CN109804081A - 一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合靶标‑肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒。该方法是对复合样品中标志物靶标的检测方法，是通过特异性靶标的核酸配基组与靶标结合，将靶标志物信号转换成配基核酸信号，利用多重实时定量‑PCR进行动态定量检测的方法。其试剂盒：包括捕捉磁珠试剂、检测试剂、封闭液、洗涤液和实时定量‑PCR反应液，其中：所述捕捉磁珠试剂内溶有粒径为5～5000nm的捕捉磁珠；所述封闭液为蛋白封闭液；所述检测试剂内溶有肿瘤和非肿瘤血清特异性核酸配基组；所述实时定量‑PCR反应液包括引物和针对核酸配基的荧光探针。该方法具有快速、灵敏度高、特异性强、多配体同时检测等特点。

Description

一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学检测领域，具体涉及一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒。
背景技术
随着SELEX技术的发展，核酸配基作为一种特异性强、适用范围广、易于修饰的新型配基分子被应用在疾病的检测和治疗、药物的筛选和应用、食品与环境安全的监测、生物学检测等方面。
核酸信标配基是在核酸配基基础上衍生出的一种新的检测分子，在其配基的5’端连接一段带有荧光标记探针的双链核苷酸序列与一个已知特异性靶分子的核酸配基制备而成的，其既具有核酸配基的识别能力又具有信号储存、传递、放大功能，是一种新型的易于构建、特异性强、灵敏度高、使用范围广的检测分子。但核酸信标配基由于增加信标序列，从而改变配基的核酸分子序列，影响分子空间结构及配基配体的结合力，因此如果不改变核酸配体的结构，又能用实时定量PCR检测将会更方便实用。
磁珠作为一种新型的多功能材料，因其具有很好的生物相容性和表面官能团性使其成为核酸配基检测的理想载体，其在食品、医学、环境和生物分离等方面的应用越来越广泛。
血清是临床工作中最容易获得的标本，而且能够提供大量的机体功能信息。几乎体内所有的细胞都直接或间接地与血液交通，因此任何一种疾病都有可能在血清蛋白中留有痕迹，产生某些特征的变化。
传统检测蛋白质大多用酶联免疫法(ELISA)，捕捉抗体和血清中的抗原结合，再加入连有偶连酶的检测抗体，形成捕捉抗体-抗原-检测抗体“三明治”复合物，最后测偶连酶活性显示检测结果，但是检测范围受捕捉抗体和抗原反应的Kd值限制，灵敏度不佳。
核酸信标配基检测技术目前有两种具体方法。一种是核酸信标配基介导的免疫-PCR检测，其过程与ELISA法类似，不同点在于检测抗原的不是与捕捉抗体对应的酶标二抗，而是特异性的核酸信标配基与捕捉抗体形成的复合物，利用实时定量PCR检测来完成；另一种是核酸信标配基介导的PCR检测方法，这种方法直接将与靶分子对应的核酸信标配基作为检测分子，与靶分子结合，再洗脱分离后，用实时定量-PCR进行检测。这两种方法都是通过核酸信标配基分子首先对靶分子进行特异性识别，再进行信号传导最后通过实时定量PCR完成信号放大功能从而实现对靶分子的检测。核酸信标配基方法检测靶分子具有快速、灵敏度高、特异性强等优势。
核酸配基实时定量-PCR检测技术是核酸信标配基检测技术的改进型，核酸信标配基是在配基序列两端加上一个双链信标序列，其目的是通过配基结合靶分子将信号通过配基传递给信标序列，再通过实时定量-PCR对信标检测，从而间接实现对靶分子的检测。但是在实施过程中发现，配体作用靶分子往往不一定是一条单链单独完成，而是几条链协同作用完成，同时信标双链也影响配基的空间结构，因此信标序列不仅会影响配基结构，同样也会影响配基间的协同作用，从而影响配基与靶分子结合和检测结果。因此，有必要对该不足加以改进，提升检测技术。
发明内容
为克服现有技术存在的上述不足，本发明提供一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测方法及试剂盒。本发明通过以下技术方案实现：一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，包括捕捉磁珠试剂、封闭液、检测试剂、洗涤液和实时定量-PCR反应液，其中：
