CN1808101A - Dna的荧光检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种涉及生物样品中目的DNA的荧光检测方法，其包括下列步骤：1)将待检DNA从生物样品中进行磁性富集和分离；2)然后加入荧光基团标记的信号探针，使磁性富集和分离后的待检DNA与信号探针杂交配对，并用低盐缓冲液洗涤使单碱基错配的DNA解链并弃去；3)再加入水溶性导电高分子材料实现信号倍增，用该导电高分子材料的激发波长作荧光光谱，利用荧光共振能量转移检测方法检测分析出待检DNA。本发明还公开了一种DNA的荧光检测试剂盒。本发明不仅具有超敏感性，还解决了选择性问题，使其在生物检测，如基因疾病，如乳腺癌的早期诊断和治疗中有重要意义。

Description

DNA的荧光检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及待测生物样品中目的DNA序列的检测领域，特别涉及一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒。

背景技术

磁性是物质的基本属性，磁性材料是古老而用途十分广泛的功能材料，纳米磁性材料是20世纪70年代后逐步产生、发展、壮大而成为最富有生命力与宽广应用前景的新型磁性材料。超顺磁性纳米颗粒由于具有尺寸小、比表面积大、悬浮稳定性好及在外磁场作用下的磁导向性运输和富集等优良特性，使其在细胞和生物活性物质的富集和分离中具有非常重要的应用前景，有的已步入临床试验。DNA磁性纳米分离器在DNA或RNA的分离和纯化、靶向药物的定向以及生物传感器和生物芯片技术中有着极为重要的应用(何晓晓，王柯敏，谭蔚泓，刘斌，李杜，黄杉生，超顺磁性DNA纳米富集器应用于痕量寡聚核苷酸的富集。高等学校化学学报，24(1)，40～42。)。

生物传感器研究综合了生物技术、信息技术、纳米科学、界面科学等众多领域以及光声电色等各种技术，因而长期以来一直受到相关学科研究者的高度重视。生物传感器在基础与应用方面都具有重要的意义。一方面，新型生物传感器的设计与开发涉及到很多基本的科学问题，这为基础研究提供了很大源头创新思路。另一方面，新型生物传感器的研制对于临床检测，环境检测，生物战和国家安全防御等方面都可能产生重要影响。尤其是人类基因组计划实施以来生物芯片的研究与应用高潮更是吸引了各个领域的研究人员涉足生物传感器研究领域，世界各国也都拨巨资支持生物传感器与阵列化生物传感器(即生物芯片)的研究。目前，生物传感器和生物芯片公司已成为国际上高科技公司中最活跃的部分之一，其市场应用前景不可估量。

