JPWO2017130578A1 - 前立腺癌の判定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「生体由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量に対する糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型PSA量の比率を測定し、その比率が40%より高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、前立腺癌の判定方法。」
本発明に係る「結合型PSA」とは、一般に「結合型PSA」と呼ばれるPSA、すなわち「α1-アンチキモトリプシンやα2-マクログロブリンなどの結合タンパク質と結合して複合体を形成したPSA」をいう。
本発明のPcaの判定方法は、「生体由来試料(以下、単に「試料」ともいう。)中の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を測定し、その比率が40%より高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、前立腺癌の判定方法。」である。
1)試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法、又は
2)試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量をそれぞれ測定し、その総和を遊離型PSA量とする方法
が挙げられる。
遊離型PSA量を直接測定するには、公知の遊離型PSA量を測定する方法で測定すればよい。例えば、抗遊離型PSA抗体、又は抗PSA抗体と抗遊離型PSA抗体を用いた公知の免疫学的測定法等で測定すればよい。
上記方法としては、後記する「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」に記載された方法が挙げられる。
・試料中に混在する様々な糖鎖修飾異性体を有する遊離型PSAの中から、標的となる糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖(α2,3型シアリル糖鎖)を有する遊離型PSAを捕捉し、検出(測定)するための効率、又は
・試料中に混在する様々な糖鎖修飾異性体を有する遊離型PSAの中から、標的となる糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖(α2,3型シアリル糖鎖)を有する遊離型PSAを検出(測定)するための効率
をいう。
例えば
1)糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する物質(以下、「アフィニティー物質と略記する。」)を用い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と該アフィニティー物質との相互作用を利用してα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法、又は
2)アフィニティー物質を用いずにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法
が挙げられる。
上記の方法に用いられるアフィニティー物質とは、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する(結合する)物質である。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に特異的な親和性を有する(特異的に結合する)物質が好ましい。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する(結合する)が、それ以外の糖鎖(例えば糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖等)には親和性を有さない(結合しない)物質が特に好ましい。
本発明に係るアフィニティー物質として用いられるレクチンとしては、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する(結合する)レクチンが挙げられる。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に特異的な親和性を有する(特異的に結合する)レクチンが好ましい。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する(結合する)が、それ以外の糖鎖(例えば糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖等)には親和性を有さない(結合しない)レクチンが特に好ましい。
本発明に係るアフィニティー物質として用いられる抗体としては、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に特異的な親和性を有する(結合する)抗体が挙げられる。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に特異的な親和性を有する(特異的に結合する)抗体が好ましい。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する(結合する)が、それ以外の糖鎖(例えば糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖等)には親和性を有さない(結合しない)抗体が特に好ましい。
「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ−物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」が挙げられる。
1)生体由来試料と、標識物質で標識された糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第1抗体と、PSAに親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)必要に応じ、上記1)で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第1複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
1)生体由来試料と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有し、且つ標識物質で標識された第1抗体(アフィニティー物質)と、PSAに親和性を有する第2抗体とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体の複合体(第1複合体)と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)必要に応じ、上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第1複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
1)生体由来試料と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体(アフィニティー物質)と、PSAに親和性を有する第2抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第3抗体とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と第3抗体の複合体(第1複合体)と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体と第3抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)必要に応じ、上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第1複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程、
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された抗体(標識抗PSA抗体)と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、標識抗PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンの複合体(第1複合体)と、標識抗PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識抗PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体と、PSAに親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
