CN108603883A - 前列腺癌的判定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供Pca的新的判定方法及其恶性度的判定方法。本发明涉及“前列腺癌的判定方法，其中，测定来自生物体的试样中的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于从糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的游离型PSA量相对于游离型前列腺特异抗原量的比率，当该比率为高于40％时，判定为是前列腺癌或者是前列腺癌的可能性高”的发明。

Description

前列腺癌的判定方法
技术领域
本发明涉及一种新颖的前列腺癌及其恶性度的判定方法。
背景技术
前列腺癌(prostate carcinoma：以下简写为“Pca”)是在欧美各国的男性中发病率最高的癌症，近年来在日本也保持急剧增长的趋势，据推测，在2015年也是日本人男性中发病率最高的恶性肿瘤。
前列腺特异抗原(prostate specific antigen：以下，简写为“PSA”)是前列腺产生的，是前列腺中的一种特异性糖蛋白。当患有Pca时，血液中的PSA值变高，因此PSA值被认为是用于判定Pca的最重要的肿瘤标志物(非专利文献1)。
大部分的PSA在血液中与α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-巨球蛋白等结合蛋白结合而形成复合体，作为结合型PSA存在(以下，简写为“结合型PSA”)。另外，部分PSA不形成复合体而作为游离型存在(以下，简写为“游离型PSA”)。
目前广泛实行的血清PSA检查不区别游离型PSA和结合型PSA而测定PSA的总量(即，游离型PSA和结合型PSA的合计量，以下，简写为“总PSA值”)。总PSA值的基准值(正常值)是小于4ng/mL。前列腺有任何疾病时，总PSA值上升。据称，总PSA值为10～20ng/mL的情况下，40％左右的患者被发现Pca，20ng/mL以上的情况下，50％以上的患者被发现Pca。
总PSA值比正常值高，但相比上述高值为低的中间的4.1～10ng/mL的范围被称为所谓的灰色区(gray zone)(非专利文献2)。据称，示出该灰色区的总PSA值的患者被发现癌的确率是约25～30％。例如，已经知道，有前列腺肥大症(benign prostatic hyperplasia：良性前列腺肥大，以下简写为“BPH”)、前列腺炎等其他前列腺的疾病的情况下，总PSA值也经常是高值。也就是说，即使总PSA值是比正常值更高的值，并不一定就是患了Pca。因此，在血清PSA检查中当总PSA值处于灰色区的情况下，为了获得确切的诊断通常要进行穿刺活检，但是存在的问题是进行该穿刺活检增加了传染病的风险。
为了解决该问题，逐渐开始尝试以总PSA值以外的例如PSA密度、PSA梯度、游离型PSA/总PSA之比等作为指标来判定Pca。然而，虽然陆续报道了通过使用这些指标的组合/分析来提高Pca诊断准确度的可能性，但是还未达到在临床现场一般普及的局面。
另外，目前作为肿瘤标志物被使用的分子，多是糖蛋白。已经知道，对于这种肿瘤标志物的糖链结构，在来自正常组织时和在来自癌时，其结构有很大不同。
PSA是分子量34kDa的糖蛋白，糖链占其约8％。
在涉及PSA具有的糖链的研究中，有报道称，PSA带有二根链的糖链，该糖链仅是在末端唾液酸以α(2,6)键结合于半乳糖的N型糖链(非专利文献3)。
但是，大山等通过使用对末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于半乳糖的糖链进行特异性识别的MAA(Maackia amurensis Lectin、朝鲜槐凝集素)的亲和色谱法，完成了辨别Pca与BPH的方法(专利文献1)。该方法是“获取凝集素结合的组分的游离PSA(游离型PSA)值以及总PSA值相对于分离前的血清中的游离PSA值以及总PSA值的百分比、或者获取凝集素结合的组分的游离PSA值相对于组分分离前的血清中的游离PSA值的百分比，根据这些值辨别Pca与BPH的方法”。
其后，大山等阐明了，PSA的糖链非常富有多样性(非专利文献4)、以及PSA糖链的末端唾液酸不仅是以α(2,6)键而且还存在约10％的以α(2,3)键结合于半乳糖。此后，明白了，在Pca患者的血清中，相比于这种N型糖链的末端唾液酸残基以α(2,6)键结合于半乳糖的PSA，以α(2,3)键结合于半乳糖的PSA增加(非专利文献5)。
另外，公开了通过用西洋接骨木凝集素(SNA)分析患者的血清试样中的PSA具有的糖链的α(2,6)键唾液酸化(シアル化)的水平、以及PSA具有的糖链的α(2,3)键唾液酸化的水平，确认患者是否有Pca的(是否患有Pca)的方法(专利文献2)。
进一步，大山等报道了如下的辨别Pca和BPH的方法，通过使用抗游离型PSA抗体和对末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于半乳糖的糖链进行特异性识别的单克隆抗体测定试样中的具有末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于半乳糖的N型糖链的游离型PSA量，将得到的测定量与预设的Pca和BPH的临界值(cutoff vaule)进行比较，由此判定，多于临界值的情况下是Pca或其可能性高，少于的情况下下是BPH或其可能性高(专利文献3、非专利文献6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许4514919号公报。
专利文献2：日本特表2011-529184号公报。
专利文献3：WO2014-057983号小册子。
非专利文献
非专利文献1：Stamey T.A.et al.,N.Engl.J.Med.,1987,vol.317,pp.909-916。
非专利文献2：Catalona W.J.,et al.,JAMA,1998,vol.279,pp.1542-1547。
非专利文献3：Belanger A,Van Halbeek H,Gravuxes HC,et al.,Prostate,1995,vol.27,pp.187-197。
非专利文献4：Ohyama C.,et al.,Glycobiology,2004,vol.14,pp.671-679。
非专利文献5：Tajiri M.,Ohyama C.,Wada Y.,Glycobiolgy,2008,vol.18,pp.2-8。
非专利文献6：Yoneyama T.et al.,Biochem Biophys Res Commun.2014vol.448,No.4,pp.390-396。
发明内容
发明要解决的课题
在专利文献1中记载了“MAA结合的组分相对于癌患者的游离PSA(游离型PSA)及总PSA的比例”分别是16.9±5.2(平均±标准偏差)％及7.5±4.2％。另一方面，BPH的情况下，该比例分别是0.6±0.2％及0.3±0.1％。”。
然而，专利文献1中探讨的检体数量是Pca患者17名、BPH患者15名，非常少。因此，不能将专利文献1所记载的“MAA结合的组分相对于癌患者的游离PSA(游离型PSA)及总PSA的比例”、以及得到的具体数值用作Pca判定的指标。
另外，在专利文献1中使用的来自Pca患者的试样的总PSA值的中间值是138ng/mL，是远远高于灰色区的值。因此，要通过该文献所记载的辨别方法进行总PSA值为灰色区的患者的Pca判定是极其困难的。
另外，通过本申请的说明书的实施例6、比较例4以及比较例6验证，结果断定了通过用临界值进行Pca判定的专利文献3的方法进行高准确度的Pca判定也是很困难的。
也就是说，如上所述，使用现有的各种指标难以进行高准确度的Pca判定，尤其是针对在临床检查中血清PSA值位于灰色区的患者。
进一步，Pca有良性Pca和恶性Pca，良性Pca的情况下，因为其发展缓慢所以也可以选择不进行手术等侵袭性治療而持续观察。另一方面，恶性Pca因为发展迅速，所以需要在早期发现Pca并判断其恶性度。但是，尚未知晓能判断良性Pca和恶性Pca的标记物、判别方法。
本发明是鉴于上述这样的状况而成的，其课题是提供新的Pca的判定方法及其恶性度的判定方法。
解决课题的技术方案
本发明人等为了解决上述问题点而进行了潜心研究，结果发现，来自生物体的试样中的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的游离型PSA的量相对于游离型PSA量的比率是判定是否是Pca的指标。而且进一步潜心研究的结果发现，该比率高于40％时，能判定为是Pca或其可能性高，进而该比率高于47％时，能判定为Pca的恶性度高，从而完成了本发明。
即，本发明由以下构成组成。
“前列腺癌的判定方法，其中，测定来自生物体的试样中的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的游离型PSA量相对于游离型前列腺特异抗原量的比率，该比率高于40％的情况下，判断为是前列腺癌或者是前列腺癌的可能性高。”
发明的效果
本发明的Pca判定方法能够非侵袭性地且简便地以高准确度判定(诊断、检查)Pca及其恶性度。特别地，对于以往难以判定的总PSA值位于灰色区的患者，能够判定是否是Pca或其可能性是否高。
另外，本发明的Pca判定方法因为能够判定Pca的恶性度，所以由本发明的判定方法所得到的判定结果在制定其后的Pca的治療方针方面成为重要的指导方针。
进一步，本发明的Pca判定方法即使在使用有可能对糖链多样性等PSA的测定、Pca判定产生影响的外国人试样的情况下，也能够以高准确度判定Pca。
附图说明
图1是糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起第二位的半乳糖残基的糖链的一个示例的示意图。
图2是表示实施例1中的DNA标记抗PSA抗体的制备方法的图。
图3是实施例1中使用的微芯片的示意图。
图4是实施例1中使用的微芯片的芯片内流路的示意图。
图5是实施例1中得到的电泳图。
图6是实施例2中得到的电泳图。图6(1)是表示用含有重组α(2,3)糖链游离型PSA的电泳用试样A得到的结果，图6(2)是表示用含有重组α(2,6)糖链游离型PSA的电泳用试样A得到的结果。
图7是对实施例3中得到的利用微芯片毛细管电泳测定的α(2,3)糖链游离型PSA及α(2,6)糖链游离型PSA的捕集效率进行确认后的结果。图7(1)表示在各个样品溶液的实测值的基础上算出的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率与理论值之间的关系。图7(2)表示对各个样品溶液得到的复合体1的组分的峰面积的实测值(■)及复合体2的组分的峰面积的实测值(◆)与其样品溶液的理论值之间的关系。
图8表示实施例4中得到的在Pca患者与BPH患者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率得到的结果。
图9表示实施例4、比较例1以及比较例2中得到的结果。图9(1)(上图)表示实施例4中得到的在Pca患者与BPH患者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率得到的结果。图9(2)(上图)表示比较例1中得到的在Pca患者与BPH患者间比较总PSA值(total PSA)得到的结果。图9(3)(上图)表示比较例2中得到的在Pca患者与BPH患者间比较游离型PSA值相对于总PSA值的比率(％fPSA)得到的结果。另外，图9的下图是在各个测定结果的基础上得到的ROC解析的结果。
图10是实施例5中得到的ROC曲线。
图11表示实施例7以及比较例3、4中得到的结果。图11(1)表示实施例7中得到的在Pca患者与BPH患者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的结果。图11(2)是实施例7以及比较例3、4中得到的ROC解析的结果。(a)表示针对实施例7中得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率进行解析后的结果，(b)表示针对比较例3中得到的α(2,3)糖链游离型PSA量进行解析后的结果，(c)表示针对比较例4中得到的总PSA值进行解析后的结果。
图12表示比较例3以及4中得到的结果。图12(1)表示比较例3中得到的在Pca患者与BPH患者间比较总PSA值得到的结果，图12(2)表示比较例4中得到的在Pca患者与BPH患者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量(MFI)得到的结果。
图13是实施例8中得到的在Pca患者与非癌者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率得到的结果。
图14是实施例8中得到的ROC解析的结果。图14(1)是针对α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率进行解析后的结果。图14(2)是针对总PSA值进行解析后的结果。
图15是在以实施例8中得到的ROC解析结果的基础上进行临界值测定的结果。
图16表示实施例9以及比较例5中得到的结果。图16(1)表示实施例9中得到的格里森评分(Gleason score)与“α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率”之间的关系。图16(2)表示比较例5中得到的格里森评分与总PSA值之间的关系。
图17是在实施例9中得到的ROC曲线解析结果的基础上进行临界值测定的结果。
图18表示实施例10以及比较例6中得到的结果。图18(1)表示实施例10中得到的在Pca患者与BPH患者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率得到的结果。图18(2)表示比较例6中得到的在Pca患者与非癌者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量(MFI)得到的结果。
图19是在实施例11中实施的由表面等离子体共振法得到的传感图。
具体实施方式
＜关于本发明的PSA＞
本发明的“结合型PSA”是指通常被称作“结合型PSA”的PSA，即“与α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-巨球蛋白等结合蛋白结合而形成复合体的PSA”。
本发明的“游离型PSA”是指通常被称作“游离型PSA”的PSA，即“没有与α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-巨球蛋白等结合蛋白结合的PSA”。
本发明的“糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链”是指糖链的末端(非还原末端)是Siaα2→3Gal结构的糖链，作为末端唾液酸残基，可举出例如N-乙酰神经氨酸。
本发明的“糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链”具体是指以下的结构。
本发明的具有“糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链”的PSA的糖链结构的一个示例如下述式(I)所示。
进一步，以示意图在图1中表示了的具有式(I)的糖链的PSA的一个示例。在图1中，糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基。另外，在图1中，糖链结合于PSA蛋白的异亮氨酸－精氨酸－天冬酰胺－赖氨酸(IRNK)的氨基酸序列的天冬酰胺残基(N)。
本发明的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的PSA出现在Pca患者的血清中(非专利文献5)。
本发明的“具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的游离型PSA”是指游离型PSA中的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的PSA。以下，简写为“α(2,3)糖链游离型PSA”(α(2,3)游离PSA)。
另外，本发明的“具有糖链末端唾液酸残基以α(2,6)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的游离型PSA”是指游离型PSA中的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,6)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的PSA。以下，简写为“α(2,6)糖链游离型PSA”(α(2,6)游离PSA)。
＜本发明的Pca判定方法＞
本发明的Pca判定方法是“前列腺癌的判定方法，其中，测定来自生物体的试样(以下，也简称为“试样”)中的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率，该比率高于40％的情况下，判定为是前列腺癌或其可能性高”。
本发明的游离型PSA量是指试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的总量。
本发明的“α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA”是指不具有本发明的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的游离型PSA。
作为本发明的Pca判定方法，优选“前列腺癌的判定方法，其中，测定来自生物体的试样中的游离型PSA量以及α(2,3)糖链游离型PSA量，确定所得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率，该比率为40％或高于40％时，判定为是前列腺癌或其可能性高”。
(1)测定游离型PSA量的方法
作为本发明的测定试样中的游离型PSA量的方法，可举出：
1)直接测定试样中的游离型PSA量的方法、或
2)分别测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，以它们的总和作为游离型PSA量的方法。
1)直接测定试样中的游离型PSA量的方法
直接测定游离型PSA量时，通过公知的测定游离型PSA量的方法测定即可。例如，通过使用抗游离型PSA抗体、或抗PSA抗体和抗游离型PSA抗体的公知的免疫学的测定法等测定即可。
本发明的抗PSA抗体是对PSA有亲和性的抗体，具体而言是对PSA的核心蛋白有亲和性的(结合)的抗体。即，本发明的抗PSA抗体涵盖与游离型PSA和结合型PSA这两者结合的抗体、和与游离型PSA特异性结合的抗体(抗游离型PSA抗体)。只要没有特别限定，在本说明书中单称为抗PSA抗体的情况下包括与游离型PSA和结合型PSA这两者结合的抗体、和与游离型PSA特异性结合的抗体。
对本发明的抗PSA抗体的种类没有特别的限定，例如多克隆抗体、单克隆抗体的无论哪个都行，可任意地单独使用它们或适当组合它们使用等。另外，也可以是这些抗体的Fab、(ab')2、Fab'片段或者抗体可变区域。
本发明的抗PSA抗体可以使用市售的抗体。
作为本发明的抗PSA抗体中的具有与游离型PSA和结合型PSA这两者的亲和性的抗体的市售品，可举出，例如抗PSA单克隆抗体PSA10(抗PSA单克隆抗体，克隆编号：PSA10、和光纯药工业(株)自制品)、抗PSA单克隆抗体(5A6)(HyTest公司)、抗PSA单克隆抗体(5G6)(HyTest公司)、抗PSA单克隆抗体(PS6)(HyTest公司)、抗PSA单克隆抗体(PSA14)(和光纯药工业(株)自制品)、抗前列腺特异性抗原抗体(EP1588Y)(艾博抗公司(アブカム社))、抗前列腺特异性抗原抗体(A67-B/E3)(艾博抗公司)、抗前列腺特异性抗原抗体(35H9)(艾博抗公司)、抗前列腺特异性抗原抗体(KLK3/801)(艾博抗公司)、抗前列腺特异性抗原抗体(3E6)(艾博抗公司)、抗前列腺特异性抗原抗体(8301)(艾博抗公司)、抗前列腺特异性抗原抗体(A5D5)(艾博抗公司)、抗前列腺特异性抗原抗体(PSA28/A4)(艾博抗公司)、抗前列腺特异性抗原抗体(1H12)(艾博抗公司)等。
作为本发明的抗PSA抗体中的与游离型PSA特异性结合的抗体(抗游离型PSA抗体)的市售品，可举出，例如抗PSA单克隆抗体PSA12(抗PSA单克隆抗体，克隆编号：PSA12、和光纯药工业(株)自制品)、抗PSA单克隆抗体(8A6)(HyTest公司)、抗PSA单克隆抗体(PS1)(HyTest公司)、抗PSA单克隆抗体(克隆108)(Anogen公司)、抗前列腺特异性抗原抗体(PS2)(艾博抗公司)、抗前列腺特异性抗原抗体(2H9)(艾博抗公司)等。
本发明的抗PSA抗体(包括抗游离型PSA抗体)也可以被可检出的标记物质标记。用于标记该抗体的标记物质可举出与后叙的标记“用作本发明的亲和(affinity)物质的抗体”的标记物质相同的物质。另外，该抗体的标记方法可举出与后叙的对用作本发明的亲和物质的抗体进行标记的方法相同的方法。
游离型PSA量可以使用以下物质进行测定：市售的游离型PSA检测用试剂盒(例如人类循环肿瘤生物标志物面板1选择试剂盒(Human Circulating Cancer BioMarkerPanel 1Select kit)(LUMINEX公司制)等)、游离PSA·Abbott(雅培公司(アボット社))、LUMIPULSE游离PSA(FUJIREBIO公司(富士レビオ(株)))、VITROS游离PSA(奥托临床诊断公司(オーソ·クリニカル·ダイアグノスティックス(株)))、ST AIA-PACK游离PSA(东槽(株))、EclusysTM(エクルーシスTM)试药游离PSA(罗氏诊断(株))。
2)分别测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，以它们的总量作为游离型PSA量的方法
作为上述方法可举出，后叙的“测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”中记载的方法。
(2)测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游 离型PSA以外的游离型PSA量的方法
在本发明的判定方法中，“测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法”包括测定“α(2,3)糖链游离型PSA量”的方法、或“测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”。