应用导电高分子材料(CP)进行高灵敏度纳米生物传感器研制是高分子材料领域与生命科学相互渗透所形成的全新领域。导电高分子材料的发现奠定了有机与塑料光电子学的基础，Heeger教授及其合作者因此而获得2000年诺贝尔化学奖。导电高分子是一些具有共轭链的高分子材料，又被称为“分子导线”(molecularwire)。导电高分子链上的每一个单体都可以采集光能，因而每条导电高分子链就像一个由n个单体组成的光能采集器(lightharvester)。而由于电子或能量能够通过分子导线效应在整条共轭链上自由流动，因此单体所采集的能量可以被集中传递到电子传递或能量传递受体上。一个典型的例子就是被称为超猝灭(superquenching)的现象。在基于常规的小分子荧光—猝灭剂体系荧光检测中，一个猝灭剂只能猝灭一个荧光分子的荧光(即1∶1)；而由于共轭高分子链上大π键的存在，猝灭剂结合到链上的任何一个位点都可能会阻遏整条链上的电子或能量流动，从而改变其荧光特性，即一个猝灭剂可能猝灭整条共轭导电高分子链发出的荧光(1∶n，n对应于高分子链的聚集度)。这样就产生了一个显著的信号倍增效应(可从数千倍到数百万倍甚至更高)。而荧光共振能量转移(FRET)是指当两种不同的荧光生色团离的较近(1-10nm)，且其中一种生色团(供体，donor)的发射谱与另一种生色团(受体，acceptor)的激发谱有相当程度的重叠时，当供体被激发时，受体会因供体激发能的转移而被激发。其直观表现就是供体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随它们荧光寿命的相应缩短和延长。能量转移的效率与受体和供体距离的6次方成反比。对于荧光共振能量转移(FRET)来说，导电高分子高效的能量采集与传递体系可以极大地提高受体分子的荧光强度，从而为常规荧光检测提供了一个有效的信号倍增效应。这一高效的能量采集与传递体系可以极大地提高受体分子的荧光强度，从而为常规荧光检测提供了一个有效的信号倍增效应。基于这一原理，Heeger等已经原理性地应用导电高分子材料研制了高灵敏度纳米基因(DNA)传感器，其检测灵敏度较常规的荧光基因传感器高一个数量级以上。尽管有这样的优点，制约这一技术的主要问题是选择性不高，对于任意DNA链也会产生比较强的荧光信号，因而很难定量检测靶向DNA(目的DNA)。(Gaylord，B.S.，Heeger，A.J.& Bazan，G.C.(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99，10954-10957.Gaylord，B.S.，Bazan，G.C.&Heeger，A.J.(2003)J.Am.Chem.Soc.125，896-900.)。事实上这也是导电高分子材料在生物应用中所普遍遇到的问题，因而这一新型纳米传感器目前难以满足实际临床检测的需要。

由此可见，如何提高检测特异性是将基于导电高分子材料的纳米基因检测方法和传感器或试剂盒真正应用于临床检测中的瓶颈问题。

另一方面，各种肿瘤以乳腺癌为例，我国近年来的发病率逐年提高，然而目前的诊断技术均有局限。如物理检测(如CT)不能识别早期患者，而通过单克隆抗体诊断符合率只有33.3-57％。BRCA1基因是导致乳腺癌、卵巢癌的重要致病基因，BRCA1基因发生突变的妇女发生乳腺癌的风险高。大量研究表明：BRCA1基因突变与乳腺癌发病的相关性＞80％。因而以乳腺癌BRCA1基因为目的检测物进行超灵敏和选择的纳米传感检测可以实现乳腺癌等肿瘤的早期诊断，对于这些疾病的诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题即是上述在水溶性导电高分子的光学放大性进行DNA序列的检测，从而解决了目的(靶向)DNA检测的敏感性问题基础上，提供一种兼具高选择性的DNA荧光检测方法及其试剂盒。

本发明的一技术问题是通过下列技术方案来解决：一种DNA的荧光检测方法，其包括下列步骤：

1)将待检DNA从生物样品中进行磁性富集和分离；

2)然后加入荧光基团标记的信号探针，使磁性富集和分离后的待检DNA与信号探针杂交配对，并用低盐缓冲液洗涤；

3)再加入水溶性导电高分子材料实现信号倍增，用该导电高分子材料的激发波长作荧光光谱，利用荧光共振能量转移检测方法检测分析出待检DNA。

其中，该步骤1)中所述的将待检DNA从生物样品中进行磁性富集和分离包括下列步骤：

a.将分别由能特异性结合的受体或供体包覆的磁性颗粒和标记的捕获探针相混合，该捕获探针固定在磁性颗粒表面，并将其予以磁性分离；

b.将待检生物样品如血样加入固定有捕获探针的磁性颗粒中，如果该生物样品中含有靶向待检的DNA，该待检DNA与捕获探针相配对结合，从而使待检DNA从生物样品中富集和分离于磁性颗粒上。