・第1抗体及び第2抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第1抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第2抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第1抗体及び第2抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第1抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第2抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
・第1抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第2抗体が糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する抗体である。
・第1抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第2抗体が糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する抗体である。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、該抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンの複合体(第1複合体)と、該抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する第1抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する第1抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第2抗体(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体の複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体と、PSAに親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第3抗体(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と第3抗体の複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記2)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記3)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
・第1抗体及び第2抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第1抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第2抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第1抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第2抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第1抗体及び第2抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する第1抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第2抗体(アフィニティー物質)とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体の複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する第1抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第3抗体とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と第3抗体(アフィニティー物質)の複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、第1複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第1複合体の量と第2複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
上記方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80%以上であることが好ましい。
例えば質量分析装置を用いる方法が挙げられる。
また、該方法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率とは、「試料中に混在する様々な糖鎖修飾異性体を有する遊離型PSAタンパクの中から、標的となる糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖(α2,3型シアリル糖鎖)を有する遊離型PSを捕捉し、検出(測定)するための効率」をいう。
1)比率を測定する方法−1
本発明に係る「生体由来試料中の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの比率を決定する」方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
比率を測定する別の方法としては、本発明の判定方法に係る「生体由来試料中の遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」があげられる。
(i)「生体由来試料中の遊離型PSA量を測定し、またα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ−物質(レクチン又は抗体)との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法により、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」、
(ii)「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ−物質(レクチン又は抗体)との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法により、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の総和に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」、又は
(iii)「アフィニティー物質を用いずにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」
が挙げられる。
(i)’「生体由来試料中の遊離型PSA量を測定し、またα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ−物質(レクチン又は抗体)との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法する方法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」、又は
(ii)’「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ−物質(レクチン又は抗体)との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の総和に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」
が、より好ましい。
