、将羧基化的磁性微球悬浮在PBS缓冲液中，加入吗啉寡核苷酸、NHS和EDC的PBS混合溶液，反应结束后进行磁分离并用PBS缓冲液清洗多次；
步骤二、将步骤一得到的吗啉功能化的磁性微球复悬在TE缓冲液中，加入目标DNA片段，杂交结束后进行磁分离并用TE缓冲液清洗多次；
步骤三、将步骤二得到的杂交后的磁性微球复悬在TE缓冲液中，加入生物素标记的信号探针DNA片段，杂交结束后进行磁分离并用TE缓冲液清洗多次；
步骤四、再将步骤三得到的二次杂交后的磁性微球复悬在Tris-HCl缓冲液中，加入链霉亲和素与碱性磷酸酶的结合物(SA-ALP)，反应结束后进行磁分离并用Tris-HCl缓冲液清洗多次；
步骤五、将步骤四得到的连接碱性磷酸酶的磁性微球复悬在Tris-HCl缓冲液中，加入 L-抗坏血酸2-磷酸盐(AAP)、刃天青及MgCl2溶液，反应结束后测荧光光谱。
步骤一中，所述的磁性微球的浓度为20～30mg/mL，吗啉寡核苷酸的浓度为0.5～1.5μM， NHS的浓度为5～15μM，EDC的浓度为35～45μM，反应条件为室温震荡5～7h。
步骤二中，所述的目标DNA片段浓度为0.1pM～0.1nM，杂交反应时间为20～80min，目标DNA片段选用序列为5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’的完全互补的DNA片段、序列为5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GGT AGT AGG TTC TAT GGTT-3’的单碱基错配的DNA片段、序列为5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GAT AGT ACG TTCTAT GGT T-3’的三碱基错配的DNA片段或序列为 5’-ATG GAT TCG TCA TGA ACT CCA GACCAG ACC GGC CAG A-3’的对照DNA片段。
步骤三中，所述的生物素标记的信号探针DNA片段的浓度为0.05～0.15μM，杂交反应时间为40～100min，生物素标记的信号探针DNA片段选用序列为5’-TCA TGA CGA ATCCAT TTT TT-Biotin-3’的DNA片段。
步骤四中，所述的SA-ALP浓度为1μg/mL，反应时间为0.5～1.5h。
步骤五中，所述的AAP浓度为30～40μM，刃天青浓度为2～6μM，MgCl2浓度为 0.01～10mM，反应条件为37℃、12小时。
本发明与现有技术相比其显著优点是：
1、通过荧光光谱分析的方法能更有效地对比不同序列的检测结果，且背景噪声小、成本低、方法简便、分析时间短。
2、以吗啉寡核苷酸作为捕获探针，选择性及特异性高，能有效区分目标DNA与单碱基错配、三碱基错配及对照DNA片段。
3、检测灵敏度高，对于目标DNA浓度在0.1pM～0.1nM的范围内，荧光强度具有很好的线性响应。
4、基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法对于实际血清样品中的DNA仍具有较高的灵敏度。
附图说明
图1是本发明基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析过程示意图。
图2是本发明实施例1中的紫外和荧光光谱表征图(其中A为紫外可见光谱，B 为荧光光谱)。
图3是本发明实施例2-4中的的条件优化图(其中a为实施例2，b为实施例3，c 为实施例4)。
图4是本发明实施例5中的对不同DNA片段的荧光响应对比图(其中a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较)。
图5是本发明实施例6中的对不同浓度目标DNA片段的检测特性图(其中a为荧光光谱的比较，b为峰值的比较)。
图6是本发明实施例7中的对实际血清样品中DNA的检测特性图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的是为更好理解本发明的内容，但所举的实施例并不限制本发明的保护范围：
实施例1：吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的紫外和荧光光谱表征。