其中，对于能特异性结合的受体、供体，本发明选用最常用的生物素和亲和素；当然，其它能特异性结合的受、供体也可选择，如某一抗原及其特异性抗体等。

该磁性颗粒可以为直径是1～2.8微米的微米级磁性颗粒(磁珠)；此时在步骤2)后最好还包括步骤3′)：使固定于该微米级磁性颗粒上的待检DNA和信号探针变性并脱离磁性颗粒，磁性分离弃去磁性颗粒后，收集变性的待检DNA和信号探针；再进行步骤3)。

当然，该磁性颗粒为直径是小于1微米的纳米级磁性颗粒则更佳。

上述步骤a中的磁性颗粒与捕获探针以1mg∶1.25～3.5nmol/L的比例相混合。

而所述的低盐缓冲液较佳的是含10～100mM无机盐，如氯化钠或氯化钾；及10～50mM缓冲液，如Tris-盐酸或磷酸盐；pH＝7.0～8.0的缓冲系统。使用其洗涤可使单碱基错配的DNA解链并弃去，而与探针互补的待检DNA链仍被富集在磁性颗粒表面。

本发明的另一技术问题是通过下列技术方案来解决：一种DNA的荧光检测试剂盒，其包括有荧光基团标记的信号探针，水溶性导电高分子材料，杂交液，其特征在于该试剂盒还包括待检DNA富集分离器及作为富集分离器洗涤液的低盐缓冲液。

其中，该待检DNA富集分离器包括分别由能特异性结合的受体或供体包覆的磁性颗粒和标记的捕获探针。

该磁性颗粒可以为直径是1～2.8微米的微米级磁性颗粒。此时该试剂盒最好还包括变性液。

而较佳的是该磁性颗粒为直径是小于1微米的纳米级磁性颗粒。

上述DNA富集分离器中的磁性颗粒与捕获探针的配比最好为1mg∶1.25～3.5nmol/L。

如上述，该低盐缓冲液较佳的是含10～100mM无机盐，如氯化钠或氯化钾；及10～50mM缓冲液，如Tris-盐酸或磷酸盐；pH＝7.0～8.0的缓冲系统。

从上述技术方案可以看出，本发明将能特异性结合的受体或供体包覆的磁性颗粒和标记的捕获探针(核酸探针，寡核苷酸链)以一定比例混合，该磁性粒子包括微米级(1，2.7，2.8μm等磁珠)和纳米级(＜1μm特别是50～100nm)，通过受体和供体之间的高度特异性结合，将核酸探针固定到磁性微粒表面。这种探针可特异性地结合目标单链寡聚核苷酸，从而可实现其对互补单链核苷酸片段的高效快速富集分离。

接着，对目的DNA(靶向DNA)的富集分离。将待测生物样品加入核酸探针标记的磁性颗粒中，按碱基互补配对的原则，修饰在磁性微粒表面的核苷酸探针可与待测的互补DNA片段选择性结合，将互补DNA片段富集在磁性微粒的表面，在一定的外磁场作用下实现富集互补DNA片段的DNA富集器与溶液的分离，而非互补DNA和各种蛋白质则被弃去。

最后是对目的DNA的检测。将荧光基团标记的信号探针(电子传递或能量传递受体标记的寡聚核苷酸)加入富集了目的DNA的磁性颗粒中，经过目的基因与信号探针杂交配对，形成三明治型的夹心检测方法，磁性分离，弃去上清，移去磁架。用低盐缓冲液洗涤磁珠，使单点突变的DNA链发生解螺旋而被弃去，互补链仍被富集在磁性颗粒表面。如磁性颗粒是纳米粒子，则直接加入高效光能采集器——导电高分子材料(CP)。该导电高分子材料，如阳离子导电高聚物作为荧光供体的发射谱和受体(荧光素)的激发谱能很好重叠，能形成很好的FRET对；且由于CP带正电，DNA链带负电，CP和DNA由于静电作用相互吸引，从而使CP和荧光素的距离靠得很近并发生了高效率的能量转移，荧光素的荧光强度比直接用它的激发波长激发时高十倍以上，表现为当用导电高分子的激发波长，如本发明一较佳实施例的380nm激发时，在530nm附近会产生很强的荧光共振能量转移信号，从而实现了信号倍增，进一步实现目的DNA的检测。如磁性粒子粒径较大，为了避免光散射则先用常规方法使DNA变性(如用碱)，磁性分离弃去磁性颗粒，收集目的DNA和信号探针，再加入高效光能采集器——导电高分子材料实现信号倍增，利用荧光共振能量转移检测方法实现目的DNA的检测。