另外，在测定α(2,3)糖链游离型PSA量时，优选通过对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上的测定方法来测定。
在本发明中，对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率是指：
①用于从试样中混合存在的具有各种糖链修饰异构体的游离型PSA中，捕集并检出(测定)作为目标的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链(α2,3型唾液酸化糖链)的游离型PSA的效率、或
②用于从试样中混合存在的具有各种糖链修饰异构体的游离型PSA中，检出(测定)作为目标的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链(α2,3型唾液酸化糖链)的游离型PSA的效率。
换言之，本发明的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率也可以称作是能最终的检出的α(2,3)糖链游离型PSA相对于试样中存在的游离型PSA的总量的比例。
本发明的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为100％。
本发明的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率能够通过后叙的方法确认。但是，没有必要在每次测定α(2,3)糖链游离型PSA量等时确认捕集效率。
作为“测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”，可举出，例如：
1)使用对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性的物质(以下，简写为“亲和物质”)，利用α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与该亲和物质的相互作用，测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法；或
2)不使用亲和物质，测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法。
1)利用α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用来测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法
亲和物质
上述方法中使用的亲和物质是指对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性的(结合)物质。优选，对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有特异亲和性的(特异性结合)物质。特别优选，对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性(结合)，但对其以外的糖链(例如糖链末端唾液酸残基以α(2,6)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链等)没有亲和性的(不结合)物质。
作为本发明的亲和物质，可举出，例如带有这样的性质的凝集素或抗体。以下，针对作为亲和物质的凝集素以及抗体作更详细的说明。
亲和物质：凝集素
作为用作本发明的亲和物质的凝集素，可举出对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性的(结合)凝集素。优选，对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有特异亲和性的(特异性结合)凝集素。特别优选，对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性(结合)，但对其以外的糖链(例如糖链末端唾液酸残基以α(2,6)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链等)没有亲和性的(不结合)凝集素。
作为拥有这样的性质的凝集素，可举出例如来自朝鲜槐(Maackia amurensis)的凝集素MAA、来自柱状田头菇(Agrocybe cylindracea)的凝集素ACG等植物例凝集素、CD169(唾液酸结合Ig样凝集素1)、大鼠MAG、CD328、siglec-9(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9)等动物型凝集素。当中，优选MAA。
凝集素也可以被可检出的标记物质标记。
作为用于标记凝集素的标记物质，可举出例如荧光染料(异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy5、Alexa Fluor 647等)、酶(来自辣根的过氧化物酶)、辅酶、化学发光物质、放射性物质(32P、14C、125I、3H、131I等)、生物素等标记物质。另外，可以使标记物质直接结合于凝集素，也可以间隔适当的隔离物而使其结合。凝集素可以通过与标记物质的种类相匹配的本身公知的标记方法进行标记。
亲和物质：抗体
作为本发明的用作亲和物质的抗体，可举出对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有特异亲和性的(结合)抗体。优选，对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有特异亲和性的(特异性结合)抗体。特别优选，对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性(结合)，但对其以外的糖链(例如糖链末端唾液酸残基以α(2,6)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链等)没有亲和性的(不结合)抗体。
对作为本发明的亲和物质使用的抗体的种类没有特别限定，例如，可以使用多克隆抗体、单克隆抗体的任一者，任意地单独使用它们或者适当组合它们来使用等。另外，也可以是这些抗体的Fab、(ab')2、Fab'片段或者抗体可变区域。
作为本发明的亲和物质使用的抗体可以使用市售的抗体。
作为本发明的亲和物质使用的抗体、即对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性的抗体的市售品，可举出例如抗Siaα2-3单克隆抗体(HYB4)(和光纯药工业(株)制)、抗GM3(Neu Ac)单克隆抗体(克隆：M2590)(和光纯药工业(株)制)、抗唾液酸化的Lea抗原单克隆抗体(MSW113)(和光纯药工业(株)制)、抗-GM3单克隆抗体(东京化成工业(株))、抗-唾液酸化的路易斯A单克隆抗体(1H4)(东京化成工业(株))、抗-唾液酸化的路易斯A单克隆抗体(NKH3)(醣联公司(GLYCONEX INC.))等。
作为本发明的亲和物质使用的抗体，可以被可检出的标记物质标记。作为用于标记该抗体的标记物质，可举出例如在EIA(ELISA,Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附测定)中使用的碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、微过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙酰胆碱酯酶、苹果酸脱氢酶、荧光素酶等酶类，例如在RIA(Radioimmunoassay，放射免疫测定)中使用的99mTc、131I、125I、14C、3H等放射性同位素，例如HiLyte 647(AhaSpec公司制)、荧光素(fluorescein)、丹磺酰、荧光胺、香豆素、萘胺或它们的衍生物等荧光性物质，例如虫荧光素(luciferin)、异鲁米诺、鲁米诺、双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯等发光性物质，例如苯酚、萘酚、蒽或它们的衍生物等在紫外部有吸收的物质，例如4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基、3-氨基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-1-氧基、2,6-二-叔丁基-α-(3,5-二-叔丁基-4-氧-2,5-环己二烯-1-亚基)-p-甲苯氧基等具有氧基的化合物所代表的具有作为自旋标记剂的性质的物质等。
在使上述那样的标记物质与抗体结合(标记)时，例如适宜利用以下方法来进行即可，在本身公知的EIA、RIA或者FIA等中通常实施的本身公知的标记方法[例如，医化学实验讲座、第8卷、山村雄一监修、第1版、中山书店、1971；图说荧光抗体、川生明著、第1版、(株)软件科学公司(ソフトサイエンス社)、1983；酶免疫测定法、石川荣治、河合忠、室井洁编、第2版、医学书院、1982等]。另外，作为标记方法，自不用说也可以使用利用亲和素(avidin)(或链霉亲和素)与生物素的反应的常规方法。
在上述1)的方法即“利用α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”中，优选对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上。
上述方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率是“用于从试样中混合存在的具有各种糖链修饰异构体的游离型PSA蛋白中，捕集并检出(测定)作为目标的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链(α2,3型唾液酸化糖链)的游离型PSA的效率”。
换言之，上述方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率也可以说是最终可检出的α(2,3)糖链游离型PSA相对于试样中存在的α(2,3)糖链游离型PSA的总量的比例。
在上述方法中，作为求算对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率的方法，可举出例如下面的方法。
使用亲和物质和已知浓度的“仅具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的α(2,3)糖链游离型PSA”(以下，记载为“α(2,3)糖链游离型PSA标准物”。)，进行α(2,3)糖链游离型PSA的测定。捕集效率通过求出α(2,3)糖链游离型PSA量的测定值相对于作为试样供于测定的α(2,3)糖链游离型PSA量的比例而得来。
或者，使用亲和物质和被可检出的标记物质标记过的α(2,3)糖链游离型PSA标准物，进行α(2,3)糖链游离型PSA的测定。然后，不使用亲和物质，同样地进行被可检出的标记物质标记过的α(2,3)糖链游离型PSA的测定。捕集效率通过求出使用亲和物质得到的测定结果相对于不使用亲和物质得到的测定结果的比例而得来。
作为求出捕集效率的方法的具体例，可举出例如下面的方法。即，使亲和物质与(浓度已知的)α(2,3)糖链游离型PSA标准物反应。反应后，将α(2,3)糖链游离型PSA与亲和物质形成的复合体的组分和未反应组分分离，通过质量分析装置分析各个组分的靶标糖链的量。捕集效率通过求出形成复合体的组分的靶标糖链的量/(形成复合体的组分的靶标糖链的量+未反应组分的靶标糖链的量)而得来。
作为α(2,3)糖链游离型PSA标准物的制作方法，可举出例如，后叙的实施例2(1)中记载的方法。即，例如，按照非专利文献6的第2部分材料和方法(2.Materials andmethods)(2.7Forced expression of FLAG-tag-fused S2,3PSA，FLAG标签融合的S2,3PSA的强制表达)中公开的的方法，获得r游离型PSA(包括rα(2,3)糖链游离型PSA和rα(2,6)糖链游离型PSA)。通过公知的方法从获得的r游离型PSA中分离出rα(2,3)糖链游离型PSA和rα(2,6)糖链游离型PSA并纯化。例如，首先，通过使用对唾液酸基α2,3-半乳糖结构表现出高亲和性的凝集素的凝集素柱色谱法，分离rα(2,3)糖链游离型PSA和rα(2,6)糖链游离型PSA。其后，进行凝胶过滤，分别纯化rα(2,3)糖链游离型PSA和rα(2,6)糖链游离型PSA。能将得到的纯化rα(2,3)糖链游离型PSA用作“α(2,3)糖链游离型PSA标准物”。另外，根据需要，能将得到的纯化rα(2,6)糖链游离型PSA用作“α(2,6)糖链游离型PSA标准物”。
需要说明的是，无需在每次测定α(2,3)糖链游离型PSA量等时都确认捕集效率。只要曾确认过一次在使用某一亲和物质来测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的情况下的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上、特别优选为100％，那么在使用该亲和物质测定α(2,3)糖链游离型PSA量的情况下，就无需再次确认捕集效率。
上述1)方法的α(2,3)糖链游离型PSA的测定方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为100％。
作为本发明的“利用α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”，可举出“通过α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用，生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，测定该复合体的量，基于该结果来测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”。
上述方法中，优选，对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上。
上述方法中，作为“通过α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用，生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体的方法”，可举出“在与α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链相对应的该亲和物质的亲和性的作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体的方法”。根据后续进行的该复合体的测定方法，其具体的方法可变化。在每次实施该复合体的测定方法时，适当选择最佳方法来实施即可。
作为上述方法的更优选示例，可举出“在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，不将该复合体以外的成分从体系内去除而测定该复合体的量，根据其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”。
“不将该复合体(α(2,3)糖链游离型PSA与亲和物质的复合体)以外的成分从体系内去除而测定该复合体的量的方法”是指利用不进行所谓的B/F分离的均匀的方法测定α(2,3)糖链游离型PSA与亲和物质的复合体的量的方法。例如，可举出不进行通常实施的用于从测定体系去除该复合体以外的成分的洗涤操作，测定该复合体的量的方法。
在以上方法中，优选“在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，不将该复合体以外的成分从体系内去除(不进行通常实施的用于将该复合体以外的成分从测定体系去除的洗涤操作)测定该复合体的量，根据其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”。
进一步，在上述方法中，优选，对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上。
本发明的测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法中使用的亲和物质，必须是要能检测出试样中的α(2,3)糖链游离型PSA的80％以上的充分的量。
即，测定α(2,3)糖链游离型PSA时，需要用充足量的亲和物质，该量要足以形成α(2,3)糖链游离型PSA的复合体以使试样中的α(2,3)糖链游离型PSA的80％以上的量能被检测出来。
上述亲和物质的使用量，可考虑亲和物质对α(2,3)糖链游离型PSA的结合常数和试样中的α(2,3)糖链游离型PSA的量来决定。
在使用那种对α(2,3)糖链游离型PSA的亲和性强、只要与α(2,3)糖链游离型PSA结合就不再解离的亲和物质的情况下，测定时，以试样中的α(2,3)糖链游离型PSA的80％以上与亲和物质形成了复合体的程度，使用充足量的亲和物质。
在使用那种对α(2,3)糖链游离型PSA的亲和性不足而即使暂时与α(2,3)糖链游离型PSA结合也再解离的亲和物质的情况下，再解离之后，测定时，需要以试样中的α(2,3)糖链游离型PSA的80％以与亲和物质形成了复合体的程度，使用充足量的亲和物质。
为了满足以上条件而使用的亲和物质的量，优选，相对试样中的α(2,3)糖链游离型PSA使用过剩量(饱和量)的亲和物质。
需要说明的是，在上述1)的方法即“利用α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用，测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”中，作为仅测定α(2,3)糖链游离型PSA的方法，可举出例如，通过使用通过可检出的标记物质对亲和物质进行标记后的标记亲和物质，不检测α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA而仅检测标记亲和物质与α(2,3)糖链游离型PSA的复合体，由此仅测定α(2,3)糖链游离型PSA的方法等。作为测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量两者的方法，通过利用α(2,3)糖链游离型PSA与亲和物质的相互作用将α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,6)糖链游离型PSA以外的游离型PSA分离后，用抗PSA抗体等测定PSA，由此，测定α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,6)糖链游离型PSA以外的游离型PSA两者的方法等。
以下，叙述仅测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法、以及测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量两者的方法的具体实例。
在以下的具体实例中，方便起见有时将“糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链”记作“靶标糖链”。
(a)仅测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法
[方法1]
工序1)使来自生物体的试样、由标记物质标记过的对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第一抗体、对PSA有亲和性的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)根据需要，将上述1)中得到的第一复合体和第二复合体分离；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记抗体的标记物质的信号，测定第一复合体的量，在此测定值的基础上求出α(2,3)糖链游离型PSA量。
上述方法1中使用的第二抗体也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法2]
工序1)使来自生物体的试样、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性且由标记物质标记过的第一抗体(亲和物质)、对PSA有亲和性的第二抗体接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体的复合体(第一复合体)、和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)根据需要，分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定第一复合体的量，在此测定值的基础上求出α(2,3)糖链游离型PSA量。
用于上述方法2中的第二抗体也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第一抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法3]
工序1)使来自生物体的试样、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性且由标记物质标记过的第一抗体(亲和物质)、对PSA有亲和性的第二抗体、与游离型PSA特异性结合的第三抗体接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与第三抗体的复合体(第一复合体)、和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体与第三抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)根据需要，分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定第一复合体的量，在此测定值的基础上求出α(2,3)糖链游离型PSA量。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第一抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
在上述方法1、2、3的情况下，游离型PSA量通过实施上述的直接求算游离型PSA量的方法来求出即可。另外，α(2,3)糖链游离型PSA量使用对预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物同样地进行测定所得到的结果的常用方法，来进行定量值换算求出即可。
