JP7222501B2

JP7222501B2 - 末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法

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Publication number: JP7222501B2
Application number: JP2022545793A
Authority: JP
Inventors: 力大山; 徹米山; 和幸濱田
Original assignee: Hirosaki University NUC; System Instruments Co Ltd
Current assignee: Hirosaki University NUC; System Instruments Co Ltd
Priority date: 2021-03-18
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2023-02-15
Anticipated expiration: 2041-03-18
Also published as: WO2022195796A1; EP4119576A1; EP4119576A4; JPWO2022195796A1; US20240034811A1; US11987643B2

Description

本発明は、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法に関する。

前立腺癌のマーカーとして知られているＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ）の糖鎖は、２本鎖で末端にシアル酸がα２，６結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖と、末端のシアル酸が、α２，３結合でガラクトースに結合しているＮ型糖鎖が存在し、癌化に伴い、α２，６結合よりも、α２，３結合でガラクトースに結合する糖鎖が増加することが知られている（非特許文献１）。従って、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖を検出することは、前立腺癌の検出に有用である。

末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖を検出可能なプローブとして、イヌエンジュレクチン（ＭａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓＡｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ；ＭＡＡ）が知られており、シアル酸を含む糖鎖の検出のプローブとして用いられている（特許文献１）。また、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖を有する糖脂質を免疫原として、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖を認識するマウスモノクローナル抗体が報告されている（特許文献２）。

特許第４５１４９１９号特許第６３８１０３３号

ＴａｊｉｒｉＭ，ＯｈｙａｍａＣ，ＷａｄａＹ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８；１８：２－８

しかしながら、イヌエンジュレクチンは、原料となる植物由来の天然物であり、製品のロットによってその結合性が変化するため、これをプローブとして使用した腫瘍バイオマーカーの臨床応用は困難である。組み換えレクチンの開発も進められているが、実用化には至っていない。
また、癌化したＰＳＡの検出には、より高感度で、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖を認識する抗体が必要である。

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に高い結合性を有するモノクローナル抗体、及び、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法を提供することにある。

本発明者らは、Ｓｉａα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ－ＢＳＡを免疫原として、ウサギに免疫し、得られた陽性ウサギＢ細胞を単離し、シングルセルＰＣＲにより、抗体遺伝子を取得し、該抗体遺伝子を宿主細胞に導入することにより得られた、モノクローナル抗体が、高い結合性で、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に結合し、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に結合後、当該糖鎖から解離しないことを見出し、本発明を完成させた。
本発明は以下の態様を含む。

［１］末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合し、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に結合後、前記糖鎖から解離しない、モノクローナル抗体又はその抗体断片。
［２］末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖との解離定数が、３．０×１０^－８以下である、［１］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［３］末端にシアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖に結合しないか、又は、末端シアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖との解離定数が、９．０×１０^－５以上である、［１］又は［２］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［４］前記抗体又はその抗体断片の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［５］前記抗体又はその抗体断片のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［６］前記抗体又はその抗体断片のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［７］前記抗体又はその抗体断片のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、［６］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［８］前記抗体又はその抗体断片のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む、［７］に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片。
［９］［１］～［８］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法。

本発明によれば、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖（以下、α２，３糖鎖とも称する）に高い結合性を有するモノクローナル抗体、及び、α２，３糖鎖の測定方法を提供することができる。