综上所述，本发明在导电高分子材料上引入磁性颗粒来研究高灵敏度、高选择性的DNA(基因)的检测方法及其试剂盒。经特异修饰的磁性颗粒可以在很短时间内将待检测成分从待测生物样品(如血样)中采集出来，经过目的基因与特异性生物识别(杂交配对)后，以高效光能采集器——导电高分子材料实现信号倍增，以期在选择性和灵敏度上均达到实际基因检测的要求，并实现对单点突变基因的检测。从而使其可广泛应用在生物检测，如基因疾病的早期诊断方面，例如通过应用本发明的方法和试剂盒检测乳腺癌基因，如BRCA1基因，来实现乳腺癌的早期诊断。

附图说明

图1是本发明基于磁珠和导电高分子材料的高灵敏度、高选择性DNA荧光检测方法及试剂盒的工作流程图。

图2是不同浓度的人工合成模拟待检纯DNA的荧光共振能量转移信号图谱。其中A图为待检靶向DNA——PM和SM的浓度为1nM，任意DNA序列浓度为5μM([PF]＝8.1×10^-8M)；B图是人工合成模拟待检纯DNA中PM和SM的浓度为5nM，任意DNA序列浓度为5μM时的荧光共振能量转移信号图谱([PF]＝4.3×10^-7M)。其中，PM为完全互补靶向目的DNA3，SM为与靶向DNA发生单碱基错配的DNA序列4，random为任意DNA序列5。

图3是人工合成模拟目的待检DNA3浓度为1nM、3nM、5nM、7nM、9nM、10nM时的荧光共振能量转移信号强度(A图)，图中能量转移信号强度由下至上DNA3浓度分别为0、1nM、3nM、5nM、7nM、9nM、10nM；以及导电高聚物的荧光共振能量转移信号强度与待检DNA的靶向DNA浓度的线形关系图([PF]＝5.4×10^-7M，B图)。

图4是人工合成模拟待检纯DNA浓度为5nM和1nM时，平行进行三次测量的统计结果图。其中，PM为完全互补靶向目的DNA3；SM为与靶向DNA发生单碱基错配的序列4；PM，matrix为被检物质是混合物(1nM靶向DNA3、1000倍于靶向DNA的血红蛋白、溶菌酶、牛血清白蛋白及100倍于靶向DNA的任意DNA序列5)。

图5是不同条件下归一化的荧光强度柱状图。从左到右依次为：buffer：纯缓冲液中1nM靶向(target)DNA；matrix：人工准备的包含蛋白质的混合物[含1nM靶向(target)DNA]；serum：人血清样品[含1nM靶向(target)DNA]；serum：人血清样品[含5μM非同源任意(non-cognate)DNA]和serum：单纯人血清样品([PF]＝5.4×10^-7M)。

图6是不同浓度的人工合成模拟乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA的荧光共振能量转移信号图谱。其中图6A为BRCA1相关DNA序列、DNA为1nM完全互补(PM)的靶向DNA，1nM单碱基错配(SM)DNA([PF]＝8.1×10^-8M)；图6B为BRCA1相关DNA序列、DNA为5nM PM的靶向DNA，和5nM SM DNA([PF]＝4.3×10^-7M)。其中，PM为乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA序列(如下DNA8所示)，SM为与乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA8发生单碱基错配的DNA序列(如下DNA9所示)。