(b)测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量两者的方法
[方法4]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且由标记物质标记过的抗体(标记抗PSA抗体)、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成标记抗PSA抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与该凝集素的复合体(第一复合体)、和标记抗PSA抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记抗PSA抗体的标记物质的信号，测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
上述方法4中使用的对PSA有亲和性且由标记物质标记过的抗体相关的抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法5]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且由标记物质标记过的第一抗体、对PSA有亲和性的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
作为上述方法5中使用的第一抗体与第二抗体的组合示例，可举出例如以下的组合。其中，优选，第一抗体与第二抗体的表位不同。
·第一抗体以及第二抗体是对PSA有亲和性的抗体。
·第一抗体是对PSA有亲和性的抗体，第二抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体。
·第一抗体以及第二抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体。
·第一抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体，第二抗体是对PSA有亲和性的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法6]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且由标记物质标记过的第一抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
作为上述方法6中使用的第一抗体与第二抗体的组合示例，可举出例如以下的组合，其中，优选，第一抗体与第二抗体的表位不同。
·第一抗体是对PSA有亲和性的抗体，第二抗体是对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的抗体。
·第一抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体，第二抗体是对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法7](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成该抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与该凝集素的复合体(第一复合体)、和该抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
上述方法7中使用的对PSA有亲和性的抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
[方法8](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的第一抗体、与游离型PSA特异性结合的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
[方法9](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的第一抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
上述方法9中使用的第一抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
[方法10]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且由标记物质标记过的第一抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第二抗体(亲和物质)接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体的复合体(第一复合体)、和标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
上述方法10中使用的第一抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第二抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法11]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且标记物质标记过的第一抗体、对PSA有亲和性的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第三抗体(亲和物质)接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与第三抗体的复合体(第一复合体)、和标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序2)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定上述工序3)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
作为上述方法11中使用的第一抗体与第二抗体的组合示例，可举出例如以下的组合。其中，优选，第一抗体与第二抗体的表位不同。
·第一抗体以及第二抗体是对PSA有亲和性的抗体。
·第一抗体是对PSA有亲和性的抗体，第二抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体。
·第一抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体，第二抗体是对PSA有亲和性的抗体。
·第一抗体以及第二抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第三抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法12](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的第一抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第二抗体(亲和物质)接触，形成第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体的复合体(第一复合体)、和第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
上述方法12中使用的第一抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第二抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
[方法13](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的第一抗体、与游离型PSA特异性结合的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第三抗体接触，形成第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与第三抗体(亲和物质)的复合体(第一复合体)、和第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，将第一复合体的量作为α(2,3)糖链游离型，将第一复合体的量和第二复合体的量之和作为游离型PSA量。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第三抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
2)不使用亲和物质测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法
上述方法中，优选，对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上。
例如，可举出使用质量分析装置的方法。
另外，该方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率是指，“从试样中混合存在的具有各种各样糖链修饰异构体的游离型PSA蛋白中，捕集并检出(测定)作为靶标的具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链(α2,3型唾液酸化糖链)的游离型PS的效率”。
换言之，该方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率也可以称之为最终可检出的α(2,3)糖链游离型PSA相对于试样中存在的α(2,3)糖链游离型PSA总量的比例。
(3)确定比率的方法
1)测定比率的方法-1
作为本发明的“确定来自生物体的试样中的α(2,3)糖链游离型PSA相对于游离型PSA量的比率”方法，例如，可举出下面的方法。
即，使用一种以上的用α(2,3)糖链游离型PSA标准物预先制作的已经知道α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的基准液，通过上述方法进行α(2,3)糖链游离型PSA量的测定。其后，使用待检试样，同样地通过上述方法进行α(2,3)糖链游离型PSA量的测定。然后，通过比较用基准液得到的测定结果与用待检试样得到的测定结果，能够确定待检试样的α(2,3)糖链游离型PSA相对于游离型PSA量的比率。
对于使用的基准液而言，使用的是α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率是在实施后续进行Pca判定时作为指标那样的数值。例如，使用该比率为25％、45％、50％的基准液即可。
作为该基准液的制作方法，例如，可举出下面的方法。
即，分别将α(2,3)糖链游离型PSA标准物和α(2,6)糖链游离型PSA标准物溶解于适当的缓冲液，以各个溶液的蛋白量变成相同的方式进行调节。其后，用α(2,6)糖链游离型PSA标准物溶液稀释α(2,3)糖链游离型PSA标准溶液，以成为目标比率的方式进行调节，由此能够得到基准液。
2)确定比率的方法-2
作为测定比率的其他方法，可举出本发明的判定方法相关的“测定来自生物体的试样中的游离型PSA量以及α(2,3)糖链游离型PSA量，确定得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的方法”。
上述方法中的游离型PSA量以及α(2,3)糖链游离型PSA量的测定方法的详情，如上述“(1)测定游离型PSA量的方法”以及“(2)测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”中所述。
作为测定比率的方法-2的具体实例，例如，可举出：
(i)“通过测定来自生物体的试样中的游离型PSA量，进而在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质(凝集素或抗体)的相互作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，测定该复合体的量，基于其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法，由此测定α(2,3)糖链游离型PSA量，确定得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的方法”；
(ii)“通过在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质(凝集素或抗体)的相互作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，测定该复合体的量，基于其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法，由此测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，确定得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的总和的比率的方法”；或
(iii)“通过不使用亲和物质测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法，由此测定α(2,3)糖链游离型PSA量、或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，确定得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的方法”。
上述(i)～(iii)的方法中，优选测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上。
另外，本发明的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上，特别优选为100％。
上述方法中，优选(i)或(ii)的方法。
当中，更优选：
(i)’“通过测定来自生物体的试样中的游离型PSA量，进而在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质(凝集素或抗体)的相互作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，不将该复合体以外的成分从体系内去除而测定该复合体的量，基于其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法的方法，由此测定α(2,3)糖链游离型PSA量，确定得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的方法”；或
(ii)’“在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质(凝集素或抗体)的相互作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，不将该复合体以外的成分从体系内去除而测定该复合体的量，基于其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法，由此测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，确定得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的总和的比率的方法”。
在上述(i)’或(ii)’的方法中，优选，测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上。
在上述方法中，更优选作为亲和物质使用凝集素的上述方法。
在上述(ii)’的方法中，特别优选，作为亲和物质使用凝集素的方法，即，“通过在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素的相互作用下，生成α(2,3)糖链游离型PSA与该凝集素的复合体后，不将该复合体以外的成分从体系内去除而测定该复合体的量，基于其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法，由此测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，确定得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的总和的比率的方法”。
在上述方法中，优选，测定α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率为80％以上。
需要说明的是，在本发明中，在求算α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率时，也可以不测定游离型PSA量、α(2,3)糖链游离型PSA量、α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的绝对量(PSA蛋白量)。能用测定的实测值(荧光强度、吸光度等的信号值、峰面积)，求算该比率。例如，在分离出α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的情况下，只要求出各个分离组分的峰面积，将α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积/(α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的峰面积)作为α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率即可。
另外，例如，在分离出α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA，使用荧光标记抗PSA抗体分别将其检出时，能将α(2,3)糖链游离型PSA组分的荧光量/(α(2,3)糖链游离型PSA组分的荧光量+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的荧光量)作为α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
本发明的判定方法相关的“测定来自生物体的试样中的游离型PSA量以及α(2,3)糖链游离型PSA量，确定得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的方法”的具体的实施方式的示例，记载在下面。
在以下的实施方式的示例中，方便起见有时将“糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链”记作“靶标糖链”。
需要说明的是，在本说明书中“有亲和性”意味着，例如“结合”。另外，“基于亲和性进行分离”意味着，例如，将要分离的对象“基于其结合的强度差异进行分离”。例如，在以下的实施方式中，“基于对该凝集素的亲和性分离第一复合体和第二复合体”意味着，例如，“基于第一复合体对该凝集素的结合强度与第二复合体对该凝集素的结合强度的差异分离第一复合体和第二复合体”。
(a)作为亲和物质使用对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素的方法
[方法A]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且由标记物质标记过的抗体(标记抗PSA抗体)、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成标记抗PSA抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与该凝集素的复合体(第一复合体)、和标记抗PSA抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记抗PSA抗体的标记物质的信号，测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序3)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
上述方法A中使用的对PSA有亲和性且由标记物质标记过的抗体相关的抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法B]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且标记物质标记过的第一抗体、对PSA有亲和性的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，生成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序3)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
作为上述方法B中使用的第一抗体与第二抗体的组合示例，可举出例如以下的组合。其中，优选，第一抗体与第二抗体的表位不同。
·第一抗体以及第二抗体是对PSA有亲和性的抗体。
·第一抗体是对PSA有亲和性的抗体，第二抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体。
·第一抗体以及第二抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体。
·第一抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体，第二抗体是对PSA有亲和性的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法C]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且标记物质标记过的第一抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序4)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
作为上述方法C中使用的第一抗体与第二抗体的组合示例，可举出例如以下的组合，其中，优选，第一抗体与第二抗体的表位不同。
·第一抗体是对PSA有亲和性的抗体，第二抗体是对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的抗体。