実施例１で得られた抗体のα２，３糖鎖、及び、末端シアル酸残基がα２，６結合でガラクトースに結合した糖鎖（以下、α２，６糖鎖とも称する）に対する結合性を、ＥＬＩＳＡで確認した結果を示す。実施例２における、α２，６糖鎖を固定化したバイオセンサーに対するＮｏ．１４抗体のセンサーグラムの結果を示す。実施例２における、α２，３糖鎖を固定化したバイオセンサーに対するＮｏ．１４抗体のセンサーグラムの結果を示す。実施例２における、末端にシアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖（以下、ガラクトース結合糖鎖とも称する）を固定化したバイオセンサーに対するＮｏ．１４抗体のセンサーグラムの結果を示す。実施例２における、α２，６糖鎖を固定化したバイオセンサーに対するＮｏ．１９抗体のセンサーグラムの結果を示す。実施例２における、α２，３糖鎖を固定化したバイオセンサーに対するＮｏ．１９抗体のセンサーグラムの結果を示す。実施例２における、ガラクトース結合糖鎖を固定化したバイオセンサーに対するＮｏ．１９抗体のセンサーグラムの結果を示す。比較例１における、α２，６糖鎖を固定化したバイオセンサーに対するＨＹＢ４抗体のセンサーグラムの結果を示す。比較例１における、α２，３糖鎖を固定化したバイオセンサーに対するＨＹＢ４抗体のセンサーグラムの結果を示す。比較例１における、ガラクトース結合糖鎖を固定化したバイオセンサーに対するＨＹＢ４抗体のセンサーグラムの結果を示す。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
＜モノクローナル抗体及びその抗体断片＞
本明細書において「抗体」とは、天然に存在するか、遺伝子組換え技術によって産生される、全長の免疫グロブリン分子をいい、「抗体断片」とはかかる免疫グロブリン分子の抗原結合性の断片をいう。かかる抗体および抗体断片は、慣用技術を用いて作製することができる。抗体断片としては、Ｆ(ａｂ’)_２、Ｆ(ａｂ)_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質又は融合ペプチド、及び、α２，３糖鎖結合部位を含む、免疫グロブリン分子以外の修飾構造体等を挙げることができる。

本明細書において、抗体が「特異的に結合する」とは、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖とは異なる他の糖鎖に実質的に結合することなく、α２，３糖鎖に結合することを意味する。また、本明細書において、「α２，３糖鎖」は、「Ｓｉａα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ」とも称する。

本発明において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味し、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、抗原の特定のエピトープに対して1つの結合特異性及び親和性を示す抗体である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。

本明細書において使用する、抗体の「重鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションで全ての抗体分子に存在するポリペプチド鎖の２つのタイプのうち、より大きいほうを指す。本明細書において用いられる、抗体「軽鎖」は、その天然に存在するコンフォメーションで全ての抗体分子に存在するポリペプチド鎖の２つのタイプのうち、より小さいほうを指す。
ここで、相補性決定領域（ＣＤＲ）とは、重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域で構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、３つのＣＤＲと、ＣＤＲにより連結される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。

ＣＤＲを決定するための技術としては、限定はされないが、例えば、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，１９９１、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ）；及び（２）抗原－抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３，９２７－９４８，１９９７）を挙げることができる。これらのアプローチや、他のアプローチを組み合わせて用いてもよい。

本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、α２，３糖鎖に特異的に結合し、α２，３糖鎖に結合後、前記糖鎖から解離しない、モノクローナル抗体又はその抗体断片である。以下、本発明のモノクローナル抗体を、抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体とも称する。

本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体は、ヒト抗体であっても、非ヒト動物抗体であってもよい。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等が挙げられるが、ウサギモノクローナル抗体が抗原との結合性が高いため好ましい。

本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、α２，６糖鎖に結合しない、モノクローナル抗体又はその抗体断片であることが好ましい。
本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片の、α２，３糖鎖、α２，６糖鎖等の抗原との結合性は、解離定数（ＫＤ値）で表わすことができる。ＫＤの単位はＭであり、結合性が高いほどＫＤ値はより低くなる。

本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片のα２，３糖鎖とのＫＤ値は、３．０×１０^－８以下であることが好ましく、２．７×１０^－８以下であることがより好ましく、２．５×１０^－８以下であることがさらに好ましく、２．０×１０^－８以下であることが特に好ましい。

上記ＫＤ値は、例えば、抗原となる糖鎖を固定化したバイオセンサーを用いて算出することができる。具体的には、バイオセンサーに抗原となる糖鎖を固定させ、抗体溶液に浸漬して、抗体をバイオセンサーに固定化された抗原に結合させる。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液に浸漬し、バイオセンサーに結合する抗体数、又は、バイオセンサーから解離する抗体数の変化によって生じる波長シフトΔλの変化を計測し、抗体の濃度を変化させたときのセンサーグラムから、ＫＤ値を算出することができる。