具体实施方式

以下结合附图，用实施例来进一步说明本发明的工作流程及功效。

实验仪器

所用仪器为日立F-4500荧光分光光度计。仪器条件为：高强度的150瓦氙灯光源和激发光束，波长范围200-700nm，扫描速度2,400nm/min，波长移动速度60,000nm/min，采用Microsoft Windows FL Solutions控制及分析软件。谱图测试条件：激发波长为380nm(导电高分子的激发波长)，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为2.5nm，PMT为950V，响应时间2S。

本发明各实施例中所用原料中的水溶性导电高分子为阳离子水溶性导电高聚物(又称阳离子聚芴，Cationic PF)，结构式如下：

其中，

-R＝-(CH₂)₃N⁺(CH₃)₂CH₂CH₃Br^-(CP1)

或-R＝-(CH₂)₆N⁺(CH₃)₃Br^-(CP2)

其中的CP1、2是根据参考文献(1.Fei huang，Hongbin Wu，Deli Wang，WeiYang，and Yong Cao.Chem.Mater.2004，16，708-716；2.Qing-hua Xu，Brent S.Gaylord，Shu Wang，Guillermo C.Bazan，Daniel Moses，and Alan J.Heeger.Proceedings of the National Academy of Sciences.2004，101，11634-11639.)合成的。

作为本发明实施例中试验用材料的各种人工合成DNA序列如下(以下所有DNA序列均购自上海生工生物工程技术有限公司)：

1、捕获探针(capture probe)DNA1

5′-ATGGCTGAACTTGAATTTTTTTTTT-(Biotin)-3’

2、信号探针(signaling probe)DNA2

5′-Fluorescein-TAGTCAGTGATACGT-3’

3、靶向DNA(target DNA)3

5′-TTCAGTTACAGCCATTTTTTTTTTTACGTATCACTGACTA-3’

4、单碱基错配DNA(single-nucleotide mismatched DNA)4

5′-TTCAGTTACAGCCATTTTTTTTTTTACGTATCTCTGACTA-3’

5、完全不互补任一DNA(non-cognate DNA)5

5′-ACACGCTTGGTAGACTTTTTTTTTTAGCATCGATAACGTT-3’

6、乳腺癌易感基因检测所用的捕获探针DNA6

5′-GAAACCCTATGTATGCTCTTTTTTTTTT-(Biotin)-3′

7、乳腺癌易感基因检测所用的信号探针DNA7

5′-Fluorescein-GTATGAATTATAATCAAA-3′

8、乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA8

5′-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATAATTCATAC-3′

9、与乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA8发生单碱基错配的序列DNA9

5′-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATTATTCATAC-3′

实施例1

试剂盒中的材料为：市售链亲和素包覆的磁珠(Streptavidin coatedMMPs)(购于Promega公司，磁珠直径1μm左右)；以常规方法用生物素(Biotin)标记的捕获探针DNA1；信号探针——荧光素(Fluorescein)标记的信号探针DNA2；杂交液(750mM NaCl，150mM Sodium citrate)；含50mMNaCl，10mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5左右的缓冲系统；CP1；变性液50mMNaOH。(其中生物素标记和荧光素标记方法是否是现有技术，如是，最好请各举一篇参考文献)