·第一抗体是与游离型PSA特异性结合的标记抗体，第二抗体是对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法D]
工序1)使来自生物体的试样、由标记物质标记过的对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第一抗体、对PSA有亲和性的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)根据需要，将上述1)中得到的第一复合体和第二复合体分离；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记抗体的标记物质的信号，测定第一复合体的量，在此测定值的基础上求出α(2,3)糖链游离型PSA量；
工序4)确定上述3)中求出的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于预先求出的来自生物体的试样中的游离型PSA量的比率。
上述方法D中使用的第二抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
另外，在上述方法D中，游离型PSA量通过实施上述的直接求算游离型PSA量的方法来求出即可。另外，α(2,3)糖链游离型PSA量只要使用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物同样地进行测定，基于常用的方法对所得的结果进行定量值换算来求出即可。
[方法E](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成该抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与该凝集素的复合体(第一复合体)、和该抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序3)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
上述方法E中使用的对PSA有亲和性的抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
[方法F](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的第一抗体、与游离型PSA特异性结合的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序4)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
[方法G](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的第一抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第二抗体、和对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素(亲和物质)接触，形成第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与该凝集素的复合体(第一复合体)、和第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序3)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
上述方法G中使用的第一抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于凝集素对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
(b)作为亲和物质使用对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的抗体的方法
[方法H]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且标记物质标记过的第一抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第二抗体(亲和物质)接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体的复合体(第一复合体)、和标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序3)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
上述方法H中使用的第一抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第二抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法I]
工序1)使来自生物体的试样、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性且由标记物质标记过的第一抗体(亲和物质)、对PSA有亲和性的第二抗体接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体的复合体(第一复合体)、和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)根据需要，分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定第一复合体的量，在此测定值的基础上求出α(2,3)糖链游离型PSA量；
工序4)确定上述3)中求出的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于预先求出的来自生物体的试样中的游离型PSA量的比率。
上述I方法中使用的第二抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第一抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
另外，上述方法I中，游离型PSA量通过实施上述的直接求算游离型PSA量的方法来求出即可。另外，α(2,3)糖链游离型PSA量只要使用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物同样地进行测定，基于常用的方法对所得的结果进行定量值换算来求出即可。
[方法J]
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性且标记物质标记过的第一抗体、对PSA有亲和性的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第三抗体(亲和物质)接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与第三抗体的复合体(第一复合体)、和标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序2)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定上述工序3)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序3)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
作为上述方法J中使用的第一抗体与第二抗体的组合示例，可举出例如以下的组合。其中，优选，第一抗体与第二抗体的表位不同。
·第一抗体以及第二抗体是对PSA有亲和性的抗体。
·第一抗体是对PSA有亲和性的抗体，第二抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体。
·第一抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体，第二抗体是对PSA有亲和性的抗体。
·第一抗体以及第二抗体是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第三抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
[方法K]
工序1)使来自生物体的试样、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性且由标记物质标记过的第一抗体(亲和物质)、对PSA有亲和性的第二抗体、与游离型PSA特异性结合的第三抗体接触，形成标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与第三抗体的复合体(第一复合体)、和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体与第三抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)根据需要，分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)通过测定来自构成该复合体的标记第一抗体的标记物质的信号，测定第一复合体的量，在此测定值的基础上求出α(2,3)糖链游离型PSA量；
工序4)确定上述3)中求出的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于预先求出的来自生物体的试样中的游离型PSA量的比率。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第一抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
另外，上述方法K中，游离型PSA量通过实施上述的直接求算游离型PSA量的方法来求出即可。另外，α(2,3)糖链游离型PSA量只要使用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物同样地进行测定，基于常用的方法对所得的结果进行定量值换算来求出即可。
[方法L](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的第一抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第二抗体(亲和物质)接触，形成第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体的复合体(第一复合体)、和第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序3)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
上述方法L中使用的第一抗体，也可以是与游离型PSA特异性结合的抗体。
另外，对于第一复合体和第二复合体，可以基于第二抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
[方法M](不使用标记抗体的方法)
工序1)使来自生物体的试样、对PSA有亲和性的第一抗体、与游离型PSA特异性结合的第二抗体、对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的第三抗体接触，形成第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA与第二抗体与第三抗体(亲和物质)的复合体(第一复合体)、和第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合体(第二复合体)；
工序2)分离上述工序1)中得到的第一复合体和第二复合体；
工序3)测定上述工序2)中分离出的第一复合体的量以及第二复合体的量；
工序4)求出上述工序3)中得到的第一复合体的量和第二复合体的量之和，求出上述工序3)中得到的第一复合体的量相对于该和的比率，由此确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
对于第一复合体和第二复合体，可以基于第三抗体对靶标糖链的亲和性进行分离，也可以基于第一复合体与第二复合体的质量差进行分离(例如电泳等)。
测定第一复合体的量和第二复合体的量时，例如，只要测定各个复合体的PSA蛋白量即可。具体而言，可举出，在通过电泳分离出了第一复合体与第二复合体的情况下，例如实施作为一次抗体使用上述的抗PSA抗体、作为二次抗体使用由能测定的标记物质标记过的标记抗体的公知的蛋白免疫印迹法，测定分离出的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
在上述施方式A～M中，作为实施“在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，不将该复合体以外的成分从体系内去除而测定该复合体的量，基于其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法”的方法，可举出，不进行用于从测定体系去除该复合体以外的成分的通常实施的洗涤操作而测定该复合体的量的方法。
在上述A～M的方法中，优选A、B、E、F以及H～M的方法。作为使用标记抗体的方法，更优选B以及I的方法。作为不用标记抗体的方法，更优选E、F、L、以及M的方法。特别优选B以及I的方法。
作为本发明的“在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，测定该复合体的量，根据其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量或测定α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法”的具体实例，可举出例如ELISA、RIA。
作为本发明的“在α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用下生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，不将该复合体以外的成分从体系内去除而测定该复合体的量，基于其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法”的具体实例，可举出例如，毛细管电泳、表面等离子体共振法、质量分析、或凝集素微阵列等)等。
以下，通过各个方法，说明“利用α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质的相互作用生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，(不将该复合体以外的成分从体系内去除)测定该复合体的量，基于其结果测定α(2,3)糖链游离型PSA量，确定得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的方法”的具体实例。
对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率的验证方法如上所述，例如，在使用亲和物质的情况下，只要如下进行即可。
以下述方法使亲和物质与α(2,3)糖链游离型PSA标准物反应。反应后，将α(2,3)糖链游离型PSA与亲和物质形成的复合体的组分和未反应组分分离，通过质量分析装置分析各个组分的靶标糖链的量。捕集效率可通过求出形成复合体的组分的靶标糖链的量/(形成复合体的组分的靶标糖链的量+未反应组分的靶标糖链的量)而得到。
需要说明的是，下述方法分别记载了捕集效率的求算方式的示例，但是并不限定于这些方法。
毛细管电泳
作为通过毛细管电泳求出α(2,3)糖链游离型PSA量来确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的方法，例如，首先使含PSA的来自生物体的试样、与由标记物质标记过本发明的抗PSA抗体(优选为抗游离型PSA抗体)的标记抗PSA抗体接触/反应，通过在亲和物质的存在下实施毛细管电泳从而分离所得到的反应液中的[标记抗PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA]复合体和[标记抗PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA]复合体，测定来自[标记抗PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA]复合体1的标记物质的量、以及来自[标记抗PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA]复合体2的标记物质的量。将复合体1和复合体2的标记物质的量之和作为试样中的游离型PSA量。然后，然后，求出得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
因为来自复合体1的标记物质的量以及来自复合体2的标记物质的量与通过毛细管电泳得到的各个峰面积值相对应，所以只要使用各个峰面积值来求出该比率即可。
上述方法中使用的标记抗PSA抗体的抗PSA抗体以及其标记物质的具体实例如上所述。
作为使来自生物体的试样与标记抗PSA抗体(优选为抗游离型PSA抗体)反应时的溶剂，可举出例如缓冲液。作为以该目的使用的缓冲液，只要是该领域通常使用的缓冲液即没有特别限定，可举出通常在pH 5.0～10.0、优选pH 6.5～8.5中性附近有缓冲作用的缓冲液。具体而言，可举出例如Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗拿(Veronal)缓冲液、古德(Good’s)缓冲液等。另外，作为这些缓冲液的缓冲剂浓度，可从通常的5～1000mM、优选5～300mM的范围中适当选择。
在该缓冲液中进一步存在增敏剂、表面活性剂、防腐剂(例如叠氮化钠、水杨酸、安息香酸等)、稳定剂(例如白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、表面活性剂、糖类等)、活化剂其他在该领域使用的物质，其中也可以有妨碍与共存的试药的稳定性而不妨碍抗原抗体反应的物质。另外，这些试药类等的浓度范围等只要适当选择本身公知的该测定方法中通常使用的浓度范围等来使用即可。
使用毛细管电泳装置专用的市售的试剂盒的情况下，可以使用在该试剂盒中添附的缓冲液。
含标记抗PSA抗体的溶液中的该抗体的浓度只要是试样与含标记抗PSA抗体的溶液混合时达到目标浓度范围内那样的浓度即可。例如，只要是0.1～200μM、优选为0.5～50μM、更优选为0.5～20μM、进一步优选为0.5～10μM即可。即，下限值是0.1μM，优选为0.5μM。而且，其上限值是200μM、优选为50μM、更优选为20μM、进一步优选为10μM。
使来自生物体的试样与本发明的标记抗PSA抗体接触/反应时的本发明的标记抗PSA抗体在反应液中的浓度，根据试样中的PSA的浓度而有所不同，没有特别限定，通常是0.1～1000nM，优选为0.1～500nM，更优选为0.5～200nM。即，下限值是0.1nM、优选为0.5nM。而且，其上限值是1000nM，优选为500nM，更优选为200nM。
另外，作为来自生物体的试样与本发明的标记抗PSA抗体反应时的pH，只要在不抑制抗原抗体反应的范围内即没有特别的限定，可举出通常是6.0～10.0、优选为6.0～8.0的范围，反应时的温度在不抑制抗原抗体反应的范围内也没有特别的限定，可举出通常是10～50℃、优选为20～40℃的范围。另外，其反应时间，因为根据使用的本发明的抗体以及pH以及温度等反应条件而有所不同，所以根据各个反应情况使其以1～60分钟、优选为1～15分钟左右进行反应即可。
反应后，通过在亲和物质的存在下实施毛细管电泳从而分离所得到的反应液中的[标记抗PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA]复合体和[标记抗PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA]复合体，测定[标记抗PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA]复合体的量。
在本发明中，在毛细管电泳中，优选实施通过毛细管芯片进行的电泳。(微)芯片毛细管电泳是指在芯片基板上形成截面直径100μm以下的毛细管，在该毛细管中进行电泳的技术，通过给毛细管内施加电压从而以样品内存在的物质的电荷的差异作为其迁移率的差异进行分离的方法。
毛细管电泳根据使用的电泳溶液分类为毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳，本发明的方法可适用任一种。若考虑分离的准确度，优选上述中的毛细管凝胶电泳。
作为本发明的毛细管电泳中使用的电泳溶液，只要是通常在该领域使用的即可，没有特别限定，具体而言，可举出例如pH5～10的缓冲液，优选为6～8的缓冲液。作为缓冲液，具体能举出例如Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、乳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、邻苯二甲酸缓冲液、磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、巴比妥缓冲液、酒石酸缓冲液、硼酸缓冲液等，但不限于这些。作为这些缓冲液中的缓冲剂浓度，可从通常的10～500mM、优选为10～300mM的范围适当选择。
另外，上述电泳溶液中可以含有用于减小电渗流影响的物质，例如聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、含氟芳香族烃、糖类等，其浓度只要在通常该领域所使用的范围内设定即可。另外，在该缓冲液中也可以包含例如NaCl等盐类、表面活性剂、防腐剂、BSA等蛋白等，只要其量不妨碍抗原抗体反应以及糖链与亲和物质的相互作用。
另外，毛细管凝胶电泳的情况下，在作为上述毛细管电泳的电泳溶液使用的缓冲液中添加的物质可举出，例如聚环氧乙烷(聚乙二醇)、聚环氧丙烷等聚醚类、例如聚乙烯亚胺等聚亚烷基亚胺、例如聚丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸甲酯等聚丙烯酸系聚合物、例如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等聚酰胺系聚合物、例如聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等聚甲基丙烯酸系聚合物、例如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯噁唑烷酮等聚乙烯系聚合物、例如普鲁兰多糖、痂囊腔菌多糖(elsinan)、黄原胶、葡聚糖、瓜尔胶等水溶性羟基聚合物、例如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟基丙基纤维素等水溶性纤维素化合物、它们的衍生物、以及含有多种构成这些聚合物的单体单元的共聚物等聚合物等。