「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有するレクチンとの相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンとの複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法により、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の総和に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」
が、特に好ましい。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された抗体(標識抗PSA抗体)と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、標識抗PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンの複合体(第1複合体)と、標識抗PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識抗PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記3)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体と、PSAに親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記3)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
・第1抗体及び第2抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第1抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第2抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第1抗体及び第2抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第1抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第2抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記4)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
・第1抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第2抗体が糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する抗体である。
・第1抗体が遊離型PSAに特異的に結合する標識抗体であり、第2抗体が糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する抗体である。
[方法D]
1)生体由来試料と、標識物質で標識された糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第1抗体と、PSAに親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)必要に応じ、上記1)で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第1複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程、
4)予め求めた生体由来試料中の遊離型PSA量に対する上記3)で求めたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、該抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンの複合体(第1複合体)と、該抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記3)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する第1抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記4)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する第1抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン(アフィニティー物質)とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と該レクチンの複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記3)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第2抗体(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体の複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記3)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
1)生体由来試料と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有し、且つ標識物質で標識された第1抗体(アフィニティー物質)と、PSAに親和性を有する第2抗体とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体の複合体(第1複合体)と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)必要に応じ、上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第1複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程、
4)予め求めた生体由来試料中の遊離型PSA量に対する上記3)で求めたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体と、PSAに親和性を有する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第3抗体(アフィニティー物質)とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と第3抗体の複合体(第1複合体)と、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記2)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記3)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記3)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
・第1抗体及び第2抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第1抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第2抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第1抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第2抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第1抗体及び第2抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
1)生体由来試料と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有し且つ標識物質で標識された第1抗体(アフィニティー物質)と、PSAに親和性を有する第2抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第3抗体とを接触させて、標識第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と第3抗体の複合体(第1複合体)と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体と第3抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)必要に応じ、上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)該複合体を構成する標識第1抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第1複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程、