如图1所示，将市售链亲和素包覆的磁珠按其要求用0.5×SSC缓冲液洗涤三次后与生物素标记的寡核苷酸链(捕获探针1)混合(1.25nmol/L捕获探针：1mg磁珠)，轻微振动20分钟，利用亲和素和生物素的高度特异性结合(K_d＝10^-15M)将DNA探针固定在磁性粒子上，磁性分离并用95μLTTA(250mM Tris-HCl，0.1％Tween 20 and 5％BSA)洗涤磁珠两次。磁珠中加入45μL杂交液(750mMNaCl，150mM Sodium citrate)，然后加入能与生物素标记的寡核苷酸发生杂交反应的人工合成模拟待检的目的(靶向)DNA3，反应20分钟，将目的DNA片段富集在磁性微粒的表面，在一定的外磁场作用下实现富集互补DNA片段的DNA富集分离器与溶液的分离。然后用95μL TTA洗涤磁珠两次，加入45μL杂交液并加入略微过量的信号探针——荧光素标记的信号探针DNA2与目的DNA再进行杂交，磁性分离后用含50mM NaCl，10mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5左右的缓冲系统200μL洗涤磁珠两次。用此低盐缓冲液洗涤磁珠是为了实现对单碱基错配DNA的区分。我们的实验证明，在此盐浓度下，绝大部分单碱基错配DNA发生解螺旋而被洗去，而大部分完全互补DNA链仍未发生解链而被固定在磁珠上。此时加入CP1即可实现荧光测量，但由于我们采用的是1μm粒径的磁珠，为了避免磁珠对光的散射，我们用50mM NaOH洗涤磁珠使固定在磁珠上的DNA解螺旋，磁性分离取上清得到DNA2和DNA3的混合物，加入等量的50MmHCl以中和加入的NaOH，再加入缓冲液使最后缓冲液浓度为100mMTris-HCl，加入CP1(浓度是被检DNA浓度的7倍)，用CP1的激发波长380nm作荧光光谱，观察荧光共振能量转移信号，如图2所示，从而检测目的DNA。由于CP带正电，DNA链带负电，CP和DNA由于静电作用相互吸引，从而使CP和荧光素的距离靠得很近并发生了高效率的能量转移。从图3的A图中可看出，如果不存在目的DNA，则只能观察到高聚物本身的荧光发射峰，而没有共振能量转移信号；B图则显示在此浓度范围内，导电高聚物的荧光共振能量转移信号强度与被检测的DNA浓度成线形关系。因此本发明能够定量地检测靶向DNA。

实施例2

将靶向DNA3换成单碱基错配的DNA4重复实施例1步骤，结果如图2所示。

实施例3

将靶向DNA3换成任意序列的DNA5，重复实施例1步骤，结果如图2所示。

实施例1～3如图2所示，A图中可看出，即使完全不互补任意序列DNA浓度为互补DNA浓度的5000倍时，仍无能量转移信号；待检纯DNA浓度为1nM时，单碱基错配DNA亦无能量转移信号，而互补的靶向DNA则有较强的能量转移信号。说明此DNA检测策略可以完全区别出单碱基错配的DNA和任意序列DNA。从B图中可看出，待检纯DNA为任意DNA序列时，即使浓度是互补链的1000倍，亦观察不到能量转移信号，说明此DNA检测策略不受非特异性性DNA序列的干扰，具有很好的选择性。被检纯DNA为单碱基错配DNA时，有较弱的能量转移信号，被检纯DNA为完全互补的靶向目的DNA时，有很强的共振能量转移信号。因此此DNA检测策略可以很好的区别出单碱基错配的DNA。综上所述，当被检人工合成模拟目的DNA3浓度为5nM或1nM时，均能观察到很强的荧光共振能量转移信号，且很好地区别出单碱基错配的DNA和非特异性的DNA。

实施例4

将靶向DNA3换成混合物[1.0mL溶液中包含1nM靶向DNA3，高浓度的任意DNA5(浓度是靶向DNA3的100倍)和溶菌酶、牛血清白蛋白、血红蛋白(浓度是靶向DNA3的1000倍)]，重复实施例1步骤。如图4所示，实验的重复性是很好的，误差在10％以内，此荧光共振能量转移信号强度与被检DNA是单纯的人工合成模拟的靶向DNA3(1nM)的强度相当吻合。说明本发明不受非特异性物质的干扰，具有很好的选择性，适合于含有多种蛋白质和非特异DNA的真实样品如血液的检测。