上述聚合物可以组合两种以上来添加。另外，作为如上述的聚合物的分子量，通常是500Da～6000kDa，优选为1～1000kDa，更优选为100～1000kDa。另外，上述聚合物的浓度只要从该领域内通常使用的范围内适当选择即可，通常是0.01～40％(w/v)、优选为0.01～20％(w/v)、更优选为0.1～10％(w/v)。需要说明的是，将上述填充剂添加至电泳用缓冲液中时的电泳用缓冲液的粘度通常是2～1000厘泊，优选为5～200厘泊，更优选为10～100厘泊。
使亲和物质包含在电泳溶液中即可。但是，在通过毛细管电泳进行分离期间，优选亲和物质的浓度比α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质能完全结合的量更高。
例如，当亲和物质是凝集素的情况下，是0.1mg/mL～20mg/mL，优选为1.0mg/mL～10mg/mL，进一步优选为2.0mg/mL～5.0mg/mL。亲和物质是抗体的情况下，是0.01mg/mL～20mg/mL，优选为0.05mg/mL～10mg/mL，进一步优选为0.1mg/mL～5.0mg/mL。
MAA在微流路内的浓度只要在0.1mg/mL～20mg/mL即可。
通过毛细管电泳分离复合体的情况下，作为亲和物质使用凝集素的情况下或使用抗体的情况下，均优选测定体系中使用的所有抗体被阴离子性物质等电荷载体分子标记。具体而言，优选例如被核酸链标记。此情况下，抗体也可以被电荷载体分子和上述的检出相关的标记物质两者标记。
用于上述目的的核酸链是以嘌呤碱基或嘧啶碱基、作为糖部分的戊糖以及磷酸构成的核甘酸残基为基本单位，在糖的3'和5'位碳之间该磷酸在各个核甘酸间通过二酯键结合而聚合成的链状聚核苷酸，例如，可举出糖部分为核糖的RNA或/和糖部分为脱氧核糖的DNA。另外，该核酸链可以由1根链或2根链及其以上的多根核酸链构成。
使用的核酸链的长度，只要能实现本发明的目的即可，通常是1bp～1000kbp，优选为5bp～100kbp，更优选为10bp～50kbp，进一步优选为50bp～2500bp。
作为使核酸链与本发明的抗体结合的方法，可举出例如日本特许第4214779号、日本特许第4862093号等中公开的公知的方法。
例如，使抗体和核酸链各自具有的官能团直接结合或经由连接体[例如磺基琥珀酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)、N-(ε-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS)等]等结合即可。
另外，也可以预先在核酸链中导入反应性官能团后，通过日本特许第4214779号中记载的方法使本发明的抗体与导入反应性官能团的核酸链结合。作为向核酸链导入反应性官能团的方法，可举出本身公知的方法。
另外，作为使核酸链与抗体结合的方法，例如，通过使用在5'末端导入了反应性官能团的PCR引物进行PCR而作为PCR产物得到在5’末端被导入了反应性官能团的核酸链的方法(分子克隆实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual),第二版，J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)等)等，由此能够向核酸末端导入反应性官能团。
作为使供给毛细管电泳的试样、抗体等溶解的溶液，可举出例如Tris缓冲液、BisTris缓冲液、古德缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗拿缓冲液、MOPS缓冲液等。另外，作为这些缓冲液中的缓冲剂浓度，可从通常的10～500mM、优选的10～300mM的范围内适当选择。另外，作为其pH，只要在不妨碍抗原抗体反应以及糖链与亲和物质的反应的范围内即没有特别限定，通常，优选5～9的范围。在该溶液中，也可以含有例如糖类、NaCl等盐类、表面活性剂、防腐剂、蛋白等，只要其量是不妨碍抗原抗体反应以及糖链与亲和物质的反应的量。
本发明的毛细管电泳中的试样(含有[标记抗PSA抗体-游离型PSA]复合体的溶液)的导入方法只要是该领域内常用的方法即可，没有特别限定，可举出例如抽吸法、加压法、电导入法等，当中优选加压法。试样的导入量根据毛细管的内径、长度、检测器的种类、灵敏度等条件而有所不同。
通常，可以将试样通过本身公知的等速电泳(ITP)浓缩后，直接将该浓缩物导入毛细管电泳(CE)。此情况下，例如在通过微芯片电泳进行的情况下，最好使用ITP电泳和CE电泳联合的芯片，连续地进行ITP电泳、CE电泳。
毛细管电泳的具体条件以本身公知的方法为准即可。例如，在使用毛细管电泳的情况下，以J.Chromatogr.593 253-258(1992)、Anal.Chem.64 1926-1932(1992)、WO2007/027495等记载的方法为准进行即可。
本发明的电泳中电泳时的电压，因为根据电泳溶液、所用装置等而不同，所以根据该领域常用的范围适当设定即可。
在通过自动分析装置进行毛细管电泳的情况下，以该装置附带的操作说明书所记载的条件，按照该操作说明书所记载的方法，实施毛细管电泳即可。
作为本发明的α(2,3)糖链游离型PSA的测定方法的具体实例，示出以下的方法，在该方法中作为亲和物质使用MAA，作为标记抗PSA抗体使用由荧光物质标记抗游离型PSA抗体而成的标记第一抗体，使用由DNA标记抗PSA抗体而成的第二抗体，进行利用了凝集素亲和性的微芯片毛细管电泳，基于凝集素对PSA的糖链的亲和性水平进行PSA分离，通过荧光检测器进行测定。
即，使含PSA的来自生物体的试样1～50μL与含有通常为0.001～10μM、优选为0.01～1μM的荧光标记抗游离型PSA抗体的试液反应。
毛细管电泳中使用的来自生物体的试样可以是从生物体采集的试样，也可以是得到脱盐、各种的纯化工序对从生物体采集的试样进行调制后的试样。
通过1～10psi、30～60秒的加压法，将得到的反应液、含有通常0.001～10μM、优选0.01～1μM的DNA标记抗PSA抗体的试液2～50μL、电泳用缓冲液和内标物(例如荧光物质：HiLyte647(AnaSpec公司制)等)导入例如内径5～500μm、优选50～200μm、更优选50～100μm、长度1～10cm的毛细管。在20～40℃保温下使反应进行5秒～30分钟、优选10秒～15分钟。在MAA(0.1mg/mL～20mg/mL)的存在下通过施加10秒～60分钟的1000～5000V的电压，进行电泳，来分离所得到的[荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体]的复合体和[荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体]的复合体。然后，利用荧光检测器、UV检测器等检测器测定复合体的电泳状态得到电泳图。
α(2,3)糖链游离型PSA的峰(包含[荧光标记抗游离型PSA抗体]-[α(2,3)糖链游离型PSA]-[DNA标记抗PSA抗体]的复合体)和其它的游离型PSA的峰(包含[荧光标记抗游离型PSA抗体]-[α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA]-[DNA标记抗PSA抗体]的复合体)能够根据它们的迁移位置来区分。鉴于此，试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量相当于其峰的峰面积。另外，将得到的α(2,3)糖链游离型PSA的峰面积和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的峰面积之和作为游离PSA量。
如上所述，如果使用毛细管电泳，能够以同一检体一次测定、确定游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA量。
α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率通过求出所得到的峰面积的比率(α(2,3)糖链游离型PSA的峰面积/游离型PSA量)而得到。
毛细管电泳使用市售的全自动测定装置进行即可。可举出例如μTASWako i30(ミュータスワコーi30)(产品型号，和光纯药工业(株)制)等。
作为亲和物质使用MAA，作为标记抗PSA抗体使用由荧光物质标记抗游离型PSA抗体而成的标记第一抗体，使用由DNA标记抗PSA抗体而成的第二抗体，使用全自动荧光免疫测定装置μTASWako i30(产品型号，和光纯药工业(株))，进行利用了凝集素亲和性的微芯片毛细管电泳，测定PSA。以下简要说明其原理。
首先，当使试样中的PSA与荧光标记抗游离型PSA抗体在液相中反应时，PSA与荧光标记抗游离型PSA抗体结合而形成[荧光标记抗游离型PSA抗体-游离型PSA]的复合体。
将含有该[荧光标记抗游离型PSA抗体-游离型PSA]复合体的溶液(电泳用试样A)注入到全自动荧光免疫测定装置μTASWako i30的专用芯片上的指定容池(免疫反应液容池)。其后，将电泳缓冲液2(R2容池)(含有MAA)、电泳缓冲液3(R3容池)、电泳缓冲液4(R4容池)、DNA标记抗体液(C1容池)以及荧光液(FD容池)也注入到专用芯片上的指定容池。
图3中示意性表示了专用芯片(微芯片)的示意图。
在图3中，废液(Waste)容池作为在将R2、R3、R4、C1以及电泳用试样A导入分析用流路过程中的废液罐(排液用容池)使用。
将电泳用试样A以及各试液注入到各个容池后，施加电压。如此一来，注入到C1容池的DNA标记抗PSA抗体按照等速电泳的原理，一边被浓缩一边移动至阳极方向。接下来，被浓缩的DNA标记抗PSA抗体与电泳用试样A中的[荧光标记抗游离型PSA抗体-游离型PSA]复合体结合，形成以下的复合体1以及复合体2。
复合体1
[荧光标记抗游离型PSA抗体]-[α(2,3)糖链游离型PSA]-[DNA标记抗PSA抗体]
复合体2
[荧光标记抗游离型PSA抗体]-[α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA]-[DNA标记抗PSA抗体]
进一步继续电泳的话，上述复合体1以及复合体2和游离的DNA标记抗PSA抗体进一步在阴离子的电荷作用下移动至阳极方向。未反应的荧光标记抗游离型PSA抗体因为没有与DNA标记PSA抗体结合而没有电荷，所以不朝阳极方向进一步移动。
接着，已移动至R2容池中注入的含MAA的电泳区域的复合体中，复合体1与区域中所含的MAA相互作用，复合体2不与MAA相互作用。
因此，因为复合体1一方比复合体2更晚被迁移，所以对于复合体1和复合体2而言，检出的来自荧光标记抗PSA抗体的荧光峰的出现位置不同。因此，根据峰的位置，能够分别知道复合体1的峰以及复合体2的峰。
各个峰的PSA量能通过求出各峰的峰面积而得到。
α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率通过求出所得到的峰面积的比率(α(2,3)糖链游离型PSA的峰面积/游离型PSA量)而得到。
在毛细管电泳法中，作为求出对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率的方法，可举出例如下面的方法，但并不限于此。
使用亲和物质和浓度已知的α(2,3)糖链游离型PSA标准物，在实施上述毛细管电泳的过程中，求出在该糖链与亲和物质的相互作用下电泳迁移率已发生偏移的复合体1([荧光标记抗游离型PSA抗体]-[α(2,3)糖链游离型PSA]-[DNA标记抗PSA抗体])的峰面积(测定值1)。
另行，通过不使用亲和物质而使用浓度已知的α(2,3)糖链游离型PSA标准物来实施上述毛细管电泳，由此求出复合体1([荧光标记抗游离型PSA抗体]-[α(2,3)糖链游离型PSA]-[DNA标记抗PSA抗体])的峰面积(测定值2)。
求出得到的测定值1相对于测定值2的比率(测定值1/测定值2)，将所得到的比率作为本方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率。
表面等离子体共振法
表面等离子体共振法是利用表面等离子体在金属/液体界面激发时发生的所谓的表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance＝SPR)的光学现象来解析生物体分子间的相互作用的分子间相互作用解析系统。表面等离子体共振法使用表面等离子体共振分光装置，作为SPR信号检出随着2分子间的结合和解离而在传感芯片表面产生的微量的质量变化。因为实时跟踪生物体分子间的相互作用，所以可得到生物体分子间的结合/解离快/慢的动力学信息。
作为表面等离子体共振法的代表性的分析系统是生物分子相互作用分析系统(BiacoreTM)法。生物分子相互作用分析系统法一般简称为生物分子相互作用分析系统(Biacore，ビアコア)。另外，称作“生物分子相互作用分析系统”的情况下，有时也指生物分子相互作用分析系统的分析系统中使用的生物分子相互作用分析系统设备。
通过表面等离子体共振法的测定只要按照附带的使用说明书在对该测定适合的条件下进行即可。
通过表面等离子体共振法实施本发明的判定方法，可举出例如下面的方法。
即，使抗PSA抗体固定化在传感芯片的表面。当检出光从传感芯片的背方以全反射的方式照射传感芯片的金薄膜与玻璃的分界面时，反射光的一部分出现反射强度降低的部分。该光的昏暗的部分呈现的角度依赖于传感芯片表面的溶剂的折射率。其次，使来自生物体的试样从表面等离子体共振分光装置的流路流到传感芯片的表面。一旦在金薄膜表面固定化的抗PSA抗体与从流路流来的来自生物体的试样所含的PSA分子结合，则在金薄膜表面固定化的分子的质量增加，溶剂的折射率变化。此时，反射光的昏暗部分根据质量变化相对应地发生位置偏移。反之，一旦分子彼此间解离，昏暗部分的位置从偏移后的位置返回。该偏移的角度代表传感芯片表面的质量变化。在表面等离子体共振法中，根据该角度变化，跟踪分子间结合/解离。基于所得到的结果，首先能够测定来自生物体的试样中的游离型PSA量。
然后，使含有亲和物质的溶液从表面等离子体共振分光装置的流路流到传感芯片的表面。一旦在金薄膜表面生成的“抗PSA抗体PSA的复合体”的PSA与从流路流来的亲和物质结合，因为溶剂的折射率同样地会变化，所以可同样地跟踪分子间的结合/解离。基于得到的结果，能测定来自生物体的试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量。
确定所得到的来自生物体的试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
作为通过表面等离子体共振法测定来自生物体的试样中的α(2,3)糖链游离型PSA相对于游离型PSA量的比率的方法，可举出例如下面的方法。
即，用α(2,3)糖链游离型PSA标准物预先制作了已知α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的基准液，使用一种以上的该基准液进行基于表面等离子体共振法的测定，得到各个传感图。然后，用待检试样同样地进行测定，得到传感图。通过比较用基准液得到的传感图与用待检试样得到的传感图，从而确定待检试样的α(2,3)糖链游离型PSA相对于游离型PSA量的比率。所用的基准液的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率使用的是后续进行Pca判定时作为指标的那样的数值。例如，使用该比率为25％、45％、50％的基准液即可。
该基准液的制作方法的示例如上所述。
作为求出表面等离子体共振法中对α(2,3)糖链游离型PSA量的捕集效率的方法，可举出例如下面的方法，但不限于此。
即，使亲和物质固定化在传感芯片的表面。接着，使含有已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物的试样从表面等离子体共振分光装置的流路流到传感芯片的表面。在以上操作期间，进行基于表面等离子体共振法的测定，得到传感图。确定传感图的峰的值(测定值1)。
另行，使含有与用于得到测定值1所用的试样相同浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物的试样从表面等离子体共振分光装置的流路流到已固定化有抗PSA抗体的传感芯片的表面。在以上操作期间，进行基于表面等离子体共振法的测定，得到传感图。确定传感图的峰的值(测定值2)。
需要说明的是，在通过该方法求出捕集效率的情况下，用于得到测定值2使用的抗PSA抗体需要考量解离常数等选择具有足够的与抗原的特异性以及亲和性的抗PSA抗体。
求出得到的测定值1相对于测定值2的比率(测定值1/测定值2)，将得到的比率作为本方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率。
微阵列法
由日本工业技术综合研究所糖链医工学研究中心等开发的凝集素微阵列法也能够用于本发明的判定法。
凝集素阵列(凝集素微阵列)是将拥有与特异性不同的数十种糖链结合性质的作为蛋白的凝集素以斑点状排列在载玻片上使其固定化后的阵列。另外，倏逝场(Evanescentfield)是指微弱的光从基板(载玻片)界面逸出的状态。使荧光标记过的糖蛋白与凝集素微阵列相互作用后，激发光照射载玻片而产生倏逝场。激发光到达的是距界面100nm～200nm左右，因为与凝集素结合的糖链存在的位置也在距界面100nm～200nm处，所以只有结合于凝集素阵列的糖链能发光。通过该技术，不进行洗涤操作，就能检出凝集素阵列的荧光。也可以不对糖蛋白进行荧光标记而使其与凝集素微阵列相互作用后，使与糖蛋白的核心蛋白相对应的抗体与荧光标记后的荧光抗体反应后，以与上述相同的方法进行检测荧光。
基于凝集素微阵列的测定按照例如微阵列方法和协议(MICROARRAY METHODS ANDPROTOCOLS)(CRC出版社),Robert S.Matson编,“第9章，凝集素微阵列(Chapter 9：LectinMicroarrays)”,Masao Yamada,p.141,2009中记载的方案来实施即可。
利用凝集素微阵列技术测定本发明的α(2,3)糖链游离型PSA量，确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率时，例如如下地进行即可。
制作固定化有作为本发明的亲和物质的凝集素和对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链以外的PSA的糖链有亲和性的复数种凝集素的微阵列。目标微阵列可依照例如Kuno A.et al.,Nat Methods.2005Nov,vol.2,No.11,pp.851-856中记载的方法来制作即可。或者也可以使用市售的微阵列(LecChipTM，GlycoTechnica Ltd.公司(グライコテクニカ(株))制)等。
将根据需要预处理过的来自生物体的试样和荧光标记抗游离型PSA抗体滴落至微阵列使其反应，在微阵列上形成[荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA-凝集素]的复合体。然后，用倏逝波激发荧光型扫描仪测定来自荧光标记抗游离型PSA抗体的荧光。使用已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物同样地进行测定，在得到的测定值的基础上通过定量值换算，求出试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量。
确定通过微阵列法测定的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于另行求出的游离型PSA的量的比率。
游离型PSA的量的测定方法如上述“(1)测定游离型PSA量的方法”中所述。
作为求出凝集素微阵列法中的对α(2,3)糖链游离型PSA量的捕集效率的方法，可举出例如下面的方法，但不限于此。
在固定化有对PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链有亲和性的凝集素的凝集素微阵列上，使含有已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物的试样与上述固相接触/反应。另一方面，回收未反应组分(含洗涤组分)，通过公知的PSA测定法测定该组分中残留的α(2,3)糖链游离型PSA浓度。
本方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率，能由以下公式求出。
[供于测定的α(2,3)糖链游离型PSA标准物的浓度－未反应组分(含洗涤组分)中的α(2,3)糖链游离型PSA的浓度]/供于测定的α(2,3)糖链游离型PSA标准物的浓度
ELISA
通过ELISA求出α(2,3)糖链游离型PSA量，作为确定α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的方法，可举出例如以下的[方法1]以及[方法2]。
[方法1]
使亲和物质固定化于固相。使含有PSA的试样与上述固相接触/反应。对固相进行洗涤处理后，使由可检出的标记物质对抗PSA抗体(也可以是抗游离型PSA抗体)进行标记而成的标记抗PSA抗体与固相接触/反应。通过洗涤等去除未反应的标记抗PSA抗体后，通过与标记抗PSA抗体的标记物质相对应的测定方法测定标记物质的量。基于得到的测定结果，进行基于常用方法的定量值换算，求出α(2,3)糖链游离型PSA量，所述常用方法中利用了用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物进行测定而得的结果。通过另行测定上述试样中的游离型PSA量的方法求出游离型PSA量。求出得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
在上述方法中，作为求出对α(2,3)糖链游离型PSA量的捕集效率的方法，可举出例如下面的方法，但不限于此。
在固定化有亲和物质的固相上，使已知浓度的含有α(2,3)糖链游离型PSA标准物的试样与上述固相接触/反应。另一方面，回收未反应组分(含洗涤组分)，通过公知的PSA测定法测定该组分中残留的α(2,3)糖链游离型PSA浓度。
本方法中的对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率能通过以下公式求出。