4)予め求めた生体由来試料中の遊離型PSA量に対する上記3)で求めたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する第1抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第2抗体(アフィニティー物質)とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体の複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記3)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
1)生体由来試料と、PSAに親和性を有する第1抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第2抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第3抗体とを接触させて、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第2抗体と第3抗体(アフィニティー物質)の複合体(第1複合体)と、第1抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第2抗体の複合体(第2複合体)を形成させる工程、
2)上記1)の工程で得られた第1複合体と第2複合体とを分離する工程、
3)上記2)の工程で分離した第1複合体の量及び第2複合体の量を測定する工程、
4)上記3)の工程で得られた第1複合体の量と第2複合体の量の和を求め、その和に対する上記3)の工程で得られた第1複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
キャピラリー電気泳動によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法としては、例えばまずPSAを含有する生体由来試料と、本発明に係る抗PSA抗体(好ましくは抗遊離型PSA抗体)を標識物質で標識した標識抗PSA抗体とを接触・反応させ、得られた反応液中の[標識抗PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体と[標識抗PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]複合体とを、アフィニティー物質の存在下でキャピラリー電気泳動を実施することにより分離し、[標識抗PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体1由来の標識物質の量、及び[標識抗PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]複合体2由来の標識物質の量を測定する。試料中の遊離型PSA量は、複合体1と複合体2の標識物質の量の和とする。そして、そして、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求める。
[蛍光標識抗遊離型PSA抗体]-[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]-[DNA標識抗PSA抗体]
[蛍光標識抗遊離型PSA抗体]-[α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]-[DNA標識抗PSA抗体]
表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモンが金属/液体界面で励起した場合に起こる、いわゆる表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance = SPR)の光学現象を利用して生体分子間の相互作用を解析する分子間相互作用解析システムである。表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモン共鳴分光装置を用いて、2分子間の結合と解離にともなってセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化をSPR シグナルとして検出する。生体分子間の相互作用をリアルタイムにモニターするので、生体分子間の結合・解離が早い・遅いというカイネティクス情報が得られる。
産業技術総合研究所糖鎖医工学研究センター等の開発したレクチンマイクロアレイ法も、本発明の判定法に用いることが出来る。
[測定に供したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の濃度−未反応画分(洗浄画分を含む)中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの濃度]/測定に供したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の濃度
ELISAによりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法としては、例えば以下の[方法1]及び[方法2]が挙げられる。
[方法1]
アフィニティー物質を固相に固定化する。PSAを含有する試料を上記固相と接触・反応させる。固相を洗浄処理した後、抗PSA抗体(抗遊離型PSA抗体でもよい。)を検出可能な標識物質で標識した標識抗PSA抗体を、固相と接触・反応させる。未反応の標識抗PSA抗体を洗浄等により除去した後、標識抗PSA抗体の標識物質に応じた測定方法で標識物質の量を測定する。得られた測定結果をもとに、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。別途上記した試料中の遊離型PSA量を測定する方法で遊離型PSA量を求める。得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求める。
[測定に供したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の濃度−未反応画分(洗浄画分を含む)中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの濃度]/測定に供したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の濃度
[方法2]
遊離型PSAに特異的に結合する抗体を固相に固定化する。PSAを含有する試料を、上記固相と接触・反応させる。固相を洗浄処理した後、アフィニティー物質を検出可能な標識物質で標識した標識アフィニティー物質を、固相と接触・反応させる。未反応の標識アフィニティー物質を洗浄等により除去した後、標識アフィニティー物質の標識物質に応じた方法で標識物質を測定する。得られた測定結果をもとに、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。別途上記した試料中の遊離型PSA量を測定する方法で遊離型PSA量を求める。得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求める。
質量分析装置を用いて、試料中の成分の糖鎖の構造を解析することが出来る。本発明の判定方法では、質量分析装置を用いて試料中のPSAの糖鎖の構造を解析し、試料中の遊離型PSA量、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定することが出来る。そして、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求める。
本発明のPcaの判定方法を実施するには、まず上記した方法により得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する。そしてその比率が40%より低い場合には、Pcaではない(Pca陰性)、またはその蓋然性は低い、と判定される。
被検試料を用いて得られた測定結果が、25%の基準液を用いて得られた測定結果、及び40%の基準液を用いて得られた測定結果より低い値であれば、Pca陰性と判定される。
本発明に係る生体由来試料としては、例えば血液、血漿、血清、精液、膀胱洗浄物、尿、組織抽出液、前立腺組織切片、前立腺組織生検試料等、あるいはこれらから調製されたもの等が挙げられる。中でも血清、血漿等が好ましいものとして挙げられる。