实施例5

将靶向DNA3换成人血清样品[1.0mL 1∶10稀释的人血清(上海奥瑞恩诊断试剂公司提供)中包含1nM靶向DNA3]，重复实施例1步骤。如图5所示，实验的重复性是很好的，误差在10％以内，此荧光共振能量转移信号强度与被检DNA是单纯的人工合成模拟的靶向DNA3(1nM)的强度相当吻合。

实施例6

将靶向DNA3换成人血清样品[1.0mL 1∶10稀释的人血清(上海奥瑞恩诊断试剂公司提供)中包含5μM任意序列的DNA5]，重复实施例1步骤。如图5所示，此时荧光强度为零，也就是说即使完全不互补任意序列DNA浓度为互补DNA浓度的5000倍时，仍无能量转移信号。说明此DNA检测策略即使在血清存在下也不受非特异性性DNA序列的干扰，具有很好的选择性。

实施例7

将靶向DNA3换成人血清样品[1.0mL 1∶10稀释的人血清(上海奥瑞恩诊断试剂公司提供)]，重复实施例1步骤。如图5所示，观察不到能量转移信号。说明此DNA检测策略不受血清非特异性的干扰，适合真实样品的检测。

实施例8

试剂盒中的材料为：以常规方法用生物素标记的乳腺癌易感基因检测所用的捕获探针DNA6；信号探针——荧光素标记的乳腺癌易感基因检测所用的信号探针DNA7；余同实施例1。

将靶向DNA3换成乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA8，捕获探针和信号探针作相应替换，重复实施例1步骤，结果如图6所示。

实施例9

将靶向DNA3换成与乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA8发生单碱基错配的序列DNA9，重复实施例8步骤，结果如图6所示。

实施例8～9如图6所示，待检纯乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA浓度为1nM时，单碱基错配DNA只有很弱的能量转移信号，而互补的靶向DNA则有较强的能量转移信号。说明此DNA检测策略可以区别出与乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段发生单碱基错配的DNA。从图6B中可看出，被检纯乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA浓度为5nM时，单碱基错配DNA也只有很弱的能量转移信号，而互补的靶向DNA则有很强的能量转移信号。因此此DNA检测策略可以很好的区别出与乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段发生单碱基错配的DNA。综上所述，当被检人工合成乳腺癌易感基因BRCA1序列中的一段DNA浓度为5nM或1nM时，均能观察到很强的荧光共振能量转移信号，且很好地区别出单碱基错配的DNA。说明用此方法可以实现乳腺癌的早期诊断，并建立相应的临床诊断指标，对于该疾病的治疗具有重要意义。

实施例10

将实施例1试剂盒中所用导电高聚物换成另一种聚芴(CP2)，重复实施例1步骤。由于R基团中烷基数增多，加入CP后，荧光共振能量转移信号比实施例1中增强，即增加了检测的灵敏度。

实施例11

将实施例1试剂盒中所用市售链亲和素包覆的磁珠换成直径2.8μm大小的微米级磁性颗粒(购于Dynal公司)，磁性颗粒与捕获探针的混合比例为：3.5nmol/L捕获探针：1mg磁珠，富集分离后的磁珠洗涤低盐缓冲液换用100mM KCl，50mM PBS(磷酸盐)缓冲液，pH＝8.0左右的缓冲系统，余同实施例1步骤，加入CP1后，能够观察到荧光共振能量转移信号，从而检测目的DNA，结果如同实施例1。