[供于测定的α(2,3)糖链游离型PSA标准物的浓度－未反应组分(含洗涤组分)中的α(2,3)糖链游离型PSA的浓度]/供于测定的α(2,3)糖链游离型PSA标准物的浓度
[方法2]
使与游离型PSA特异性结合的抗体固定化于固相。使含有PSA的试样与上述固相接触/反应。对固相进行洗涤处理后，使由可检出的标记物质对亲和物质进行标记而成的标记亲和物质与固相接触/反应。通过洗涤等去除未反应的标记亲和物质后，通过与标记亲和物质的标记物质相对应的方法测定标记物质。基于得到的测定结果，进行基于常用方法的定量值换算，求出α(2,3)糖链游离型PSA量，所述常用方法中利用了用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准物进行测定而得的结果。通过另行测定上述试样中的游离型PSA量的方法求出游离型PSA量。求出得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
使用质量分析装置的方法
用质量分析装置，能够解析试样中的成分的糖链结构。在本发明的判定方法中，用质量分析装置解析试样中的PSA的糖链结构，能够测定试样中的游离型PSA量、α(2,3)糖链游离型PSA量、以及α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量。然后，求出得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
也可以用质量分析装置求出游离型PSA量。另外，可以将用质量分析装置得到的α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的总和作为游离型PSA量。
(4)Pca判定方法
在实施本发明的Pca判定方法时，首先确定通过上述方法得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。然后，该比率低于40％的情况下，判定为不是Pca(Pca阴性)，或其可能性较低。
该比率高于40％的情况下，优选高于43.2％的情况下，判定为被检者是Pca(Pca阳性)或其可能性高。
另外，该比率高于47％的情况下，优选高于50％的情况下，判定为被检者是Pca且其恶性度高。
在此，“Pca的恶性度高”是指与分类为所谓的格里森评分在4+3以上的病例相当。
特别是，在传统的临床检查中，针对不容易根据血清PSA值判别是否是Pca的患者，例如针对总PSA值位于超过零的值～50ng/mL的患者，如果实施本发明的判定法，就能实施更详细的Pca判定。“超过0的值”表示测定总PSA情况下的总PSA值。由此，总PSA值测定不出来的情况下，不属于“超过零的值”。
进一步，通过对总PSA值位于4～20ng/mL的患者、特别是对总PSA值位于4～10ng/mL范围的所谓灰色区的患者实施本发明的判定方法，由此能够针对在作为以往的临床检查的检查项目的总PSA值的基础上进行判定的情况下无法判定是否是Pca的灰色区的患者，进行是否是Pca或其可能性是否高的判定，因此特别有效。
进一步，作为其他的判定方法，可举出下面的方法。
即，用α(2,3)糖链游离型PSA标准物预先制成已知α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的基准液，使用一种以上的该基准液，进行α(2,3)糖链游离型PSA量的测定。该过程中，作为基准液，使用α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率为例如25％、40％、50％的基准液。其后，使用待检试样，同样地通过上述方法进行α(2,3)糖链游离型PSA量的测定。然后，比较用基准液得到的测定结果和用待检试样的测定结果。
如果用待检试样得到的测定结果是比用25％的基准液得到的测定结果更低的值，以及如果是比用40％的基准液得到的测定结果更低的值，那么判定为Pca阴性。
如果用待检试样得到的测定结果是比用40％的基准液得到的测定结果更高的值，判定为是Pca或其可能性高。
进一步，如果用待检试样得到的测定结果是比用40％的基准液得到的测定结果更高的值但又比用50％的基准液得到的测定结果更低，那么判定为是Pca或其可能性高，但恶性度较低。如果用待检试样得到的测定结果是比用50％的基准液得到的测定结果更高的值，判定为是Pca且其恶性度高。
(5)来自生物体的试样
作为本发明的来自生物体的试样，可举出例如血液、血浆、血清、精液、膀胱洗涤物、尿、组织提取液、前列腺组织切片、前列腺组织生物体试样等、或者由它们制备的试样等。当中，优选举出的是血清、血浆等。
＜Pca判定用试剂盒＞
本发明的Pca判定用试剂盒，作为构成要件包括亲和物质。
亲和物质以及其构成要件的优选方式和具体实例，如上述本发明的前列腺癌的判定方法相关说明中所述。另外，这些试药的浓度等优选方式只要从通常在本领域使用的浓度范围内适当选择即可。
该试剂盒作为构成要件也可以进一步包含本发明的抗PSA抗体。
另外，这些试剂盒所含的试药中也可以包含该领域常用的试药类，例如可以包含作为缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白、盐类、表面活性剂等稳定剂、防腐剂等的、不妨碍共存试药等的稳定性又不妨碍α(2,3)糖链游离型PSA与亲和物质的反应的物质。而且其浓度只要从本领域常用的浓度范围内适当选择即可。
进一步，本发明的试剂盒中也可以包含用于使用本发明的Pca判定法的说明书等。该“说明书”是指以文字或图表等方式实质上记载有该方法中的特征/原理/操作步骤、判定步骤等的该试剂盒的操作说明书、附加文本、或公报(宣传册)等。
以下列举实施例等进一步详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。
实施例
实施例1PSA的分离测定以及比率的确定
(1)试样以及试液的制备
1)DNA标记抗PSA抗体的制备
按照图2所示步骤，制备了结合了DNA的PSA抗体Fab’片段。
即，首先，通过常用方法纯化在5'末端已导入NH2基的250bp的DNA片段(纯化的末端氨基化DNA)，其后，通过常用方法使该DNA片段中导入的NH2基与磺基琥珀酰亚胺基-4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB)连接体(具有琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基的连接体，碧雅诗公司(ピアス社)制)的琥珀酰亚胺基反应后，进行凝胶过滤处理，去除未反应的连接体，得到结合有连接体的250bpDNA片段。使得到的结合连接体的250bpDNA片段与按照常用方法预先用抗人PSA小鼠单克隆抗体PSA10(抗PSA单克隆抗体，克隆编号：PSA10、和光纯药工业(株)制(自制品))制备的抗PSA抗体PSA10Fab'片段反应。用DEAE色谱柱纯化得到的反应物，制备了结合有250bpDNA片段的抗PSA抗体PSA10Fab'片段(以下，简写为“DNA标记抗PSA抗体”。)。
需要说明的是，用的抗人PSA小鼠单克隆抗体(抗PSA单克隆抗体，克隆编号：PSA10)是对人PSA有亲和性的抗体，会结合于结合型PSA及游离型PSA两者。即该抗体会结合于α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA两者。
2)荧光标记抗游离型PSA抗体的制备
识别与抗PSA单克隆抗体PSA10不同的PSA的表位，通过常用方法处理仅与游离型PSA特异性结合的抗人PSA单克隆抗体PSA12(抗PSA单克隆抗体，克隆编号：PSA12、和光纯药工业(株)制(自制品))，得到了抗PSA抗体PSA12Fab'片段。通过常用方法向所得到的片段的氨基导入荧光物质HiLyte647(AnaSpec公司制)，得到了HiLyte647标记抗游离型PSA抗体PSA12Fab'片段(以下，简写为“荧光标记抗游离型PSA抗体”)。
(2)电泳(微芯片毛细管电泳)
用全自动荧光免疫测定装置μTASWako i30(和光纯药工业(株)制)，按照装置的操作说明书，通过以下所示步骤进行了微芯片毛细管电泳。
1)电泳用试样A的制备
按照非专利文献6的第2部分材料与方法(2.Materials and methods)(2.7Forcedexpression of FLAG-tag-fused S2,3 PSA，2.7 FLAG标签融合的S2,3 PSA的强制表达)中公开的方法，获得了重组游离型PSA(以下，简写为“r游离型PSA”)[包含重组α(2,3)糖链游离型PSA(以下，简写为“rα(2,3)糖链游离型PSA”)和重组α(2,6)糖链游离型PSA(以下，简写为“rα(2,6)糖链游离型PSA”)]。测定所获得的r游离型PSA溶液中的PSA浓度，通过PBS(-)(和光纯药工业(株)制)稀释，以成为1ng/mL PSA蛋白浓度的方式制备，得到了样品溶液。将得到的样品溶液2μL、通过上述(1)2)制备的1μM的荧光标记抗游离型PSA抗体1μL、以及电泳缓冲液1[含有5％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)丙三醇、150mM NaCl、0.01％BSA、75mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-HCl)、10mM MES，pH 7.5]7μL加入0.5mL试管，混合，制备了10μL的反应液。
需要说明的是，该反应液中的荧光标记抗游离型PSA抗体的最终浓度是100nM。
将通过上述反应得到的含有[荧光标记抗游离型PSA抗体-r游离型PSA]复合体的反应液(即含有[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,3)糖链游离型PSA]复合体和[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,6)糖链游离型PSA]复合体的溶液)(10μL)作为电泳用试样A。
2)电泳用试液的制备
制备了下述的各个试液。
·电泳缓冲液2(含MAA)
制备了含有4.5％(w/v)聚乙二醇(PEG8000)、3％(w/v)丙三醇、10mM NaCl、0.01％BSA的75mM Tris-HCl缓冲剂(pH 7.5)。制备向其中以最终浓度成为4mg/mL的方式添加/混合MAA(VECTOR公司制)后的物质，将其作为电泳缓冲液2。
·电泳缓冲液3
将含有2％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)丙三醇、0.01％BSA、125mMHEPES、75mM Tris-HCl的缓冲剂(没有pH调制)作为电泳缓冲液3。
·电泳缓冲液4
将含有2％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)丙三醇、0.01％BSA的75mM Tris-HCl缓冲剂(pH 7.5)作为电泳缓冲液4。
·DNA标记抗体液(含DNA标记抗PSA抗体)
制备含有通过上述(1)1)得到的DNA标记抗PSA抗体100nM的缓冲剂[含有2％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、0.5mM EDTA(2Na)、3％(w/v)丙三醇、50mM NaCl、0.01％BSA、75mMBisTris(1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)(pH6.0)]，将其作为DNA标记抗体液。
·荧光液
将含有30nM HiLyte647、20％(w/v)丙三醇的50mM BisTris(1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)(pH 6.0)作为荧光液。使用荧光液是为了调整位于测定装置(μTASWako i30)的检出部中的位置确认等。
3)电泳步骤
i)电泳用试样A以及电泳用试液的导入
将通过上述(2)1)制备的电泳用试样A 5.4μL注入到μTASWako i30专用微芯片的指定容池(SP容池)。然后，以下述方式将通过上述(2)2)制备的各个试液注入到该微芯片的各个容池。
·R2容池(R2(FLB)容池、R2(LB)容池)：每个中注入10.0μL的电泳缓冲液2；
·R3容池：注入10.0μL的电泳缓冲液3；
·R4容池：注入5.4μL的电泳缓冲液4；
·C1容池：注入3.0μL的DNA标记抗体液；
·FD容池：注入7.0μL的荧光液。
使用的微芯片的示意图如图3所示。
在图3中，废液容池作为将各个容池(R2、R3、R4、C1)的试液以及电泳用试样A导入分析用流路过程中的废液罐(排液用容池)使用。
然后，在各4个废液容池(排液用容池)间施加30秒钟、-5psi的压力，将电泳用试样A以及各个试液导入芯片的分析用流路。
ii)ITP(反应、浓缩、分离)/检出
将所使用的微芯片的芯片内流路示意化后表示于图4。在图4中，W表示废液容池。R3容池侧是阴极，R2(LB)容池侧是阳极。另外，在图4中，将电泳用试样A以及各个容池的试液的配置部分以颜色区分为点部分和白部分(无点的部分)来表示。
将电泳用试样A及各个试液导入芯片的分析用流路后，通过下面的方法进行PSA的分离及检出。
在图4的R3容池－R2(LB)容池之间施加4000V的电压，在30℃温度下，使试液中的DNA标记抗PSA抗体与电泳用试样A中的[荧光标记抗游离型PSA抗体-r游离型PSA]复合体接触，形成[荧光标记抗游离型PSA抗体-r游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体]的复合体，将其通过等速电泳(ITP)浓缩。等速电泳的泳动方向在图4中以“ITP”和虚线表示。
用于捕集游离型PSA的各个标记抗体的免疫反应时间是约200秒。
此处形成的复合体具体是[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,3)糖链游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体]的复合体(复合体1)和[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,6)糖链游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体]的复合体(复合体2)。
进行等速电泳直至R2(FLB)容池，利用电压变化来判断复合体已通过R2(FLB)容池，将阴极电极从R3切换至R2(FLB)。然后，进一步在检出部分(从R2(FLB)与R2(LB)的通道交叉部分起2cm下游的毛细管部分)，在MAA的存在下进行毛细管凝胶电泳(CE)直至[荧光标记抗游离型PSA抗体-r游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体]的复合体的峰被检出。进行CE的位置以及电泳的泳动方向在图4中以“CE”和虚线表示。
检出的进行方式是在635nm激光激发下通过光电二极管(富士胶片(株)制)随时间推移测定距R2(FLB)与R2(LB)的通道交叉部分起2cm下游的毛细管部分的荧光强度。
另外，使用不含MAA的电泳缓冲液2，除此以外，使用与上述相同的电泳用试样A以及电泳用试液以及测定装置，实行与上述相同的方法，进行了PSA的分离以及检出。
(3)结果
得到的电泳像(电泳图)示于图5。在图5中，纵轴和横轴分别表示荧光强度和迁移率(sec)。
另外，将使用不含MAA的电泳缓冲液2同样地进行检测而得到的电泳像(电泳图)以灰色的线(颜色浅的线)同时示于图5。另外，在该检测时出现的峰在图5中以“凝集素(-)”表示。
因为与MAA反应的[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,3)糖链游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体]复合体(复合体1)相比不与MAA反应的[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,6)糖链游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体]复合体(复合体2)而言泳动更耗时，所以峰的出现较迟。即，复合体2的峰是在与“凝集素(-)”的峰相同的位置出现的峰，复合体1的峰是在复合体2的峰稍后出现的峰。
通过测定装置附带的解析用软件求出所得到的复合体1的组分峰面积以及复合体2的组分峰面积。
然后，使用所得到的复合体1的组分峰面积与复合体2的组分峰面积，计算试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)。
具体的算出方法如下。
·游离型PSA量(游离型PSA的总量)＝[复合体1的组分峰面积]+[复合体2的组分峰面积]
·α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)＝[复合体1的组分的峰面积]/[游离型PSA量]×100
其结果，α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率是“49.9％”。
根据以上结果可以认定：在本实施例中，通过毛细管电泳能够分离测定复合体1(α(2,3)糖链游离型PSA量)和复合体2(α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA，在本实施例中为(α(2,6)糖链游离型PSA)，以及使用在该测定的基础上所得到的峰面积能够求出α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
实施例2捕集效率的确认
(1)含有rα(2,3)糖链游离型PSA或rα(2,6)糖链游离型PSA的电泳用试样A的制备
按照非专利文献6的第2部分材料与方法(2.Materials and methods)(2.7Forcedexpression of FLAG-tag-fused S2,3 PSA，2.7 FLAG标签融合的S2,3 PSA的强制表达)中公开的方法获得了r游离型PSA(包括rα(2,3)糖链游离型PSA和rα(2,6)糖链游离型PSA)。从所获得的r游离型PSA分离出rα(2,3)糖链游离型PSA和rα(2,6)糖链游离型PSA并纯化。分离并纯化的方法是，首先通过使用了对唾液酸基α2,3-半乳糖结构表现出高亲和性的ACG凝集素色谱柱(日本油厂株式会社(J-Oil Mills，J-オイルミルズ))的凝集素柱色谱法，分离出rα(2,3)糖链游离型PSA和rα(2,6)糖链游离型PSA。然后，进行凝胶过滤，分别纯化了rα(2,3)糖链游离型PSA以及rα(2,6)糖链游离型PSA。
最后以r游离型PSA(29μg)作为出发原料得到了1.3μg的rα(2,3)糖链游离型PSA和2.1μg的rα(2,6)糖链游离型PSA。
用PBS(-)(和光纯药工业(株)制)分别稀释所得到的rα(2,3)糖链游离型PSA和rα(2,6)糖链游离型PSA，以调整成1ng/mL PSA蛋白浓度，从而得到了样品溶液。将所得到的样品溶液各2μL、以实施例1的(1)2)的方法制备的1μM荧光标记抗游离型PSA抗体1μL、以及电泳缓冲液1[含有5％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)丙三醇、150mM NaCl、0.01％BSA、75mM Tris-HCl、10mM MES，pH 7.5]7μL加入0.5mL的试管进行混合，制备了各种10μL的反应液。
需要说明的是，核反应液中的荧光标记抗游离型PSA抗体的最终浓度是100nM。
将含有通过上述反应所得到的[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,3)糖链游离型PSA]复合体的反应液(10μL)作为含有rα(2,3)糖链游离型PSA的电泳用试样A。另外，将含有通过上述反应所得到的[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,6)糖链游离型PSA]复合体的反应液(10μL)作为含有rα(2,6)糖链游离型PSA的电泳用试样A。
(2)电泳(微芯片毛细管电泳)
使用在上述(1)中制备的含有rα(2,3)糖链游离型PSA的电泳用试样A或含有rα(2,6)糖链游离型PSA的电泳用试样A，除此以外，使用与实施例1中所用的相同的电泳用试液、测定装置等，使用与实施例1相同的试药以及测定装置等，以与实施例1相同的方法进行了微芯片毛细管电泳。
(3)结果
将得到的电泳像(电泳图)示于图6。在图6中，纵轴和横轴分别表示荧光强度和迁移率(sec)。
使用含有rα(2,3)糖链游离型PSA的电泳用试样A将所得到的结果以灰色的线(颜色浅的线)示于图6(1)。
另外，将使用含有rα(2,3)糖链游离型PSA的电泳用试样A和不含MAA的电泳缓冲液2同样地进行测定所得到的电泳像(电泳图)以黑线(深色的线)一并示于图6(1)。
将使用含有rα(2,6)糖链游离型PSA的电泳用试样A所得到的结果以灰色的线(颜色浅的线)示于图6(2)。
另外，将使用含有rα(2,6)糖链游离型PSA的电泳用试样A和不含MAA的电泳缓冲液2同样地进行测定所得到的电泳像(电泳图)以黑线(深色的线)一并示于图6(2)。
因为MAA与对MAA有亲和性的α(2,3)糖链游离型PSA的糖链结构即糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链之间产生相互作用，所以在使用了含有MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,3)糖链游离型PSA的电泳峰应当比使用了不含MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,3)糖链游离型PSA的电泳峰出现得更靠后。如根据图6(1)清楚所示的那样，确认了用了含有MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,3)糖链游离型PSA的电泳峰比使用了不含MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,6)糖链游离型PSA的电泳峰的出现位置推迟。
接着，在图6(1)的结果的基础上，通过装置附属的解析软件求出了得到的峰的面积。其结果是，在使用含有MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,3)糖链游离型PSA的峰面积几乎是在使用不含MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,3)糖链游离型PSA的峰面积的100％。