本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に結合後、前記糖鎖から解離しない。本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、α２，３糖鎖に結合後、前記糖鎖から解離しないことは、前述した、バイオセンサーにより確認することができる。具体的には、バイオセンサーに固定化されたα２，３糖鎖に、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を結合させた後、前記糖鎖を含まない緩衝液に浸漬させて、前記糖鎖からの結合及び解離を示す反応プロファイルにより確認することができる。本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、バイオセンサーに固定化されたα２，３糖鎖に結合すると、前記糖鎖を含まない緩衝液に浸漬しても、バイオセンサーに固定化された、α２，３糖鎖から解離しない。一方、本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、バイオセンサーに固定化されたα２，３糖鎖以外の糖鎖、例えば、α２，６糖鎖には結合しても、前記糖鎖を含まない緩衝液に浸漬すると、バイオセンサーに固定化されたα２，６糖鎖から速やかに解離する。従って、α２，６糖鎖は、本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片に結合しても、α２，３糖鎖が存在すると、α２，３糖鎖と置換することになり、α２，６糖鎖に対するＫＤ値が低く、α２，３糖鎖に対するＫＤ値が高くても、本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、α２，３糖鎖に対して特異性が高くなる。

本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、ガラクトース結合糖鎖に結合しないか、又は、ガラクトース結合糖鎖に、ほぼ結合しないモノクローナル抗体又はその抗体断片であることが好ましい。ここで、ガラクトース結合糖鎖に、ほぼ結合しないモノクローナル抗体又はその抗体断片とは、例えば、ガラクトース結合糖鎖との解離定数（ＫＤ値）が、９．０×１０^－５以上であるモノクローナル抗体又はその抗体断片が挙げられる。

本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片は、公知の方法を用いて製造することができる。具体的には、まず、α２，３糖鎖とキャリアータンパク質とのコンジュゲートを免疫原として非ヒト動物に免疫し、免疫された非ヒト動物のリンパ球について、抗原との結合性をＥＬＩＳＡで確認し、α２，３糖鎖との結合性の高いリンパ球を選択する。免疫する非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等が挙げられる。次に、選択したリンパ球からからシングルセルＰＣＲ法で、抗体遺伝子を取得し、ＰＣＲ法により増幅する。ＰＣＲ増幅産物について、抗原との結合性をＥＬＩＳＡで確認する。α２，３糖鎖との結合性が高いＰＣＲ増幅産物を、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＫｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓ２９３）等の細胞にトランスフェクションし、分泌抗体が含まれる培養上清を回収し、回収サンプルについて、抗原との結合性をＥＬＩＳＡで確認し、α２，３糖鎖との結合性の高いクローンを得る。得られたクローンから抗体遺伝子を取得し、ベクターに挿入し、抗体産生細胞を得る。得られた抗体産生細胞を培養し、本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を製造することができる。

本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片としては、ＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む、抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体Ｎｏ．１４（以下、Ｎｏ．１４抗体とも称する）又はその抗体断片等が挙げられる。

前記抗体Ｎｏ．１４は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

また、本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片としては、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片等が挙げられる。

ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片としては、具体的には、ＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体Ｎｏ．１９（以下、Ｎｏ．１９抗体とも称する）又はその抗体断片等が挙げられる。

前記抗体Ｎｏ．１９は、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

上記配列番号１～１２で表されるアミノ酸配列を表１に示す。

上記配列番号１３～１６で表されるアミノ酸配列を表２に示す。

これらのＶＨのＣＤＲ１～ＣＤＲ３及びＶＬのＣＤＲ１～ＣＤＲ３を含む、本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、公知の遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。具体的には、ＶＨのＣＤＲ１～ＣＤＲ３及びＶＬのＣＤＲ１～ＣＤＲ３をそれぞれコードする遺伝子を、前記抗体のＦＲと前記抗体の定常領域をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して形質転換させることによって、前記抗体を発現する細胞を取得し、これを細胞培養することによって製造することができる。この調製に使用される細胞、ベクターの種類、細胞の種類、培養条件等は、当業者の技術的範囲内であり、適宜適切な条件を設定することができる。

前記ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換又は挿入され、かつ本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片と同様な特異性を有するモノクローナル抗体又はその抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に包含される。

欠失、置換、挿入及び／又は付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１３、４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、好ましくは１～数十個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、特に好ましくは１～５個である。