所述捕捉磁珠试剂内溶有粒径为5～5000nm的捕捉磁珠；
所述封闭液为蛋白封闭液；
所述检测试剂内溶有肿瘤和非肿瘤血清特异性核酸配基组；
所述实时定量-PCR反应液包括引物和针对核酸配基的荧光探针。
上述捕捉磁珠试剂具体可选为5mL、pH值为7.4的0.01M Binding buffer，内溶50％粒径5～5000nm的捕捉磁珠微粒；上述检测试剂为内溶有胃癌(G-seq)、肝癌(H-seq)、肺癌(L-seq)等的肿瘤血清特异性核酸配基组和非肿瘤(N-seq)血清特异性核酸配基，所述检测试剂中的各配基，为109分子拷贝数，0.1×Binding buffer混合液；上述洗涤液优选包括第一洗涤液和第二洗涤液，所述第一洗涤液具体可选为10mL、pH值为7.4的0.01MBinding buffer(含0.17％Tween)，所述第二洗涤液具体可选为10mL 3×SSC，内溶有柠檬酸、氯化钠；上述实时定量-PCR反应液具体可选为包含一对引物和不同发射波长核酸配基荧光探针的PCR体系。
优选的，所述的肿瘤和非肿瘤血清特异性核酸配基组均通过双向热循环消减SELEX技术筛选获得。具体可选为用胃癌、肝癌和肺癌血清(分别10例以上血清混合液)分别和非肿瘤血清(10例以上血清混合液)彼此互为消减靶标进行双向(或多项)消减SELEX技术筛选获得的胃癌、肝癌和肺癌血清特异性核酸配基组，以及非肿瘤血清特异性核酸配基组。在检测试剂中每个血清特异性核酸配基含量优选为106—109分子拷贝数。
优选的，所述的肿瘤和非肿瘤血清特异性核酸配基组中的核酸配基与所述荧光探针一一对应，即荧光探针是针对每一个核酸配基序列设计的一一对应的荧光探针。具体地，荧光探针优选包括MGB探针、TaqMan探针和分子信标等至少一种，长度为5-25bp的序列，其3’端和5’端分别标记有荧光基团和淬灭基团(荧光基团：FAM、HEX、TET；淬灭基团：TAMRA，BHQ等荧光淬灭材料)，可进行辅助实时定量-PCR检测。
优选的，所述捕捉磁珠表面处具有可与靶分子发生偶联的官能团或捕捉分子，所述官能团包括环氧基、羧基、氨基和NHS中的至少一种，通过化学偶联靶分子。所述捕捉分子为抗原、抗体、亲合蛋白和核酸适配体等中的一种或多种，能与靶分子特异结合，通过官能团结合到磁珠表面，通过免疫结合、蛋白配体配基和核酸配体配基结合等方法与靶分子结合；所述靶分子包括核酸、蛋白、脂类和氨基酸及其它生物分子中的至少一种或多种。
优选的，所述引物为配基引物，其探针为配基序列上的5-25个碱基序列，序列3’和5’端带有淬灭基团和荧光基团。
优选的，所述封闭液包括脱脂奶粉和酪蛋白，或者牛血白蛋白。
本发明提供一种用上述试剂盒进行复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测的方法，该方法具体包括以下步骤：
1)制备待检测样品：血液去除血细胞和血脂，分离得到血清；
2)捕获检测靶分子：将捕捉磁珠试剂与待检测样品混合，在37℃孵育1h，形成磁珠-靶分子复合物(如非特异性结合需用封闭液37℃封闭1小时)，第一洗涤液洗3次，3分钟/次，磁分离，取磁珠。
3)结合信标配基：将检测试剂95℃加热5min，再置于冰水中迅速冷却5min，加入磁珠中37℃结合1小时，磁分离，弃上清。
4)洗涤：加入0.5ml第二洗涤液，洗1次，3分钟/次，磁分离；再加入0.5ml第一洗涤液，洗3次，3分钟/次，磁分离，取磁珠。
5)提取配基：在磁珠中加入1×PCR缓冲液，15μL，95℃加热5分钟，磁分离，取上清。
6)配基检测：吸取步骤5)所述上清2μL加入18μL实时定量-PCR反应液中，进行PCR，采集并处理数据(或用基因测序完成多靶配基的定性定量)。
上述的步骤1)，可通过以下方式进行：用静脉穿刺法采取血液于含抗凝剂的试管内，立即轻轻摇动，使血液和抗凝剂混匀，然后3000转，离心10min，收集上清于-80℃冷冻30min后，12000g，离心30min,除去血脂，分离得待检测血清(或分别经过水:乙腈：血清＝2:0.5:1的比例混合处理，5000r/min低温离心30min,吸取上清，去除高丰度蛋白)。