本発明に係るPca判定用キットは、アフィニティー物質を構成要件として含むものである。
(1)試料及び試液の調製
1)DNA標識抗PSA抗体の調製
図2に示した手順に従って、DNAが結合したPSA抗体Fab’フラグメントを調製した。
Anti PSAモノクローナル抗体 PSA10とは異なるPSAのエピトープを認識し、遊離型PSAのみと特異的に結合する抗ヒトPSAモノクローナル抗体 PSA12(Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA12、和光純薬工業(株)製(自製品))を常法により処理して、抗PSA抗体PSA12 Fab'フラグメントを得た。得られたフラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質HiLyte647(AnaSpec社製)を導入して、HiLyte647標識抗遊離型PSA抗体PSA12 Fab'フラグメント(以下、「蛍光標識抗遊離型PSA抗体」と略記する。)を得た。
全自動蛍光免疫測定装置ミュータスワコー i30(和光純薬工業(株)製)を用い、装置の取扱説明書に従い、以下に示した手順にてマイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。
非特許文献6の2. Materials and methods (2.7 Forced expression of FLAG-tag-fused S2,3PSA)に開示された方法に従ってリコンビナント遊離型PSA(以下、「r 遊離型PSA」と略記する。)[リコンビナントα(2, 3)糖鎖遊離型PSA(以下、「r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA」と略記する。)と、リコンビナントα(2, 6)糖鎖遊離型PSA(以下、「r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA」と略記する。)を含む。]を取得した。取得したr 遊離型PSA溶液中のPSA濃度を測定し、PBS(-)(和光純薬工業(株)製)で希釈して1ng/mL PSAタンパク質濃度となるように調製し、サンプル溶液を得た。得られたサンプル溶液を2μL、上記(1)2)で調製した1μM 蛍光標識抗遊離型PSA抗体を1μL、及び泳動緩衝液1[5% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3%(w/v) グリセロール、150mM NaCl、0.01% BSA、75mM Tris-HCl、10mM MESを含有する。pH 7.5] 7μLを0.5mLチューブに加えて混合して、10μLの反応液を調製した。
下記の各試液を調製した。
・泳動緩衝液2(MAA含有)
4.5% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG8000)、3%(w/v) グリセロール、10mM NaCl、0.01 % BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を調製した。これにMAA(VECTOR社製)を終濃度4mg/mLとなるように添加・混合したものを調製し、泳動緩衝液2とした。
・泳動緩衝液3
2% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3%(w/v) グリセロール、0.01 % BSA、125mM HEPES、75mM Tris-HClを含有するバッファー(pH調製なし)を、泳動緩衝液3とした。
・泳動緩衝液4
2% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3%(w/v) グリセロール、0.01 % BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、泳動緩衝液4とした。
・DNA標識抗体液(DNA標識抗PSA抗体含有)
上記(1)1)で得られたDNA標識抗PSA抗体 100nMを含有するバッファー[2% (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、0.5mM EDTA(2Na)、3%(w/v) グリセロール、50mM NaCl、0.01 % BSA、75mM BisTris(pH 6.0)を含有する。]を調製し、DNA標識抗体液とした。
・蛍光液
30nM HiLyte647、20%(w/v) グリセロールを含有する50mM BisTris(pH 6.0)を、蛍光液とした。蛍光液は測定装置(ミュータスワコー i30)の検出部での位置確認等の調整のために用いられる。
i)泳動用試料A及び泳動用試液の導入
上記(2)1)で調製した泳動用試料A 5.4μLを、ミュータスワコー i30専用マイクロチップの所定ウェル(SPウェル)に分注した。次いで、下記のように該マイクロチップの各ウェルに上記(2)2)で調製した各試液を分注した。
・R2ウェル(R2(FLB)ウェル、R2(LB)ウェル):泳動緩衝液2を10.0μLずつ、
・R3ウェル:泳動緩衝液3を10.0μL、
・R4ウェル:泳動緩衝液4を5.4μL、
・C1ウェル:DNA標識抗体液を3.0μL、
・FDウェル:蛍光液を7.0μL。
使用したマイクロチップのチップ内流路を模式化したものを図4に示す。
図4において、WはWasteウェルを示す。R3ウェル側が陰極、R2(LB)ウェル側が陽極になる。また、図4において、泳動用試料A及び各ウェルの試液の配置部分を点部分と白部分(点のない部分)とに色分けして示す。
得られた電気泳動像(エレクトロフェログラム)を図5に示す。図5において、縦軸は蛍光強度を、横軸は移動度(sec)をそれぞれ示す。
・遊離型PSA量(遊離型PSAの総量)=[複合体1の分画のピーク面積]+[複合体2の分画のピーク面積]
・遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率(%)=[複合体1の分画のピーク面積]/[遊離型PSA量]×100
(1)r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA又はr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Aの調製
非特許文献6の2. Materials and methods (2.7 Forced expression of FLAG-tag-fused S2,3PSA)に開示された方法に従ってr遊離型PSA(r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含む)を取得した。取得したr遊離型PSAから、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを分離精製した。分離精製の方法は、まずシアリルα2,3-ガラクトース構造に対して高い親和性を示すACGレクチンカラム((株)J-オイルミルズ)を用いたレクチンカラムクロマトグラフィーによりr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAとを分離した。次いでゲルろ過を行って、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAをそれぞれ精製した。
上記(1)で調製したr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料A、又はr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Aを用いる以外は、実施例1で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例1と同様の試薬及び測定装置等を用いて、実施例1と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。
得られた電気泳動像(エレクトロフェログラム)を図6に示す。図6において、縦軸は蛍光強度を、横軸は移動度(sec)をそれぞれ示す。
(1)泳動用試料Aの調製
実施例2で調製したr α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを、それぞれPBS(-)(和光純薬工業(株)製)で希釈して、1.5ng/mL PSAタンパク質濃度となるように調整した。次いで、得られたr α(2, 6)糖鎖遊離型PSA溶液でr α(2, 3)糖鎖遊離型PSA溶液を希釈して、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを10%, 20%, 30%, 40%, 又は50%含有するサンプル溶液を得た。このr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの含有率を「理論値」とする。