＜測定方法＞
本発明のα２，３糖鎖の測定方法は、本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる、α２，３糖鎖の測定方法である。本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる、α２，３糖鎖の測定方法としては、検体中のα２，３糖鎖と、本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片とを反応させた後、前記抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片に標識が結合した標識化抗体又は標識化抗体断片を添加し、α２，３糖鎖、前記抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片、及び前記標識化抗体又は標識化抗体断片からなる免疫複合体を生成させ、生成した前記免疫複合体中の標識量を測定する、検体中のα２，３糖鎖の免疫学的測定方法等が挙げられる。

本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる測定方法において、検体としては、ヒトをはじめとする動物の血清、血漿又は全血等の血液、リンパ液、組織液、髄液、体腔液、消化液、鼻水、涙液、汗及び尿等が挙げられる。また、前記検体は、対象から採取した検体そのものであっても、採取した検体に通常行われる希釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。また、検体は、前記測定方法の実施時に採取又は調製されたものでもよく、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。

前記免疫学的測定方法としては、前記標識化検出抗体の標識により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ(ＦＩＡ) 、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、電気化学発光イムノアッセイ等に分類され、これらのいずれも本発明の測定方法に用いることができるが、ＥＬＩＳＡが、簡便且つ迅速に検出対象を測定することができ好ましい。

上記免疫複合体を洗浄後、免疫複合体中の標識を測定することにより、検体中のα２，３糖鎖を測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡの場合、標識である酵素と当該酵素の基質とを反応させ、発色した生成物の吸光度を測定することにより、検体中のα２，３糖鎖を測定することができる（サンドイッチ法）。また、固体支持体に固定した本発明の抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片と検体中のα２，３糖鎖とを反応させた後、非標識抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体又はその抗体断片（一次抗体）を添加し、この非標識抗体又はその抗体断片に対する抗体（二次抗体）に酵素標識した標識化二次抗体をさらに添加し、当該二次抗体の標識を測定することにより、検体中のα２，３糖鎖を測定することもできる。また、当該二次抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンをビオチンと結合させて、当該二次抗体を酵素等で標識し、当該二次抗体の標識を測定することにより検体中のα２，３糖鎖を測定することもできる。

また、固体支持体に固定したα２，３糖鎖叉はα２，３糖鎖とＢＳＡ等の蛋白質とのコンジュゲートに、非標識抗α２，３糖鎖モノクローナ抗体又はその抗体断片（一次抗体）を添加して、固体支持体に、α２，３糖鎖と一次抗体とからなる免疫複合体を生成させた後、検体を添加し、さらに、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を標識化した二次抗体を添加し、当該標二次抗体の標識を測定することにより、検体中のα２，３糖鎖を測定することもできる（競合法）。

前記固体支持体としては、抗体又は抗体断片を安定に保持できるものであれば特に制限はない。固体支持体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。固体支持体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等が挙げられる。

前記標識としては、ＥＬＩＳＡでは、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ等の酵素と各酵素で発光物質に変化する発光基質、及びルシフェリン、エクオリン等の発光物質を用いることができる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子を標識として用いることもできる。

ＥＬＩＳＡにおいて、標識となる酵素の基質は、酵素がパーオキシダーゼの場合３、３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ(ＤＡＢ)、３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ(ＴＭＢ)、Ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ(ＯＰＤ)等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ(ｐＮＰＰ)等を用いることができる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されない。

［実施例１］
Ｓｉａα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ－ＢＳＡを免疫原として、ウサギ（ｓｌｃ：ＪＷ／ＣＳＫ、１３週齢）に免疫し、得られたウサギＢ細胞について、Ｓｉａα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃに結合する細胞（シングルセル）をＥＬＩＳＡ法により試験し、５６個の陽性クローンを選択した。選択された陽性クローンから、シングルセルＰＣＲにより、抗体遺伝子を取得した。得られた抗体遺伝子配列をヒト胎児腎細胞２９３（ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＫｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓ２９３）細胞にトランスフェクションし、培養上清に分泌された組み換えウサギ抗体について、α２，３糖鎖及びα２，６糖鎖との結合性を、以下のＥＬＩＳＡ法により確認し、α２，３糖鎖に結合性が高く、α２，６糖鎖に結合性が低い２個の抗体（Ｎｏ．１４、１９）を得た。図１に、これら２個の抗体のＥＬＩＳＡ試験の結果を示す。なお、対照として、上記において選択されなかった３つの抗体（Ｎｏ．２９、４１、３８）の結果も合わせて示す。