上述的步骤6)，优选通过以下方式进行：根据需要采用多重实时定量-PCR检测、多库筛选多引物检测、基因测序等方法对捕捉磁珠上特异结合的配基或配基组进行检测。通过多重实时定量-PCR(基因测序等)对核酸配基组的检测，可实现对特异性标志物组的定性定量检测。
核酸配基实时定量-PCR检测方法不需要在配基上增加任何序列，不改变配基空间结构，只是实时定量-PCR检测探针序列为配基序列上的5-25个碱基序列。这样不需要改造配基结构、配基和配体的结合力，又提高了检测的灵敏度。
本发明的优点在于：
1.本发明的检测试剂盒是对复合靶标的检测，通过特异性核酸配基组与血清特异性靶标结合，将复合靶血清标志物蛋白信号转换成核酸信号，即可利用实时定量-PCR进行动态定量检测。该检测方法可使多种靶分子的信号通过核酸配基转换成核酸信号，具有快速、灵敏度高、特异性强、多配体同时检测等特点。
2.本发明以磁珠作为载体附着靶分子，对检测分子进行磁性分离，操作简单。
3.本发明的核酸配基是通过双向热循环消减SELEX快速筛选方法得到的非肿瘤(N-seq)、胃癌(G-seq)、肝癌(H-seq)、肺癌(L-seq)血清特异性核酸配基序列。根据配基分别设计荧光探针，通过PCR扩增，实现靶分子信号的指数级放大。
4.非肿瘤(N-seq)血清核酸配基可以特异性识别非肿瘤血清中的标志物，可作为检测肿瘤血清的阴性对照。
5.本发明是采用非肿瘤(N-seq)血清核酸配基和胃癌(G-seq)、肝癌(H-seq)、肺癌(L-seq)血清特异性核酸配基组成的检测试剂，其优点是通过检测可相对明确的区分血清中具有肿瘤标志物还是非肿瘤标志物。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明实施例2多重实时定量-PCR检测肿瘤和非肿瘤血清的原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的描述：
作为一种示例，下述各实施例所用试剂盒，包括以下试剂：
试剂1：捕捉磁珠试剂：5mL、pH值为7.4的0.01M Binding buffer，内溶50％粒径5～5000nm的捕捉磁珠微粒；
试剂2：检测试剂：肿瘤血清特异性核酸配基：胃癌(G-seq)、肝癌(H-seq)、肺癌(L-seq)等和非肿瘤血清特异性核酸配基：非肿瘤(N-seq)，分别用0.1×Binding buffer溶解为109分子拷贝数的混合液；
试剂3：封闭液：10mL包括脱脂奶粉和酪蛋白；
试剂4：洗涤液1：10mL、pH值为7.4的0.01M Binding buffer(含0.17％Tween)；
试剂5：洗涤液2：10mL 3×SSC包括柠檬酸、氯化钠；
试剂6：实时定量-PCR反应液1ml，包含一对引物和不同发射波长核酸配基荧光探针的PCR体系；
实施例1：实时定量-PCR分别检测肿瘤和非肿瘤血清
本实施例包括以下步骤：
(1)制备待检测样品：按静脉穿刺法采取血液于含抗凝剂的试管内，立即轻轻摇动，使血液和抗凝剂混匀，然后在3000转，离心10min，收集上清于-80℃冷冻30min后，12000g，离心30min,除去血脂；再经过水:乙腈：血清＝2:0.5:1的比例混合处理，5000r/min低温离心30min,吸取上清，去除高丰度蛋白，得待检测血清。
(2)磁珠捕捉靶分子：取2份等量的NHS基琼脂磁珠各50μL于1.5ml EP管中，分别标记为H1和H2、向H1、H2中各加入50μL待检测血清，置于37℃孵育1h，再用蛋白封闭液37℃封闭1小时后洗涤液1洗3次，3分钟/次，磁分离。
(3)结合配基：分别取非肿瘤(N-seq)、胃癌(G-seq)、肝癌(H-seq)和肺癌核酸配基(L-seq)检测液各200μL，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却5min后，将非肿瘤(N-seq)加入到H1磁珠中；胃癌(G-seq)、肝癌(H-seq)和肺癌(L-seq)混合液加入到H2磁珠中，37℃结合1小时，磁分离，弃上清。
(4)洗涤：以上两管中分别加入洗涤液2，0.5ml洗涤3次，3分钟/次；再加入洗涤液1，0.5ml洗涤3次，3分钟/次；
(5)制备检测模板：在H1和H2磁珠中加入15μL 1×PCR缓冲液，95℃加热5分钟，磁分离取上清。