采用本发明所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析，将10μL 25mg/mL羧基化的磁性微球悬浮在140μL PBS缓冲液中，加入20μL的1μM吗啉寡核苷酸(序列为5’-H2N-AAC CAT ACA ACC TAC TAC CTC A-3’)、20μL 10μM的 NHS和20μL 40μM的EDC，室温震荡反应6h后进行磁分离并用PBS缓冲液清洗多次，再复悬在180μL的TE缓冲液中，加入20μL目标DNA片段，杂交结束后进行磁分离并用TE缓冲液清洗多次，再复悬在180μL的TE缓冲液中，加入20μL的0.1μM生物素标记的信号探针DNA片段(序列为5’-TCA TGA CGAATC CAT TTT TT-Biotin-3’)，杂交结束后进行磁分离并用TE缓冲液清洗多次，再复悬在180μL的Tris-HCl缓冲液，加入 20μL 1μg/mL的SA-ALP，反应1h后进行磁分离并用Tris-HCl缓冲液清洗多次，再复悬在2880μL的Tris-HCl缓冲液中，加入30μL 34μM的AAP、30μL的4μM刃天青及30μL 的MgCl2溶液，37℃反应12h后测紫外和荧光光谱。这里以完全互补的DNA片段 (5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGT T-3’)作为目标分析物，浓度为10pM，紫外和荧光光谱的结果如附图2所示，其中，A是紫外可见光谱， B是530nm激发下的荧光光谱，(a)为常规流程下的分析结果，(b)为不加ALP，(c)为不加AAP。由图可见，紫外光谱中572nm处及荧光光谱中583nm处出现新峰，而不加入 ALP或AAP的情况下，新峰不出现，证明了ALP已经连接到信号探针DNA上，且最终溶液中产生了试卤灵这种强荧光物质，因此该荧光分析方法具有可行性及高效性。
实施例2：镁离子浓度对本发明DNA荧光分析结果的影响。
采用本发明所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，杂交时间保持过量，改变镁离子浓度依次为0.01、 0.05、0.1、0.5、1、5、10mM，分析不同的镁离子浓度对本发明DNA荧光分析结果的影响，其分析结果如附图3的 (a)所示，由图可知，镁离子浓度为0.01mM，0.05mM， 0.1mM，0.5mM时，随着浓度的增加，荧光强度显著增强，而在浓度高于1mM的情况下，随着浓度的增加，荧光强度显著降低，因此在实际检测过程中，应选用0.5mM 作为适宜的镁离子浓度。
实施例3：目标DNA与信号探针DNA片段杂交时间不同对本发明DNA荧光分析结果的影响。
采用本发明所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，吗啉寡核苷酸与目标DNA片段的杂交时间保持过量，改变目标DNA与信号探针DNA片段杂交时间依次为40、50、60、70、80、 90、100min，分析目标DNA与信号探针DNA片段杂交时间不同对本发明DNA荧光分析结果的影响，其分析结果如附图3的(b)所示，由图可知，杂交时间为40、50、60、 70、80min时，随着杂交时间的增加，荧光强度显著增强，而在反应80min以后，随着杂交时间的增加，荧光强度增幅缓慢，因此在实际检测过程中，目标DNA与信号探针DNA片段杂交时间应选用80min较为适宜。
实施例4：吗啉寡核苷酸与目标DNA片段杂交时间不同对本发明DNA荧光分析结果的影响。
采用本发明所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，改变吗啉寡核苷酸与目标DNA片段杂交时间依次为20、30、40、50、60、70、80min，分析吗啉寡核苷酸与目标DNA片段杂交时间不同对本发明DNA荧光分析结果的影响，其分析结果如附图3的 (c)所示，由图可知，杂交时间为20、30、40、50、60min时，随着杂交时间的增加，荧光强度显著增强，而在反应60min以后，随着杂交时间的增加，荧光强度增幅缓慢，因此在实际检测过程中，吗啉寡核苷酸与目标DNA片段杂交时间应选用60min较为适宜。
实施例5：基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析对不用序列DNA片段的荧光响应特性。
采用本发明所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，以完全互补(5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GGT AGT AGGTTG TAT GGT T-3’)、单碱基错配(5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GGT AGT AGG TTC TATGGT T-3’)、三碱基错配(5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GAT AGT ACG TTC TAT GGT T-3’)、完全不互补(5’-ATG GAT TCG TCA TGA ACT CCA GAC CAG ACC GGC CAG A-3’)的DNA片段作为目标分析物，对不同序列DNA片段进行荧光分析，分析结果如附图4所示，由图可知，本发明的DNA荧光分析方法对于不同序列的DNA片段具有不同的荧光响应，因而可以有效区分不同序列的DNA 片段，具有高特异性和选择性。