［α２，３糖鎖への結合性］
９６ｗｅｌｌプレートにＳｉａα２，３Ｇａｌ抗原ＢＳＡ－ＭＢＳ－ペプチド結合物（ＢＳＡ－ＭＢＳ－シアル酸α（２，３）β１，４ＧｌｃＮＡｃ）を１μｌ／ｍｌ（×２５００）で５０μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートし、抗原をプレートにウェル上に固定化した。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μｌ添加し、４℃で一晩振とうし、ブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、実施例１で得られた各クローンの培養上清を２倍希釈し、５０μｌ添加し、室温で１時間、振とうした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ａｎｔｉ－ＲａｂｂｉｔＩｇＧＨＲＰ（×１００００；ａｂ９７０８０、ａｂｃａｍ社製）５０μｌを添加し、室温で１時間、振とうした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＴＭＢ substrate solution（組成：３．３’，５．５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、カタログナンバー：Ｎ３０１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、５分間インキュベートした。次に、０．１ＮＨＣｌを１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

［α２，６糖鎖への結合性］
Ｓｉａα２，３Ｇａｌ抗原ＢＳＡ－ＭＢＳ－ペプチド結合物の代わりに、Ｓｉａα２，６Ｇａｌ抗原ＢＳＡ－ＭＢＳ－ペプチド結合物を用いる以外は上記と同様に行い、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

［実施例２］
実施例１で得られたＮｏ．１４抗体及びＮｏ．１９抗体のＫＤ値を以下のようにして算出した。
Ａｍｉｎｏｒｅａｃｔｉｖｅバイオセンサー（ＡＲ２Ｇ；ＦＯＲＴＥＢＩＯ社製）を超純水で親水化し、２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ－ＭＢＳ－シアル酸α（２，３）β１，４ＧｌｃＮＡｃ抗原溶液、又は、ＢＳＡ－ＭＢＳ－シアル酸α（２，６）β１，４ＧｌｃＮＡｃ抗原溶液に１０分間浸漬し、各抗原をセンサーに固定化した。ＥＤＣ－／ｓＮＨＳ溶液（組成：１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＦＯＲＴＥＢＩＯ社製）とｓｕｌｆｏ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＦＯＲＴＥＢＩＯ社製）とを１：１で混合）にセンサーを浸漬し、ブロッキングした。ＢＳＡ－ＭＢＳ－β１，４ＧｌｃＮＡｃ抗原固定化センサーは、ブロッキング後にシアリダーゼ溶液（組成：３μＬ α（２→３，６，８，９）ＮｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｆｒｏｍＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ（Ｎ３７８６－１ＳＥＴ、Ｓｉｇｍａ社製）＋４７μＬ１００ｍＭａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５））に３７℃、３時間浸漬し、シアル酸を遊離させて作製した。ＰＢＳで洗浄後、３０℃条件下で、３．７５から６０ｎＭの各抗体溶液中にバイオセンサーを３００秒間浸漬し、抗原への抗体の結合状態を測定した。その後、ＰＢＳに３００秒間浸漬し、抗原からの抗体の解離状態を測定した。バイオセンサーに結合する抗体、またはバイオセンサーから解離する抗体数の変化によって生じる波長シフトΔλの変化を、リアルタイムに計測し、Ｏｃｔｅｔシステム上（ＦＯＲＴＥＢＩＯ社製）で反応プロファイルを生成した。３．７５ｎＭから６０ｎＭの各濃度の抗体溶液中で得られた結合および解離のセンサーグラムから、ＫＤ値を算出した。算出されたＫＤ値を表３に示す。また、Ｎｏ．１４抗体、Ｎｏ．１９抗体の上記センサーグラムの結果を、それぞれ図２Ａ～図２Ｃ、図３Ａ～図３Ｃに示す。