(6)检测：分别取步骤(5)H1和H2上清2μL加入至18μL，实时定量-PCR反应体系中(SYBRGreen I)，进行实时定量-PCR，采集并处理数据。
检测结果分析：结果1，CT值H1小于H2说明血清样本属非肿瘤血清；结果2，CT值H1大于H2说明血清样本属肿瘤血清。
实施例2：多重实时定量-PCR检测肿瘤和非肿瘤血清
本实施例包括以下步骤：
(1)制备待检测样品：按静脉穿刺法采取血液于含抗凝剂的试管内，立即轻轻摇动，使血液和抗凝剂混匀，然后在3000转，离心10min，收集上清于-80℃冷冻30min后，12000g，离心30min,除去血脂；再经过水:乙腈：血清＝2:0.5:1的比例混合处理，5000r/min低温离心30min,吸取上清，去除高丰度蛋白，得待检测血清。
(2)制备磁珠靶分子复合物：取1份的捕捉琼脂磁珠50μL于1.5ml EP管中，加入50μL待检测血清，置于37℃孵育1h，洗涤液1，洗3次，3分钟/次，磁分离。(注：核酸配基捕捉琼脂磁珠是通过化学键偶联链霉亲和素，再通过亲和素与生物素化的配基结合形成的捕捉磁珠，捕捉靶分子的配基和检测配基，可以是同一分子，也可是不同核酸文库筛选筛选获得的靶分子特异性配基；其他捕捉磁珠也可以通过化学键偶联抗体或抗原形成捕捉磁珠；或通过化学键偶联捕捉靶分子)
(3)结合配基：分别将非肿瘤(N-seq)、胃癌(G-seq)、肝癌(H-seq)和肺癌核酸配基(L-seq)混合检测液200μL，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却5min后，加到步骤(2)的磁珠中，37℃结合1小时，磁分离，弃上清。
(4)洗涤；在管中分别加入洗涤液2，0.5ml洗涤3次，3分钟/次；再加入洗涤液1，0.5ml洗涤3次，3分钟/次；
(5)制备检测模板：在磁珠中，加入15μL 1×PCR缓冲液，95℃加热5分钟，磁分离取上清。
(6)多重PCR检测：取2μL步骤(5)所得上清，加入18μL实时定量-PCR反应液中，参考图1所示原理，反应液含配基上下游引物P7、P11及用四种不同波长TaqMan探针标记的非肿瘤(N-seq)、胃癌(G-seq)、肝癌(H-seq)和肺癌(L-seq)核酸配基，探针的发射波长分别在4个通道中，进行多重实时定量-PCR，采集并处理数据。
检测结果分析：结果1，CT值：第一通道小于第二、三和四通道，说明血清样本属非肿瘤血清；结果2，CT值：第二通道小于第一、三和四通道，说明血清样本可能属胃癌血清；结果3，CT值：第三通道小于第一、二和四通道，说明血清样本可能属肝癌血清；结果4，CT值：第四通道小于第一、二和三通道，说明血清样本可能属肺癌血清。
需要说明的是：
1、检测样本大于实时定量-PCR检测4通道时，可采用每管PCR体系加一个参照，检测3个样本。如：检测十种肿瘤，则可分成4组PCR检测体系，每组中都带有非肿瘤核酸配基的TaqMan探针作为PCR管间误差参照。
2、每种肿瘤如果有2种以上的配基时，可以归到一组，TaqMan探针采用一个发射波长，在一个PCR检测体系中检测。
3、本实施例根据需要，可对不同的样本标志物采用不同的核酸文库筛选配基。这样在样品检测时，就可以对相同检测模板，采用不同的引物PCR体系检测，获得标志物信息，确定样本类型。
实施例3：基因测序检测肿瘤和非肿瘤血清
本实施例包括以下步骤：
(1)制备待检测样品：按静脉穿刺法采取血液于含抗凝剂的试管内，立即轻轻摇动，使血液和抗凝剂混匀，然后在3000转，离心10min，收集上清于-80℃冷冻30min后，12000g，离心30min,除去血脂；再经过水:乙腈：血清＝2:0.5:1的比例混合处理，5000r/min低温离心30min,吸取上清，去除高丰度蛋白，得待检测血清。
(2)制备磁珠靶分子复合物：取1份的捕捉琼脂磁珠50μL于1.5ml EP管中，加入50μL待检测血清，置于37℃孵育1h，洗涤液1，洗3次，3分钟/次，磁分离。(注：核酸配基捕捉琼脂磁珠是通过化学键偶联链霉亲和素，再通过亲和素与生物素化的配基结合形成的捕捉磁珠，捕捉靶分子的配基和检测配基，可以是同一分子，也可是不同核酸文库筛选获得的靶分子特异性配体；其他捕捉磁珠也可以通过化学键偶联抗体或抗原形成捕捉磁珠；或通过化学键偶联捕捉靶分子)