上記(1)で調製した泳動用試料Aを用いる以外は、実施例1で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例1と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。
得られた電気泳動像(エレクトロフェログラム)をもとに、複合体1([蛍光標識抗遊離型PSA抗体−r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体)のピーク面積と複合体2([蛍光標識抗遊離型PSA抗体−r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA]複合体)のピーク面積を、装置付属の解析用ソフトで求めた。得られた値を、以下、単に「実測値」と記載する場合がある。
結果を図7に示す。
α(2, 3)糖鎖遊離型PSA濃度/遊離型PSA濃度
=複合体1の画分のピーク面積/(複合体1の画分のピーク面積+複合体2の画分のピーク面積)
=2.7/(2.7+24.2)×100=10.0%
となった。すなわち、実測値をもとに算出した遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率は、理論値と殆ど同じになった。
(1)泳動用試料Aの調製
トータルPSA値が10.0 ng/mL以下であった前立腺癌(Pca)患者22名及び非癌である前立腺肥大症(BPH)患者24名から採取した血清を試料として用いた。各患者の組織病理学的診断は前立腺生検を行って確認した。患者の背景(年齢、PSA値(トータルPSA値)、病理組織学的悪性度分類及び臨床病期)を表1に示す。
上記(1)で調製した泳動用試料Aを用いる以外は、実施例1で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例1と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例1と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。
得られた結果を図8に示す。
(1)試料
実施例4で使用したものと同じ試料を用いた。
体外診断用医薬品であるルミパルスプレストPSA(富士レビオ(株))を用いてキット添付のプロトコルに従って、各試料中のトータルPSA値を求めた(比較例1)。
得られた結果及び、実施例4で得られた結果を図9の上図に併せて示す。
(1)泳動用試料Aの調製
実施例4で使用した血清試料と、トータルPSA値10〜50ng/mLを示す患者43名(Pca陽性;26例、陰性;17例)由来の血清試料の、計89名の患者由来の血清試料を用い、実施例4(1)と同様の方法で泳動用試料Aを調製した。
上記(1)で調製した泳動用試料Aを用いる以外は、実施例1で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例1と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例1と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。
上記(2)で得られた結果をもとに、Relative Operating Characteristic curve(ROC曲線)により解析を行った。結果を図10に示す。
(1)試料
WO2014/057983号パンフレット(特許文献3)には、その実施例2に記載の方法で各試料の蛍光強度(MFI:Mean Fluorescence Intensity)を測定し、その値を各試料のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量としたこと、Pca判定のためのカットオフ値を「蛍光強度(MFI)=1130」に定めたことが記載されている。しかし、本発明者等が特許文献3の実施例2に記載された方法で、本明細書の実施例4で使用した試料(計46症例)のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定した結果、蛍光強度(MFI)が1130以上であっても、実際には陰性(BPH)の場合があった(偽陽性)。すなわち、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量でPcaを判定すると、偽陽性の判定が生じる可能性があることが示唆された。
上記(1)で選択した5検体の試料を用い、実施例4(1)と同様の方法で泳動用試料Aを調製した。
上記(1)の5検体の試料を用い、特許文献3の実施例2に記載の方法と同様の方法を実施して、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量(蛍光強度(MFI))を測定した。結果を表2に併せて示す。
表2において、「比率」は、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を示す。
(1)試料
トータルPSA値が20.0 ng/mL以下であった、前立腺癌(Pca)患者28名及び非癌である前立腺肥大症(BPH)患者28名から採取した血清を、試料として用いた。
上記(1)の試料を用い、実施例4(1)と同様の方法で泳動用試料Aを調製した。
結果を図11に示す。
(1)トータルPSA値の測定(比較例3)
実施例7で使用したものと同じ試料を用い、体外診断用医薬品であるルミパルスプレストPSA(富士レビオ(株))を用いてキット添付のプロトコルに従って、各試料中のトータルPSA値を求めた。また、得られた値について、Pca患者とBPH患者間で有意差検定(Manwhitney U-TEST)を行った。
実施例7で使用したものと同じ試料を用い、特許文献3(WO2014/057983)の実施例2に記載の方法と同様の方法を実施して、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量(蛍光強度(MFI)を測定した。また、得られた値について、Pca患者とBPH患者間で有意差検定(Manwhitney U-TEST)を行った。
1)ROC曲線解析の結果
実施例7及び比較例3,4で得られたROC曲線解析の結果を図11(2)に併せて示す。
図11(1)から明らかな通り、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率(α(2,3) PSA ratio (%))をPca患者とBPH患者間で比較したP値は「P=0.0019」であった。よって、Pca患者由来試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率は、BPH患者由来試料の該比率と比較して有意に高いことが判った。
(1)泳動用試料Aの調製
前立腺癌(Pca)患者103名及び非癌者(前立腺癌ではないと判定された者。BPH患者を含む。)50名から採取した血清を試料として用いた。各患者の組織病理学的診断は前立腺生検を行って確認した。患者の背景(年齢、トータルPSA値)を表3に示す。
上記(1)で調製した泳動用試料Aを用いる以外は、実施例1で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例1と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例1と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。
上記で得られた値について、Pca患者と非癌者で有意差検定(Manwhitney U-TESTを行った。得られた結果を図13に示す。
図14のROC曲線解析の結果、本発明の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率でPcaを判定した結果、AUC(曲線下面積=Area Under the Curve)=0.851となった。一方、従来のトータルPS値でPcaを判定した結果、AUC=0.658であった
上記(3)で得られたPca患者由来試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率の結果をもとに、Relative Operating Characteristic curve(ROC曲線、図15)により解析を行った。次に、常法通り、ROC曲線に接する45度の角度をもつ直線を引き、その直線との交点(図15に矢印で示した)、すなわち「感度−(1−特異度)」が最大となる値を求めた。その結果、その値(遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率)は「42.7%」であった。