另一方面，因为α(2,6)糖链游离型PSA没有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链，所以不产生与MAA的相互作用。因此，使用含有MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,6)糖链游离型PSA的电泳峰应该出现在与不含MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,6)糖链游离型PSA的电泳峰相同的位置。如根据图6(2)清楚所示的那样，没有发现使用含有MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,6)糖链游离型PSA的电泳峰与使用不含MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,6)糖链游离型PSA的电泳峰在电泳峰位置上有变化。
接着，在以图6(2)的结果的基础上，通过装置附属的解析软件求出了得到的峰的面积。其结果是，使用含有MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(2,3)糖链游离型PSA的峰面积几乎是使用不含MAA的电泳缓冲液2的测定中得到的α(6,3)糖链游离型PSA的峰面积的100％。
根据以上结果确认了，在本测定体系中，基于“MAA与糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链”之间的相互作用进行的对α(2,3)糖链游离型PSA及α(6,3)糖链游离型PSA的捕集效率几乎是100％。换言之，清楚了，在本测定体系中能够没有损失地测定α(2,3)糖链游离型PSA量以及α(6,3)糖链游离型PSA量。
需要说明的是，本发明人等确认了在专利文献1所记载的α(2,3)糖链游离型PSA量的测定方法中对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率较低(小于80％)。
实施例3
(1)电泳用试样A的制备
通过PBS(-)(和光纯药工业(株)制)分别稀释实施例2中制备的rα(2,3)糖链游离型PSA和rα(2,6)糖链游离型PSA，调节成1.5ng/mL PSA蛋白浓度。其后，将通过得到的rα(2,6)糖链游离型PSA溶液来稀释rα(2,3)糖链游离型PSA溶液，得到了含有10％、20％、30％、40％或50％的rα(2,3)糖链游离型PSA的样品溶液。将该rα(2,3)糖链游离型PSA的含有率当作“理论值”。
将得到的样品溶液2μL、以实施例1的(1)2)的方法制备的1μM荧光标记抗游离型PSA抗体1μL、以及电泳缓冲液1[含有5％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)丙三醇、150mM NaCl、0.01％BSA、75mM Tris-HCl、10mM MES，pH 7.5]7μL加入到0.5mL试管中进行混合，制备了10μL的反应液。
将含有通过上述反应所得到的[荧光标记抗游离型PSA抗体-游离型PSA]复合体的反应液(即含有[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,3)糖链游离型PSA]复合体和[荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,6)糖链游离型PSA]复合体的溶液)(10μL)作为电泳用试样A。
需要说明的是，该反应液中的荧光标记抗游离型PSA抗体的最终浓度是100nM。
(2)电泳(微芯片毛细管电泳)
使用上述(1)中制备的电泳用试样A，除此以外，使用在实施例1中用过的相同的电泳用试液、测定装置等，以与实施例1相同的方法进行了微芯片毛细管电泳。
(3)比率的计算
在得到的电泳像(电泳图)的基础上，通过装置付属的解析用软件求出了复合体1([荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,3)糖链游离型PSA]复合体)的峰面积和复合体2([荧光标记抗游离型PSA抗体-rα(2,6)糖链游离型PSA]复合体)的峰面积。以下，有时将得到的值简单地记作“实测值”。
然后，在复合体1的组分的峰面积和复合体2的组分的峰面积的基础上，以与实施例1相同的计算方法求出了试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)。
(4)结果
结果示于图7。
图7(1)示出了在各个样品溶液的实测值的基础上算出的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)与使用的样品溶液的α(2,3)糖链游离型PSA的含有率(理论值)之间的关系。在图7(1)中，■代表各个样品溶液中的游离型PSA的蛋白浓度(fPSA)。使用的各个试样中的蛋白浓度全部是1.5ng/mL。◆代表在实测值的基础上算出的各个样品溶液的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)。
根据图7(1)，使用的样品溶液的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的理论值(α(2,3)PSA比例(％))与在实测值的基础上算出的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(α(2,3)PSA比例(％))几乎一致。例如，含有10％(理论值)的rα(2,3)糖链游离型PSA的样品溶液的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)，与理论值是10％相对应的在实测值的基础上算出的该比率也基本上是10％。
图7(2)示出了关于各个样品溶液的在上述(3)中得到的复合体1的组分的峰面积的实测值(■、峰面积)以及复合体2的组分的峰面积的实测值(◆、峰面积)与其样品溶液的理论值之间的关系。
复合体1的组分的峰面积反映α(2,3)糖链游离型PSA浓度，复合体2的组分峰面积反映α(2,6)糖链游离型PSA浓度。
例如，根据图7(2)，使用理论值(α(2,3)PSA比例)为10％的试样时，复合体1的组分的峰面积的实测值(■)是约2.7，复合体2的组分的峰面积的实测值(◆)是约24.2。根据以上结果，在实测值的基础上计算的话，
α(2,3)糖链游离型PSA浓度/游离型PSA浓度
＝复合体1的组分峰面积/(复合体1的组分的峰面积+复合体2的组分的峰面积)
＝2.7/(2.7+24.2)×100＝10.0％。
也就是说，在实测值的基础上算出的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率与理论值基本相同。
根据以上结果确认了，以本实施例的测定方法得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)与实际的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)基本上一致。
因此，确认了，通过实施本实施例的测定方法能得到正确的“α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)”。另外，确认了，α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,6)糖链游离型PSA的测定值表现出线性。该结果印证了本测定体系中对α(2,3)糖链游离型PSA的捕集效率几乎是100％。
实施例4使用来自Pca患者以及BPH患者的试样得到的比率间的比较
(1)电泳用试样A的制备
将从总PSA值为10.0ng/mL以下的22名前列腺癌(Pca)患者以及24名是非癌的前列腺肥大症(BPH)患者中采集的血清用作试样。进行前列腺活检确认了各个患者的组织病理学的诊断。患者的背景(年龄、PSA值(总PSA值)、病理组织学的恶性度分类以及临床病期)示于表1。
表1
将试样2μL、以实施例1(1)2)的方法制备的1μM荧光标记抗游离型PSA抗体1μL、以及电泳缓冲液1[含有5％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)丙三醇、150mM NaCl、0.01％BSA、75mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MES]7μL加入到0.5mL试管中进行混合，制备了10μL的反应液。
将含有通过上述反应所得到的[荧光标记抗游离型PSA抗体-游离型PSA]复合体的反应液(10μL)作为电泳用试样A。
(2)PSA的分离测定以及比率的确定
使用上述(1)中制备的电泳用试样A，除此以外，使用与在实施例1中用过的相同的电泳用试液、测定装置等，以与实施例1相同的方法进行了微芯片毛细管电泳。然后，以与实施例1相同的方法求出了各个试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
针对上述得到的值，在Pca患者与BPH患者间进行显著性差异检验(Manwhitney U-TEST，曼-惠特尼U检验)。
(3)结果
将得到的结果示于图8。
根据图8所清楚示出的那样，α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(α(2,3)PSA比例(％))在Pca患者与BPH患者间比较得出的P值是“P＜0.0001”。由此判定，来自Pca患者的试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率与来自BPH患者的试样的该比率相比，显著性地更高。
比较例1及2与现有判定方法的比较
(1)试样
使用了实施例4中用过的相同的试样。
(2)现有的判定项目的测定
使用作为体外诊断用医药品的Lumipulse Presto PSA(富士生物株式会社，FUJIREBIO INC.(株))按照试剂盒附带的使用说明书，求出了各个试样中的总PSA值(比较例1)。
另外，人类循环肿瘤生物标志物面板1选择试剂盒(Human Circulating CancerBioMarker Panel 1select试剂盒)(LUMINEX公司制)，按照试剂盒附带的使用说明书，求出各个试样中的游离型PSA值。
在得到的结果的基础上，求出各个试样的游离型PSA值相对于总PSA值的比率(比较例2)。
针对上述得到的各个值，在Pca患者与BPH患者间进行显著性差异检验(Manwhiteney U-TEST，曼-惠特尼U检验)。
(3)结果
将得到的结果以及实施例4中得到的结果一并示于图9的上图。
图9(1)上图表示在Pca患者与BPH患者间比较实施例4中得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(α(2,3)PSA比例)得出的结果(与图2相同)。
图9(2)上图在Pca患者与BPH患者间比较总PSA值(total PSA)得出的结果(比较例1)。
图9(3)上图表示在Pca患者与BPH患者间比较游离型PSA值相对于总PSA值的比率(％fPSA)得出的结果(比较例2)。
根据图9(1)(上图)所清楚示出的那样，在Pca患者与BPH患者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率得出的P值是“＜0.0001”(图9(1)上图)。另一方面，在Pca患者与BPH患者间比较总PSA值得出的结果是P值＝0.0289(图9(2)上图)。另外，在Pca患者与BPH患者间比较游离型PSA值相对于总PSA值的比率得出的结果是P值＝0.1458(图9(3)上图)。
根据以上结果断定，用本发明的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率判定Pca的方法，相对于使用现有的总PSA值或游离型PSA值相对于总PSA值的比率进行判定的方法而言，能进行更高准确度的Pca判定。
另外，在该结果的基础上进一步进行了基于相关运行特性曲线(RelativeOperating Characteristic curve，ROC曲线)的解析。结果一并示于图9的下图。
如根据图9(1)(下图)所清楚示出的那样，以本发明的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率判定Pca得出的结果是AUC(曲线下面积＝Area Under the Curve)＝0.8580(图9(1)下图)。另一方面，以现有的总PS值判定Pca得出的结果是AUC＝0.6875(图9(2)下图)。以现有的游离型PSA值相对于总PSA值的比率判定Pca得出的结果是AUC＝0.6275(图9(3)下图)。
也就是说，本发明的判定方法与现有的判定方法相比，在测定体系的灵敏度/特异度的方面表现得更优异。另外，因为上述结果是使用来自Pca判定是灰色区的试样中的总PSA值为10.0ng/mL以下的患者的试样所得到的，所以断定本发明的判定方法能以高于现有判定方法的准确度进行总PSA值在灰色区的患者的Pca判定。
实施例5临界值的检验
(1)电泳用试样A的制备
使用实施例4中使用的血清试样和来自示出总PSA值10～50ng/mL的43名患者(Pca阳性：26例；阴性：17例)的血清试样的总计来自89名的患者的血清试样，以与实施例4(1)相同的方法制备了电泳用试样A。
(2)PSA的分离测定以及比率的确定
使用上述(1)中制备的电泳用试样A，除此以外，使用与在实施例1中用过的相同的电泳用试液、测定装置等，以与实施例1相同的方法进行了微芯片毛细管电泳。然后，以与实施例1相同的方法求出了各个试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
(3)临界值的检验
在上述(2)中得到的结果的基础上，利用相关运行特性曲线(Relative OperatingCharacteristic curve，ROC曲线)进行了解析。结果示于图10。
接着，通过常用方法，画出与ROC曲线相接的具有45度角度的直线，求出与该直线的交点(图10中以箭头表示)的值，即“灵敏度-(1-特异度)”为最大的值。其结果，该值(α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率)是“43.1％”。
由此，在本实施例的检验中，在α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的基础上进行Pca判定时的临界值是“43.1％”(图10)。
实施例6与基于公知的临界值的判定的比较
(1)试样
在WO2014/057983号公报(专利文献3)中记载了，以其实施例2中记载的方法测定各个试样的荧光强度(MFI：Mean Fluorescence Intensity，平均荧光强度)，将该值作为各个试样的α(2,3)糖链游离型PSA量以及将用于Pca判定的临界值定为“荧光强度(MFI)＝1130”。但是，本发明人等以专利文献3的实施例2所记载的方法，测定本说明书的实施例4中使用的试样(共计46病例)的α(2,3)糖链游离型PSA量得出的结果即使是荧光强度(MFI)为1130以上，实际上也有阴性(BPH)的情况(假阳性)。也就是说意味着，如果通过α(2,3)糖链游离型PSA量判定Pca的话有可能产生假阳性的判定。
因此，尽管本发明人等进行上述测定得出的结果是阴性(BPH)，使用荧光强度(MFI)为高于专利文献3中设定的临界值“1130”的高值的5个检体的试样，探讨比较了本发明的判定方法与专利文献3所公开的公知的判定方法。
(2)α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的确定
使用上述(1)中选出的5个检体的试样，以与实施例4(1)相同的方法制备了电泳用试样A。
然后，使用上述中制备的电泳用试样A，除此以外，使用与在实施例1中用过的相同的电泳用试液、测定装置等，以与实施例1相同的方法进行了微芯片毛细管电泳。然后，以与实施例1相同的方法求出了各个试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。结果示于表2。
(3)α(2,3)糖链游离型PSA的测定
使用上述(1)的5个检体的试样，实施与专利文献3的实施例2中记载的方法相同的方法，测定α(2,3)糖链游离型PSA量(荧光强度(MFI))。结果一并示于表2。
(4)结果
在表2中，“比率”表示各个试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
在表2中，“MFI”表示以上述(3)方法测定各个试样的荧光强度(MFI)得出的结果。
表2
检体编号 比率 MFI
1 22.90％ 1166
2 29.90％ 1785
3 32.20％ 1235
4 30.90％ 1381
5 26.40％ 1190
专利文献3设定的以α(2,3)糖链游离型PSA量为指标判定Pca时的临界值，以荧光强度(MFI)计为1130。根据表2的结果可知，尽管作为本次测定对象的5个检体全部是阴性(BPH)，但是荧光强度(MFI)≥1130。因此，在专利文献3中记载的临界值的基础上判定Pca得出的结果，5个检体全部被判定为Pca(假阳性判定)。
而用实施例5中确定的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的临界值“43.1％”进行判定得出的结果，作为测定对象的5个检体的该比率全部小于该临界值，全部被判定为阴性。
根据以上结果断定，使用以本发明的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率作为指标的临界值的判定方法，相比于使用以公知的α(2,3)糖链游离型PSA量作为指标的临界值的判定方法而言，是一种能进行更高准确度的Pca判定的方法。
实施例7
(1)试样
使用从总PSA值为20.0ng/mL以下的28名前列腺癌(Pca)患者以及是非癌的28名前列腺肥大症(BPH)患者采集的血清作为试样。
需要说明的是，在此使用的试样是被判定为以现有的判定标志物总PSA测试以及游离型PSA相对于总PSA值的比率作为指标判定得出的结果是难以判定癌的试样。
(2)α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的确定
用上述(1)的试样，以与实施例4(1)相同的方法制备了电泳用试样A。
然后，使用上述中制备的电泳用试样A，除此以外，使用与在实施例1中用过的相同的电泳用试液、测定装置等，以与实施例1相同的方法进行了微芯片毛细管电泳。然后，以与实施例1相同的方法求出了各个试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
针对上述得到的值，在Pca患者与BPH患者间进行显著性差异检验(Manwhitney U-TEST，曼-惠特尼U检验)。
(3)结果
结果示于图11。
图11(1)示出各个试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(α(2,3)PSA比例(％))。
另外，在图11(1)的结果的基础上利用相关运行特性曲线(Relative OperatingCharacteristic curve，ROC曲线)进行了解析。结果示于图11(2)(是图11(2)(a))。
比较例3、4
(1)总PSA值的测定(比较例3)
使用实施例7中用过的相同的试样，使用作为体外诊断用医药品的LumipulsePresto PSA(富士生物株式会社，FUJIREBIO INC.(株))按照试剂盒附带的使用说明书，求出了各个试样中的总PSA值。另外，针对所得到的值，在Pca患者与BPH患者间进行了显著性差异检验(Manwhitney U-TEST，曼-惠特尼U检验)。
结果示于图12(1)。
另外，在得到的结果的基础上利用相关运行特性曲线(Relative OperatingCharacteristic curve，ROC曲线)进行了解析。结果一并示于图11(2)(图11(2)(c))。
(2)α(2,3)糖链游离型PSA的测定(比较例4)
使用实施例7中用过的相同的试样，实施与专利文献3(WO2014/057983)的实施例2中记载的方法相同的方法，测定了α(2,3)糖链游离型PSA量(荧光强度(MFI)。另外，针对所得到的值，在Pca患者与BPH患者间进行了显著性差异检验(Manwhitney U-TEST，曼-惠特尼U检验)。
结果一并示于图12(2)。
另外，在得到的结果的基础上，利用相关运行特性曲线(Relative OperatingCharacteristic curve，ROC曲线)进行了解析。结果一并示于图11(2)(图11(2)(b))。
(3)结果
1)ROC曲线解析的结果
将实施例7以及比较例3、4中得到的ROC曲线解析的结果一并示于图11(2)。
解析的结果是α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(实施例7、图11(2)(a))为AUC＝0.7423。另一方面，α(2,3)糖链游离型PSA量(比较例4、图11(2)(b))是AUC＝0.5344。总PSA量(比较例3、图11(2)(c))是AUC＝0.5064。
另外，将α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率＝40％作为前列腺癌判定中的临界值时的灵敏度是85.7％，特异度是46.4％。另一方面，作为公知的Pca标志物α(2,3)糖链游离型PSA量(b)和总PSA量(c)，达到85.7％的灵敏度时的特异度分别是17.9％和14.3％。
根据以上结果确认了，以α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率＝40％作为前列腺癌的判定中的临界值的本发明的前列腺癌的判定方法，即使是对于通常方法很难判定的病例，也比现有的判定方法具有更高的前列腺癌判定灵敏度及特异度，是优异的判定方法。
2)显著性差异检验的结果
如根据图11(1)所清楚示出的那样，在Pca患者与BPH患者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(α(2,3)PSA比例(％))得出的P值是“P＝0.0019”。由此判定，来自Pca患者的试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率与来自BPH患者的试样的该比率相比，显著性地更高。
另一方面，如根据图12所清楚示出的那样，没有发现总PSA量(图12(1))以及游离型α(2,3)游离型PSA量(图12(2))在Pca患者与BPH患者间有显著性差异。
根据以上结果还断定，以α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率＝40％作为临界值并在该值的基础上进行Pca判定的本发明的判定方法，相比于在总PSA值、α(2,3)糖链游离型PSA量的基础上进行判定的公知的方法，能够进行更高准确度的Pca判定。