(3)结合配基：分别将核酸配基配置终浓度为109的非肿瘤(N-seq)、胃癌(G-seq)、肝癌(H-seq)和肺癌核酸配基(L-seq)混合检测液200μL，95℃加热5min并置于冰水中迅速冷却5min后，加到(2)的磁珠中，37℃结合1小时，磁分离，弃上清。
(4)洗涤：在管中分别加入洗涤液2，0.5ml洗涤3次，3分钟/次；再加入洗涤液1，0.5ml洗涤3次，3分钟/次；
(5)制备检测模板：在磁珠中，加入15μL 1×PCR缓冲液，95℃加热5分钟，磁分离取上清。
(6)基因测序：采用基因二代或三代测序的方法对步骤(5)所得上清进行测序检测，然后对每条配基进行分析。总之：配基的拷贝数代表特异性靶分子的多少，也就代表被检血清的性质。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
上面对本发明专利进行了示例性的描述，显然本发明专利的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明专利的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明专利的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，其特征在于，包括捕捉磁珠试剂、封闭液、检测试剂、洗涤液和实时定量-PCR反应液，其中：
所述捕捉磁珠试剂内溶有粒径为5～5000nm的捕捉磁珠；
所述封闭液为蛋白封闭液；
所述检测试剂内溶有肿瘤和非肿瘤血清特异性核酸配基组；
所述实时定量-PCR反应液包括引物和针对核酸配基的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤和非肿瘤血清特异性核酸配基组均通过双向热循环消减SELEX技术筛选获得。
3.根据权利要求1所述的一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，其特征在于，所述的肿瘤和非肿瘤血清特异性核酸配基组中的核酸配基与所述荧光探针是一一对应。
4.根据权利要求3所述的一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针包括MGB探针、TaqMan探针和分子信标中的至少一种，且所述荧光探针是针对核酸配基序列设计。
5.根据权利要求1所述的一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，其特征在于，所述捕捉磁珠表面具有可与靶分子发生偶联的官能团或捕捉分子，所述官能团包括环氧基、羧基、氨基和NHS中的至少一种，可通过化学基团偶联所述靶分子；所述捕捉分子为抗原、抗体、亲合蛋白和核酸配基中的一种或多种，可通过免疫结合、蛋白配体配基或核酸配体配基方式结合捕捉所述靶分子；所述靶分子包括核酸、蛋白、脂类、氨基酸及其它生物分子中的至少一种或多种。
6.根据权利要求1所述的一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂内溶有针对非肿瘤血清SELEX消减筛选的胃癌、肝癌和肺癌的肿瘤血清特异性核酸配基和针对肿瘤血清SELEX消减筛选的非肿瘤血清特异性核酸配基。
7.根据权利要求1所述的一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括第一洗涤液和第二洗涤液，所述第一洗涤液为内溶有Tween的Bindingbuffer，所述第二洗涤液为内溶有柠檬酸和氯化钠的SSC。
8.根据权利要求1所述的一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液包括脱脂奶粉和酪蛋白，或者牛血清白蛋白。
9.根据权利要求1所述的一种复合靶标-肿瘤血清核酸配基检测试剂盒，其特征在于，所述引物为配基引物，其探针为配基序列上的5-25个碱基序列，序列3’和5’端带有淬灭基团和荧光基团。
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