(1)試料
術後のグリーソンスコア(GS)判定により悪性度を確定した前立腺癌(Pca)患者36名、及び非癌者(前立腺癌ではないと判定された者。BPH患者を含む。)40名から採取した血清を試料として用いた。各患者の組織病理学的診断は前立腺生検を行って確認した。患者の背景(年齢、トータルPSA値、グリーソンスコア等)を表4に示す。
上記(1)の試料を用い、実施例4(1)と同様の方法で泳動用試料Aを調製した。
実施例9で使用したものと同じ試料を用い、体外診断用医薬品であるルミパルスプレストPSA(富士レビオ(株))を用いてキット添付のプロトコルに従って、各試料中のトータルPSA値を求めた。
図16(1)は、非癌者及びPca患者由来試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を示した図である。Pca患者については、術後グリーソンスコア(術後GS)ごとの該比率を示した。
PSAの糖鎖は、計19種類の構造が同定され、非常に多様性に富んでいることが明らかとなっている(非特許文献4)。また、糖タンパク質の糖鎖には、人種による多様性があることが報告されている(「遺伝的表現形に基づく胎盤型アルカリ性ホスファターゼ分子の差異について」、佐藤松男、東京女子医科大学雑誌、60(8)、p.609-619、1990)。
カナダSt. Joseph's Healthcare HamiltonのDr. Pinthusラボから提供された、非日本人であって、トータルPSA値が20.0 ng/mL以下である、Pca患者29名及び非癌者(前立腺癌ではないと判定された者。BPH患者を含む)10名から採取した血清を試料として用いた。
上記(1)の試料を用い、実施例4(1)と同様の方法で泳動用試料Aを調製した。
上記(1)の試料を用い、特許文献3の実施例2に記載の方法と同様の方法を実施して、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量(蛍光強度(MFI))を測定した。
結果を図18に示す。図18において、図18(1)は、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率(α(2,3)PSA ratio)を、Pca患者(Pca)と非癌者(non-Pca)間で比較した結果(実施例10)を示す。図18(2)は、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量(蛍光強度(MFI))を、Pca患者(Pca)と非癌者(non-Pca)間で比較した結果(比較例6)を示す。
マイクロチップ電気泳動とは異なる測定原理として、表面プラズモン共鳴(SPR)技術を利用し、その代表的な測定装置であるBIACORETM(GEバイオ)を用いたS2,3PSA含有比率測定を下記の方法で行った。
(1)測定機器等
測定機器: Biacore X (GE Healthcare UK Ltd.製)
チップ: Sensor Chip CM5 (GE Healthcare UK Ltd.製)
ランニングバッファー: HBS-EP バッファー(10mM HEPES, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005 % Surfactant P 20, pH7.4, GE Healthcare UK Ltd.製)
実施例2で精製し、調製したr α(2, 3)糖鎖遊離型PSA又はr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAが、それぞれ1000 ng/mL PSAタンパク質濃度となるように調製した。次いで、得られたr α(2, 6)糖鎖遊離型PSA溶液でr α(2, 3)糖鎖遊離型PSA溶液を希釈して、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを25%, 45%, 又は55%含有するサンプル溶液を得た。このr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの含有率を「理論値」とする。
アミンカップリングキット(GE Healthcare UK Ltd.製)を用いて、抗FLAGタグ抗体(ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody,シグマ社製)をSensor Chip CM5(CMセンサーチップ、GE Healthcare UK Ltd.製)のセンサーチップ上に固定化した。
以下の測定は、Biacore X (GE Healthcare UK Ltd.製)を用いて行った。
得られたセンサーグラムを図19に示す。
Claims (13)
- 生体由来試料中の遊離型前立腺特異抗原(以下、前立腺特異抗原を「PSA」と記載する。)量に対する糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型PSA(以下、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA」と記載する。)量の比率を決定し、その比率が40%又はそれより高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、前立腺癌の判定方法。
- 生体由来試料中の遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定し、その比率が40%又はそれより高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、請求項1に記載の判定方法。
- 生体由来試料中のトータルPSA値が0を超える値〜50 ng/mLである、請求項1又は2に記載の方法。
- 生体由来試料中のトータルPSA値が4〜10ng/mLである、請求項1又は2に記載の方法。
- α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する物質(以下、「アフィニティ−物質」と記載する。)との相互作用を利用して測定する方法である、請求項2に記載の方法。
- α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と、アフィニティ−物質との相互作用を利用して測定する方法が、 α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と該アフィニティ−物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を決定する方法である、請求項5に記載の方法。
- α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と、アフィニティ−物質との相互作用を利用して測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と該アフィニティ−物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を決定する方法である、請求項5に記載の方法。
- α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率が80%以上の測定方法である、請求項1,2又は5に記載の方法。
- アフィニティー物質がレクチンである、請求項5に記載の方法。
- レクチンが、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から2番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有するレクチンである、請求項9に記載の方法。
- レクチンがイヌエンジュレクチン(MAA)である、請求項9に記載の方法。
- 遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率が40%又はそれより高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定し、該比率が47%又はそれより高い場合に前立腺癌の悪性度が高い蓋然性が高いと判定する、請求項1又は2に記載の方法。
- α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、キャピラリー電気泳動法、ビアコア法、質量分析法、又はレクチンマイクロアレイ法である、請求項2に記載の方法。
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