实施例8
(1)电泳用试样A的制备
使用从103名前列腺癌(Pca)患者以及50名非癌者(被判定为不是前列腺癌的人。包括BPH患者。)采集的血清作为试样。进行前列腺活检确认了各个患者的组织病理学的诊断。患者的背景(年龄、总PSA值)示于表3。
表3
将试样2μL、以实施例1(1)2)的方法制备的1μM荧光标记抗游离型PSA抗体1μL、以及电泳缓冲液1[含有5％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)丙三醇、150mM NaCl、0.01％BSA、75mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MES]7μL加入到0.5mL试管中进行混合，制备了10μL的反应液。
将得到的反应液10μL作为电泳用试样A。
(2)PSA的分离测定以及比率的确定
使用上述(1)中制备的电泳用试样A，除此以外，使用与在实施例1中用过的相同的电泳用试液、测定装置等，以与实施例1相同的方法进行了微芯片毛细管电泳。然后，以与实施例1相同的方法求出了各个试样的、α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
(3)结果
针对上述得到的值，在Pca患者与非癌者间进行了显著性差异检验(ManwhitneyU-TEST，曼-惠特尼U检验)。得到的结果示于图13。
如根据图13所清楚示出的那样，在Pca患者与非癌者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(α(2,3)PSA比例(％))得出的P值是“P＜0.0001”。由此判定，来自Pca患者的试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率与来自非癌者的试样的该比率相比较，显著性地更高。
另外，在得到的该比率的基础上，进一步进行基于相关运行特性曲线(RelativeOperating Characteristic curve，ROC曲线)的解析。结果示于图14(图14(1))。
另外，在已经测定的总PSA值的基础上进行基于相关运行特性曲线(RelativeOperating Characteristic curve，ROC曲线)的解析。结果一并示于图14(图14(2))
图14的ROC曲线解析结果，通过本发明的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率判定Pca得出的结果是AUC(曲线下面积＝Area Under the Curve)＝0.851。另一方面，通过现有的总PS值判定Pca得出的结果是AUC＝0.658。
即，可知本发明的判定方法与现有的判定方法相比在测定体系的灵敏度/特异度方面更优异，本发明的判定方法是一种相对基于现有的总PSA量的判定方法而言具有更高诊断准确度的判定方法。
另外，图14的ROC曲线解析的结果是以α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率＝40％作为前列腺癌的判定中的临界值时的灵敏度为81.6％，特异度为76.0％。另一方面，在作为公知技术的用总PSA量的判定方法中，在达到81.6％的灵敏度时的特异度是46.0。根据以上结果确认了，以α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率＝40％作为前列腺癌的判定中的临界值的本发明的前列腺癌的判定方法，是一种相对现有的判定方法而言具有更高的前列腺癌判定灵敏度及特异度的优异的判定方法。
(4)临界值的检验
在上述(3)中得到的来自Pca患者的试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的结果的基础上，利用相关运行特性曲线(Relative OperatingCharacteristic curve，ROC曲线，图15)进行了解析。接着，如常用方法那样，画出与ROC曲线相接的具有45度角度的直线，求出与该直线的交点(在图15中以箭头表示)、即“灵敏度-(1-特异度)”为最大的值。其结果是该值(α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率)为“42.7％”。
由此，在本实施例的验证中，在α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的基础上进行Pca判定时的临界值是“42.7％”。
实施例9、比较例5前列腺癌的恶性度的判定
(1)试样
使用从根据术后的格里森评分(GS)判定确定了恶性度的36名前列腺癌(Pca)患者以及40名非癌者(被判定为不是前列腺癌的人。包含BPH患者。)采集的血清作为试样。通过前列腺活检确认了各个患者的组织病理学的诊断。患者的背景(年龄、总PSA值、格里森评分等)示于表4。
表4
(2)α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的确定(实施例9)
使用上述(1)的试样，以与实施例4(1)相同的方法制备了电泳用试样A。
然后，使用上述中制备的电泳用试样A，除此以外，使用与在实施例1中用过的相同的电泳用试液、测定装置等，以与实施例1相同的方法进行了微芯片毛细管电泳。然后，以与实施例1相同的方法求出了各个试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
结果示于图16(1)。
另外，在使用来自术后格里森评分为4+3(术后GS＝4+3)或比其更加恶性的患者的血清试样得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的基础上，进行基于相关运行特性曲线(Relative Operating Characteristic curve，ROC曲线)的解析。结果示于图17。
(2)总PSA值的测定(比较例5)
使用实施例9中用过的相同的试样，使用作为体外诊断用医药品的LumipulsePresto PSA(富士生物株式会社，FUJIREBIO INC.(株))按照试剂盒附带的使用说明书，求出各个试样中的总PSA值。
结果示于图16(2)。
(3)结果
图16(1)是示出来自非癌者以及Pca患者的试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的图。针对Pca患者，示出每个患者术后格里森评分(术后GS)的该比率。
图16(2)是示出来自非癌者以及Pca患者的试样的总PSA量的图。针对Pca患者，示出每个患者术后GS的该比率。
如根据图16(1)所清楚示出的那样，当以α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率为40％的值作为临界值的情况下，强烈地表现出非癌者的该比率比该临界值低而Pca患者的该比率比临界值高的趋势。由此表明，通过使用临界值40％能够良好的辨别判定Pca患者与非癌例。
接着，如根据基于ROC曲线的解析结果(图17)所清楚示出的那样，以本发明的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率判定Pca得出的结果是AUC＝0.921。另外，其灵敏度为91.3％、特异度为90.6％。
进一步，通过常用方法，画出与图17的ROC曲线相接的具有45度角度的直线，求出与该直线的交点(在图17中以箭头表示)的值即“灵敏度-(1-特异度)”为最大的值。其结果是该值(α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率)为“47.2％”。由此，在本实施例的验证中，在α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率的基础上判定Pca的恶性度时的临界值为“47.2％”(图17)。
进一步，在将α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率为47.2％的值作为临界值的情况下，如根据图16(1)的结果所清楚示出的那样，格里森评分为4+3(GS＝4+3)或在其以上的患者的该比率强烈表现出比临界高的趋势。也就是说，表现出良好的与基于术后格里森评分确定诊断的相关性。
另外，在GS＝3+4时的该比率具有比临界值40％更高却又比47.2％更低的趋势，能辨别为Pca但恶性度低的病例。
根据以上结果断定，将“α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率”＝“47.2％”作为恶性度判定的临界值，如果用该临界值“47.2％”来判定Pca的恶性度，就能够鉴别恶性度低的病例，进一步据此能避免多余的诊疗的可能性高。
另一方面，如根据图16(2)所清楚示出的那样，没有发现总PSA值与格里森评分的指标之间具有关联性。由此断定，用总PSA值作为指标不能进行Pca判定、Pca的恶性度判定。
实施例10、比较例6关于外国人试样的糖链多样性的影响
PSA的糖链被识别有共计19种类的结构，很显然非常富有多样性(非专利文献4)。另外，报道称在糖蛋白的糖链中具有基于人种的多样性(“关于基于遗传的表现型的胎盘型碱性磷酸酶分子的差异(遺伝的表現形に基づく胎盤型アルカリ性ホスファターゼ分子の差異について)”、佐藤松男、东京女子医科大学杂质,60(8),p.609-619,1990)。
由此预测，PSA的糖链根据患者背景的国家、地域、人种具有多样性。因此，该糖链多样性对PSA的测定以及Pca判定，有可能产生影响。
鉴于此，使用日本人以外的样品，实施以α(2,3)糖链游离型PSA量作为指标进行判定的公知的判定方法(WO2014/057983：专利文献3)和以本发明的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率作为指标的判定方法，对其结果进行了比较探讨。
(1)试样
使用从由加拿大圣约瑟夫医疗保健汉密尔顿(St.Joseph's HealthcareHamilton)的Pinthus博士的实验室提供的非日本人的总PSA值为20.0ng/mL以下的29名Pca患者以及10名非癌者(被判定为不是前列腺癌的人。包含BPH患者)采集的血清作为试样。
试样的PSA值(总PSA值)等示于下述表5。
表5
(2)PSA的分离测定以及比率的确定(实施例10)
使用上述(1)的试样，以与实施例4(1)相同的方法制备了电泳用试样A。
然后，使用上述中制备的电泳用试样A，除此以外，使用与在实施例1中用过的相同的电泳用试液、测定装置等，以与实施例1相同的方法进行了微芯片毛细管电泳。然后，以与实施例1相同的方法求出了各个试样的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率。
(3)α(2,3)糖链游离型PSA量的测定(比较例6)
使用上述(1)的试样，实施与专利文献3的实施例2中记载的方法相同的方法，测定了α(2,3)糖链游离型PSA量(荧光强度(MFI))。
(4)结果
结果示于图18。在图18中，图18(1)表示在Pca患者(Pca)与非癌者(non-Pca)间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(α(2,3)PSA比例)得出的结果(实施例10)。图18(2)表示在Pca患者(Pca)与非癌者(non-Pca)间比较α(2,3)糖链游离型PSA量(荧光强度(MFI))得出的结果(比较例6)。
在图18(1)及(2)中，箱线图的箱中的横线表示各个结果的中间值，这是常用方法。
进行Pca患者与非癌者间的显著性差异检验(Manwhiteney U-TEST，曼-惠特尼U检验)得到的结果是，在Pca患者与非癌者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率得到的P值为“0.0062”(实施例10，图18(1))。另一方面，在Pca患者与非癌者间比较α(2,3)糖链游离型PSA量得出的P值为“0.0818”(比较例6，图18(2))。
如根据图18(1)所清楚示出的那样，关于α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率，非癌者的该比率的中间值是小于40％(38％附近)。另一方面，Pca患者的该比率的中间值是远比40％更高的值(47％附近)。
根据以上结果断定，使用α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率＝40％作为临界值，在该值的基础上进行Pca判定的本发明的判定方法，相比于在α(2,3)糖链游离型PSA量的基础上进行判定的公知的方法而言，能够进行高准确度的Pca判定。另外断定，即使在使用预计会产生糖链多样性等有悬念的材料的外国人试样的情况下，如果实行本发明的判定方法，也能够进行高准确度的Pca判定。
另一方面，如根据图18(2)清楚所示的那样，可知用α(2,3)糖链游离型PSA量的临界值“1130”进行判定的情况下，非癌者的α(2,3)糖链游离型PSA量和Pca患者的α(2,3)糖链游离型PSA量都是远比临界值更高的值，不能进行正确的Pca判定。
实施例11基于表面等离子体共振法的判定
以与微芯片电泳不同的测定原理，以下述方法利用表面等离子体共振(SPR)技术，进行使用了其代表性的测定装置生物分子相互作用分析系统(BIACORETM)(GE生物(GEバイオ))的S2,3PSA含有比率测定。
(1)测定设备等
测定设备：生物分子相互作用分析系统(Biacore X)(GE健康英国公司(GEHealthcare UK Ltd.)制)
芯片：传感芯片CM5(Sensor Chip CM5，GE健康英国公司(GE Healthcare UKLtd.)制)
流动缓冲剂：HBS-EP缓冲剂(10mM HEPES,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P 20,pH7.4,GE健康英国公司(GE Healthcare UK Ltd.)制)
(2)样品溶液
将实施例2中纯化、制备的rα(2,3)糖链游离型PSA或rα(2,6)糖链游离型PSA分别调配成1000ng/mL PSA蛋白浓度。然后，以得到的rα(2,6)糖链游离型PSA溶液稀释rα(2,3)糖链游离型PSA溶液，得到了含有25％,45％,或55％的rα(2,3)糖链游离型PSA的样品溶液。将该rα(2,3)糖链游离型PSA的含有率作为“理论值”。
需要说明的是，rα(2,3)糖链游离型PSA以及rα(2,6)糖链游离型PSA带有FLAG标记的肽序列。
(3)LCA在传感芯片的固定化
使用胺偶联试剂盒(GE健康英国公司(GE Healthcare UK Ltd.)制)，将抗FLAG标记抗体(抗-FLAG M2单克隆抗体，西格玛公司制)固定化至传感芯片CM5(CM传感芯片、GE健康英国公司(GE Healthcare UK Ltd.)制)的传感芯片上。
(4)表面等离子体共振法的实施
用生物分子相互作用分析系统(Biacore X)(GE健康英国公司(GE Healthcare UKLtd.)制)进行以下的测定。
在温度20℃、流速10μL/min、结合时间10分钟的条件下缓慢输送上述(2)中制备的样品溶液100μL，流到固定化有抗标记(FLAG)抗体的传感芯片，进行在上述试样中以任意的比率包含的各个α(2,3)糖链游离型PSA以及α(2,6)糖链游离型PSA与抗FLAG标记抗体的反应。从刚刚送液后开始随时间推移测定信号(共振角的偏移)。
然后，在温度20℃、流速30μL/min、结合时间2分种的条件下缓慢输送含有15mg/mL的MAA的HBS-EP缓冲剂，流到经由抗FLAG标记FLAG抗体以任意的比率固定化有α(2,3)糖链游离型PSA以及α(2,6)糖链游离型PSA的传感芯片，检验传感芯片上的α(2,3)糖链游离型PSA具有的靶标糖链与MAA的相互作用。从刚刚送液后开始随时间推移测定信号(共振角的偏移)。
其后，进行180秒(解离时间)的只有HBS-EP缓冲剂的送液。
用生物分子相互作用分析系统(Biacore)专用解析软件BIA evaluation(版本4.1)对所得到的测定结果进行解析，得到了传感图。
(5)结果
将得到的传感图示于图19。
在图19中，横轴表示时间(s(秒))，纵轴表示信号强度(RU,共振单位(ResonanceUnit))。
另外，在图19中(1)表示使用含有55％的α(2,3)糖链游离型PSA的试样得到的结果，(2)表示使用含有45％的α(2,3)糖链游离型PSA的试样得到的结果，(3)表示使用含有25％的α(2,3)糖链游离型PSA的试样得到的结果。
根据图19可知，相对于使用含有与本发明中非癌相当的正常范围(25％)的α(2,3)糖链游离型PSA的试样得到的传感图，使用含有超过本发明的判定方法的临界值(40％)的“45％”以及“55％”的α(2,3)糖链游离型PSA的试样得到的传感图，响应显著性地变高。根据以上结果可知，基于表面等离子体共振法也能实行使用本发明的临界值(Pca判定的临界值40％、Pca恶性度判定的临界值47％)的判定方法。
工业上利用的可能性
本发明的Pca判定方法能够非侵袭式且简便地以高准确度判定(诊断、检查)Pca及其恶性度。特别对于以往难以判定的总PSA值位于灰色区的患者，能够以高诊断准确度判定是否是Pca或其可能性是否高。
另外，本发明的Pca判定方法因为能够判定Pca的恶性度，所以根据本发明的判定方法所得到的判定结果在设定其后的Pca的治療方针方面是重要的指针。

Claims (13)

1.一种前列腺癌的判定方法，其中，确定来自生物体的试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率，该比率为40％或高于40％时，判定为是前列腺癌或者是前列腺癌的可能性高，
所述PSA是指前列腺特异抗原，
所述α(2,3)糖链游离型PSA是指具有糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于从糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链的游离型前列腺特异抗原。
2.如权利要求1所述的判定方法，其中，测定来自生物体的试样中的游离型PSA量以及α(2,3)糖链游离型PSA量，确定所得到的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率，当该比率为40％或高于40％时，判定为是前列腺癌或者是前列腺癌的可能性高。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，来自生物体的试样中的总PSA值是大于0且在50ng/mL以下的值。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，来自生物体的试样中的总PSA值是4～10ng/mL。
5.如权利要求2所述的方法，其中，测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法是利用α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于从糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质之间的相互作用进行测定的方法，所述亲和物质是对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于从糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性的物质。
6.如权利要求5所述的方法，其中，利用α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于从糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质之间的相互作用进行测定的方法是，通过α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于从糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与该亲和物质之间的相互作用，生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，测定该复合体的量，基于该结果确定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法。
7.如权利要求5所述的方法，其中，利用α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于从糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与亲和物质之间的相互作用进行测定的方法是，通过α(2,3)糖链游离型PSA的糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于从糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链与该亲和物质之间的相互作用，生成α(2,3)糖链游离型PSA与该亲和物质的复合体后，不将该复合体以外的成分从体系内去除而测定该复合体的量，基于该结果确定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法。
8.如权利要求1、2或5所述的方法，其中，测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法是对α(2,3)糖链游离型PSA的捕捉效率为80％以上的测定方法。
9.如权利要求5所述的方法，其中，亲和物质是凝集素。
10.如权利要求9所述的方法，其中，凝集素是对糖链末端唾液酸残基以α(2,3)键结合于从糖链末端起的第二位的半乳糖残基的糖链具有亲和性的凝集素。
11.如权利要求9所述的方法，其中，凝集素是朝鲜槐凝集素MAA。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中，α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率为40％或高于40％时，判定为是前列腺癌或者是前列腺癌的可能性高，该比率为47％或高于47％时，判定为是前列腺癌的恶性度高的可能性高。
13.如权利要求2所述的方法，其中，测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法是毛细管电泳法、生物分子相互作用分析系统法、质量分析法或凝集素微阵列法。
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