实施例12

将实施例1试剂盒中所用微米级磁珠换成磁性纳米粒子(粒径大小范围为50-100nm)，根据现有方法合成(何晓晓，王柯敏，谭蔚泓，刘斌，李杜，黄杉生，超顺磁性DNA纳米富集器应用于痕量寡聚核苷酸的富集。高等学校化学学报，24(1)，40～42。)，富集分离后的磁性粒子洗涤低盐缓冲液为10mM NaCl，20mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.0左右的缓冲系统，余同实施例1。由于磁性纳米粒子粒径远小于可见光的波长，用可见光激发时不会发生散射，故不需要将DNA变性，即试剂盒中不需变性液。当磁性纳米粒子将目的DNA和信号探针富集后，直接加入CP进行荧光测量观察能量转移信号，结果如同实施例1。

Claims (14)

1、一种DNA的荧光检测方法，其包括下列步骤：

1)将待检DNA从生物样品中进行磁性富集和分离；

2)然后加入荧光基团标记的信号探针，使磁性分离和富集后的待检DNA与信号探针杂交配对，并用低盐缓冲液洗涤；

3)再加入水溶性导电高分子材料实现信号倍增，用该导电高分子材料的激发波长作荧光光谱，利用荧光共振能量转移检测方法检测分析出待检DNA。

2、根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于该步骤1)中所述的将待检DNA从生物样品中进行磁性富集和分离包括下列步骤：

a.将分别由能特异性结合的受体或供体包覆的磁性颗粒和标记的捕获探针相混合，该捕获探针固定在磁性颗粒表面，并将其予以磁性分离；

b.将待检生物样品加入固定有捕获探针的磁性颗粒中，如果该生物样品中含有靶向待检的DNA，该待检DNA与捕获探针相配对结合，从而使待检DNA从生物样品中富集和分离于磁性颗粒上。

3、根据权利要求2所述的荧光检测方法，其特征在于该磁性颗粒为直径是1～2.8微米的微米级磁性颗粒。

4、根据权利要求3所述的荧光检测方法，其特征在于该方法在步骤2)后还包括步骤3′)：使固定于该微米级磁性颗粒上的待检DNA和信号探针变性并脱离磁性颗粒，磁性分离弃去磁性颗粒后，收集变性的待检DNA和信号探针；再进行步骤3)。

5、根据权利要求2所述的荧光检测方法，其特征在于该磁性颗粒为直径是小于1微米的纳米级磁性颗粒。

6、根据权利要求2所述的荧光检测方法，其特征在于该步骤a中的磁性颗粒与捕获探针以1mg磁性颗粒∶1.25～3.5nmol/L捕获探针的比例相混合。

7、根据权利要求1～6任一权利要求所述的荧光检测方法，其特征在于该低盐缓冲液是指含10～100mM氯化钠或氯化钾及10～50mM Tris-盐酸或磷酸盐，pH＝7.0～8.0的缓冲系统。

8、一种DNA的荧光检测试剂盒，其包括有荧光基团标记的信号探针，水溶性导电高分子材料，杂交液，其特征在于该试剂盒还包括待检DNA磁性富集分离器及作为磁性富集分离器洗涤液的低盐缓冲液。

9、根据权利要求8所述的荧光检测试剂盒，其特征在于该待检DNA磁性富集分离器包括分别由能特异性结合的受体或供体包覆的磁性颗粒和标记的捕获探针。

10、根据权利要求9所述的荧光检测试剂盒，其特征在于该磁性颗粒为直径是1～2.8微米的微米级磁性颗粒。

11、根据权利要求10所述的荧光检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括变性液。

12、根据权利要求9所述的荧光检测试剂盒，其特征在于该磁性颗粒为直径是小于1微米的纳米级磁性颗粒。

13、根据权利要求9所述的荧光检测试剂盒，其特征在于该磁性颗粒与捕获探针的配比为1mg磁性颗粒∶1.25～3.5nmol/L捕获探针。

14、根据权利要求8～13任一权利要求所述的荧光检测试剂盒，其特征在于该低盐缓冲液是指含10～100mM氯化钠或氯化钾及10～50mM Tris-盐酸或磷酸盐，pH＝7.0～8.0的缓冲系统。

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