［比較例１］
Ｎｏ．１４抗体及びＮｏ．１９抗体の代わりに、公知のマウス抗α２，３糖鎖モノクローナル抗体であるＨＹＢ４抗体（富士フィルム和光純薬社製）を用いる以外は、実施例２と同様にして、ＫＤ値を算出した。ＨＹＢ４抗体のＫＤ値の値を表３に、ＨＹＢ４抗体のセンサーグラムの結果を図４Ａ～図４Ｃに示す。

表３に示したように、Ｎｏ．１４抗体のα２，３糖鎖に対するＫＤ値は、２．７×１０^－８±３．９×１０^－９であり、α２，６糖鎖に対する解離定数ＫＤ値である、９．１×１０^－９±２．５×１０^－２４に対して、３３．７倍高い結果であったが、図２Ａに示すように、α２，６糖鎖へは、結合後速やかに解離するのに対し、α２，３糖鎖へは、図２Ｂに示すように、一度結合すると解離しないことが明らかとなった。また、図２Ｃに示すように、ガラクトース結合糖鎖への結合を認めなかった。従って、Ｎｏ．１４抗体に結合した、α２，６糖鎖は、α２，３糖鎖が存在すると、α２，３糖鎖と置換することになり、Ｎｏ．１４抗体は、α２，３糖鎖への結合性が高い抗体であることが明らかとなった。

また、Ｎｏ．１９抗体のα２，３糖鎖に対するＫＤ値は、１．６×１０^－８±１．９×１０^－１５であり、α２，６糖鎖に対するＫＤ値である、６．３×１０^－６±１．６×１０^－１９に対して、２５．４倍低い結果であった。また、図３Ｃに示すように、ガラクトース結合糖鎖への結合を認めなかった。さらに、Ｎｏ．１９抗体は、図３Ａに示すように、α２，６糖鎖へは、結合後速やかに解離するのに対し、α２，３糖鎖へは、図３Ｂに示すように、一度結合すると解離しないことが明らかとなった。これらの結果から、Ｎｏ．１９抗体は、α２，３糖鎖に結合性が高い抗体であることが明らかとなった。

それに対し、ＨＹＢ４抗体のα２，３糖鎖に対するＫＤ値は、８．６×１０^－６±１．６×１０^－４であり、Ｎｏ．１４抗体のＫＤ値の３１．４倍、Ｎｏ．１９抗体のＫＤ値の１８．６倍であった。また、ＨＹＢ４抗体は、図４Ｂに示すように、α２，３糖鎖に結合後、ＰＢＳに浸漬すると、α２，３糖鎖から速やかに解離した。
以上の結果から、ＨＹＢ４抗体は、Ｎｏ．１４抗体及びＮｏ．１９抗体と比較して、α２，３糖鎖への結合性は低いものであることが確認された。

本発明によれば、α２，３糖鎖に結合性の高いモノクローナル抗体又はその抗体断片、及びα２，３糖鎖の測定方法が提供される。

Claims

末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に結合し、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に結合後、前記糖鎖から解離しない、モノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片であって、
前記抗体又はその抗体断片の重鎖可変領域（以下、ＶＨとも称する）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲとも称する）１のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（以下、ＶＬとも称する）のＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片。
末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖との解離定数が、３．０×１０^－８以下である、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片。
末端にシアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖に結合しないか、又は、末端シアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖との解離定数が、９．０×１０^－５以上である、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片。
前記抗体又はその抗体断片のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片。
末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に特異的に結合し、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖に結合後、前記糖鎖から解離しない、モノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片であって、
前記抗体又はその抗体断片のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片。
末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖との解離定数が、３．０×１０ ^－８以下である、請求項５に記載のモノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片。
末端にシアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖に結合しないか、又は、末端シアル酸が結合していないガラクトースが結合した糖鎖との解離定数が、９．０×１０ ^－５以上である、請求項５又は６に記載のモノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片。
前記抗体又はその抗体断片のＶＨのアミノ酸配列が、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含み、ＶＬのアミノ酸配列が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む、請求項５～７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片。
請求項１～８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は前記抗体の抗原結合性を有するその抗体断片を用いる、末端シアル酸残基がα２，３結合でガラクトースに結合した糖鎖の測定方法。