实施例6：基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析对不用浓度DNA片段的荧光响应特性。
采用本发明所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，目标DNA片段的浓度分别为0.1pM、0.5pM、1pM、 5pM、10pM、50pM、0.1nM，分析不同浓度目标DNA片段的荧光响应特性，分析结果如附图5所示，由图可知，在该检测浓度范围内，荧光强度随着目标DNA浓度的增加而增加，具有良好的线性关系，检测极限为9.32fM，荧光响应特性较好且灵敏度较高。
实施例7：实际血清样品中的DNA检测。
采用本发明所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析，操作步骤如同上述实施例1。其中，DNA分别溶于1×TE缓冲液、1％胎牛血清、5％胎牛血清，分析结果如附图6所示，由图可知，基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法对于实际血清样品中的DNA也具有较高的灵敏度。
Claims (6)
1.一种基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将羧基化的磁性微球悬浮在PBS缓冲液中，加入吗啉寡核苷酸、NHS和EDC的PBS混合溶液，反应结束后进行磁分离并用PBS缓冲液清洗多次；
步骤二、将步骤一得到的吗啉功能化的磁性微球复悬在TE缓冲液中，加入目标DNA片段，杂交结束后进行磁分离并用TE缓冲液清洗多次；
步骤三、将步骤二得到的杂交后的磁性微球复悬在TE缓冲液中，加入生物素标记的信号探针DNA片段，杂交结束后进行磁分离并用TE缓冲液清洗多次；
步骤四、再将步骤三得到的二次杂交后的磁性微球复悬在Tris-HCl缓冲液中，加入SA-ALP，反应结束后进行磁分离并用Tris-HCl缓冲液清洗多次；
步骤五、将步骤四得到的连接碱性磷酸酶的磁性微球复悬在Tris-HCl缓冲液中，加入L-抗坏血酸2-磷酸盐、刃天青及MgCl2溶液，反应结束后测荧光光谱。
2.如权利要求1所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤一中，所述的磁性微球的浓度为20~30mg/mL，吗啉寡核苷酸的浓度为0.5~1.5μM，NHS的浓度为5~15μM，EDC的浓度为35~45μM，反应条件为室温震荡5~7h。
3.如权利要求1所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤二中，所述的目标DNA片段浓度为0.1pM~0.1nM，杂交反应时间为20~80min，目标DNA片段选用序列为5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GGT AGT AGG TTG TAT GGTT-3’的完全互补的DNA片段、序列为5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GGT AGT AGG TTC TATGGT T-3’的单碱基错配的DNA片段、序列为5’-ATG GAT TCG TCA TGA TGA GAT AGT ACGTTC TAT GGT T-3’的三碱基错配的DNA片段或序列为5’-ATG GAT TCG TCA TGA ACT CCAGAC CAG ACC GGC CAG A-3’的对照DNA片段。
4.如权利要求1所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤三中，所述的生物素标记的信号探针DNA片段的浓度为0.05~0.15μM，杂交反应时间为40~100min，生物素标记的信号探针DNA片段选用序列为5’-TCA TGA CGA ATCCAT TTT TT-Biotin-3’的DNA片段。
5.如权利要求1所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤四中，所述的SA-ALP浓度为1μg/mL，反应时间为0.5~1.5h。
6.如权利要求1所述的基于吗啉寡核苷酸功能化磁性微球的高灵敏DNA荧光分析方法，其特征在于，步骤五中，所述的L-抗坏血酸2-磷酸盐浓度为30~40μM，刃天青浓度为2~6μM，MgCl2浓度为0.01~10mM，反应条件为37℃、12小时。
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